一種用于水稻干尖線蟲lamp快速檢測的引物組合物及其應(yīng)用的制作方法

一種用于水稻干尖線蟲lamp快速檢測的引物組合物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于水稻干尖線蟲LAMP快速檢測的引物組合物及其應(yīng)用。一種用于水稻干尖線蟲LAMP快速檢測的引物組合物，由以下引物組成：AB1-F3：SEQ?ID?NO.2，AB1-B3：SEQ?ID?NO.3，AB1-BIP：SEQ?ID?NO.4，AB1-FIP：SEQ?ID?NO.5，AB1-LF：SEQ?ID?NO.6。利用該引物組合物進(jìn)行水稻干尖線蟲的LAMP快速檢測，特異性強(qiáng)、靈敏度高，因此，本發(fā)明所述的引物組合物可在檢測和/或鑒定水稻干尖線蟲中應(yīng)用。
【專利說明】—種用于水稻干尖線蟲LAMP快速檢測的引物