干預(yù)IGF-I受體基因轉(zhuǎn)錄抑制肝癌細胞增殖的shRNA及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種干預(yù)IGF-I受體基因轉(zhuǎn)錄抑制肝癌細胞增殖的shRNA，包括以下三條shRNA模板序列IGF-IR-shRNA2、IGF-IR-shRNA3、IGF-IR-shRNA4中的任一條或一條以上。上述的shRNA能夠高效抑制IGF-IR基因轉(zhuǎn)錄，從而抑制肝癌細胞增殖，能夠?qū)Π邢蚧蚩拱┧幬镏委熅哂性雒糇饔?。本發(fā)明的shRNA能夠應(yīng)用于制備抗肝癌的藥物，具有很大的應(yīng)用前景和經(jīng)濟價值。
【專利說明】干預(yù)IGF-1受體基因轉(zhuǎn)錄抑制肝癌細胞增殖的shRNA及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)與生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種干預(yù)IGF-1受體基因轉(zhuǎn)錄抑制肝癌細胞增殖的shRNA及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]肝細胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，每年有超過60萬的新增肝癌患者，位列腫瘤相關(guān)死因的第三位。HCC的發(fā)生發(fā)展是多病因、多基因、多步驟及多因子協(xié)同的復(fù)雜過程，涉及到癌基因激活，抑癌基因失活及(或)胚胎期某些癌基因重新復(fù)活等多信號通路和基因調(diào)控。目前，手術(shù)切除或肝移植仍為治療首選方法，而索拉非尼是唯一能夠有效提高患者生存率的藥物，但對于索拉非尼治療無效，多數(shù)肝癌患者確診時已經(jīng)錯過手術(shù)最佳時期，現(xiàn)在尚無有效治療方法，因此，尋求新的有效治療進展期HCC的方法已成為探討前沿。
[0003]膜島素樣生長因子軸(Insulin-likegrowth factor axis, IGFs)被認為與 HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其是IGFs中的重要成員IGF-1受體(IGF-1R)所介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路至關(guān)重要。肝細胞惡性轉(zhuǎn)變和癌變過程中IGF-1R異常活化，過表達的IGF-1R既可作為肝癌早期診斷的標志，又可作為肝癌靶向治療的新靶點，具有開發(fā)與應(yīng)用前景。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的是提供一種具有開發(fā)與應(yīng)用前景、有效干預(yù)IGF-1受體基因轉(zhuǎn)錄抑制肝癌細胞增殖的shRNA及其應(yīng)用。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種干預(yù)IGF-1受體基因轉(zhuǎn)錄抑制肝癌細胞增殖的shRNA，包括以下三條shRNA模板序列中的任一條或一條以上:
[0006]IGF-1R-shRNA2:
[0007]正義鏈
[0008]5’ -CACCGCGTGAGAGGATTGAGTTTCTTTCAAGAGAAGAAACTCAATCCTCTCACGCTTTTTTG-3’，
[0009]反義鏈
[0010]5， -GATCCAAAAAAGCGTGAGAGGATTGAGTTTCTTCTCTTGAAAGAAACTCAATCCTCTCACGC-3，；
[0011]IGF-1R-shRNA3:
[0012]正義鏈
[0013]5， -CACCGCAAAGTCTTTGAGAATTTCCTTCAAGAGAGGAAATTCTCAAAGACTTTGCTTTTTTG-3，，
[0014]反義鏈
[0015]5’ -GATCCAAAAAAGCAAAGTCTTTGAGAATTTCCTCTCTTGAAGGAAATTCTCAAAGACTTTGC-3’ ；
[0016]IGF-1R-shRNA4: [0017]正義鏈
[0018]5， -CACCGGACAGATCCTGTGTTCTTCTTTCAAGAGAAGAAGAACACAGGATCTGTCCTTTTTTG-3，，[0019]反義鏈
[0020]5’ -GATCCAAAAAAGGACAGATCCTGTGTTCTTCTTCTCTTGAAAGAAGAACACAGGATCTGTCC-3’。
[0021]上述干預(yù)IGF-1受體基因轉(zhuǎn)錄抑制肝癌細胞增殖的shRNA用于制備抗肝癌的藥物。
[0022]本發(fā)明的shRNA 按照 Genbank 中人 IGF-1R Gene ID (3480),用 Ambion 公司 shRNA設(shè)計系統(tǒng)軟件設(shè)計4條靶向IGF-1R的shRNA，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司利用Ambion公司特定shRNA設(shè)計軟件設(shè)計并合成。將四條寡核苷酸鏈退火形成雙鏈的shRNA模板。通過分析得到:上述的shRNA模板能夠高效抑制人HCC Bel-7404、PLC/PRF/5細胞株IGF-1R基因轉(zhuǎn)錄，及IGF-1R蛋白表達；用CCK-8法分析得出上述的shRNA能夠明顯抑制肝癌細胞增殖，對靶向或抗癌藥物治療具有增敏作用；通過流式細胞儀檢測得出上述shRNA4干擾人肝癌Bel-7404及PLC/PRF/5細胞IGF-1R表達后通過促凋亡機制抑制肝癌細胞增殖，癌細胞發(fā)生的凋亡數(shù)明顯高于對照組及陰性組；通過細胞周期分析，上述shRNA使癌細胞發(fā)生G0/G1期阻滯以及抑制細胞周期中重要蛋白CyclinDl的表達；通過裸鼠體內(nèi)實驗得出上述shRNA干預(yù)IGF-1R基因的轉(zhuǎn)錄可顯著抑制肝癌的生長。
[0023]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果:
[0024]1、本發(fā)明的干預(yù)IGF-1受體基因轉(zhuǎn)錄抑制肝癌細胞增殖的shRNA能高效抑制IGF-1受體基因的表達，能夠?qū)Π邢蚧蚩拱┧幬镏委熅哂性雒糇饔谩?br>
[0025]2、本發(fā)明的干預(yù)IGF-1受體基因轉(zhuǎn)錄抑制肝癌細胞增殖的shRNA能有效抑制肝癌細胞的增殖。
[0026]3、本發(fā)明的shRNA序列對于開發(fā)新的抗肝癌藥物和提高肝癌的治療效果有重要的意義，其具有很大的開發(fā)與應(yīng)用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027]圖1為本發(fā)明一實施方式的步驟(3)中將重組干擾質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染至人肝癌Bel-7404細胞和PLC/PRF/5細胞的顯微鏡視圖；
[0028]圖2為步驟(5)~(7)中重組干擾質(zhì)粒對人肝癌Bel-7404及PLC/PRF/5細胞中IGF-1R的抑制效果圖；
[0029]圖3為步驟(8)中IGF-1R_shRNA4抑制細胞增殖、增加靶向或化療藥物敏感性的效果圖；
[0030]圖4為步驟(9)中Annexin V-PE/7-AAD雙染流式細胞儀檢測細胞的凋亡圖；
[0031]圖5為步驟(10)中IGF-1R_shRNA4轉(zhuǎn)染人肝癌細胞后，對癌細胞增殖周期的影響以及對細胞周期中重要蛋白CyclinDl表達的影響；
[0032]圖6為步驟(11)中移植瘤形成時間及下調(diào)IGF-1R蛋白抑制裸鼠肝癌生長曲線；
[0033]圖7為步驟(11)中裸鼠移植瘤實體、及移植瘤病理組織學(xué)檢查和IGF-1R免疫組織化學(xué)證實的結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0034]下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細的說明，但本發(fā)明的實施方式不限于此。[0035]下述內(nèi)容為本發(fā)明的干預(yù)IGF-1受體基因轉(zhuǎn)錄抑制肝癌細胞增殖的shRNA的設(shè)計及驗證步驟。
[0036](I)干擾序列設(shè)計
[0037]按照Genbank 中人 IGF-1R Gene ID (3480)，用 Ambion 公司 shRNA 設(shè)計系統(tǒng)軟件設(shè)計4條靶向IGF-1R的shRNA，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司利用Ambion公司特定shRNA設(shè)計軟件(design2.0)設(shè)計并合成。將四條寡核苷酸鏈(如表1所示)分別溶解于濃度為IOOyM的TE緩沖液(ρΗ=8.0)，取IOX shDNA退火溶液(由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供)5 μ L，正鏈寡核苷酸(表1，IOOnM) 5 μ L，反鏈寡核苷酸(表1，IOOnM) 5 μ L，雙蒸水定容至50 μ L得到退火反應(yīng)體系。加熱至95°C、5min，產(chǎn)物為10 μ M的shRNA，得到的shRNA4°C保存。另將所得shRNA溶液稀釋500倍用于連接反應(yīng)，終濃度為20nM。將陰性對照shRNA(表1中來自線蟲的正、反寡核苷酸序列作為Negative-shRNA)插入質(zhì)粒載體(pGPU/GFP/Neo)得到陰性重組質(zhì)粒，將四種shRNA分別插入同樣的質(zhì)粒載體得到重組干擾質(zhì)粒。四條寡核苷酸鏈及陰性對照shRNA的序列見表1。
[0038]表1 IGF-1R shRNA模板序列及陰性對照shRNA序列
[0039]
【權(quán)利要求】
1.干預(yù)IGF-1受體基因轉(zhuǎn)錄抑制肝癌細胞增殖的shRNA，其特征在于，包括以下三條shRNA模板序列中的任一條或一條以上:
IGF-1R-shRNA2: 正義鏈
5，-CACCGCGTGAGAGGATTGAGTTTCTTTCAAGAGAAGAAACTCAATCCTCTCACGCTTTTTTG-3，,
反義鏈
5，-GATCCAAAAAAGCGTGAGAGGATTGAGTTTCTTCTCTTGAAAGAAACTCAATCCTCTCACGC-3，；
IGF-1R-shRNA3: 正義鏈
5，-CACCGCAAAGTCTTTGAGAATTTCCTTCAAGAGAGGAAATTCTCAAAGACTTTGCTTTTTTG-3，,
反義鏈
5，-GATCCAAAAAAGCAAAGTCTTTGAGAATTTCCTCTCTTGAAGGAAATTCTCAAAGACTTTGC-3，；
IGF-1R-shRNA4: 正義鏈
5， -CACCGGACAGATCCTGTGTTCTTCTTTCAAGAGAAGAAGAACACAGGATCTGTCCTTTTTTG-3，,
反義鏈
5，-GATCCAAAAAA GGACAGATCCTGTGTTCTTCTTCTCTTGAAAGAAGAACACAGGATCTGTCC-3，。
2.干預(yù)IGF-1受體基因轉(zhuǎn)錄抑制肝癌細胞增殖的shRNA的應(yīng)用，其特征在于，用于制備抗肝癌的藥物。
【文檔編號】C12N15/113GK103805607SQ201410092891
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月13日
【發(fā)明者】姚登福, 嚴曉娣, 姚敏, 王理 申請人:南通大學(xué)附屬醫(yī)院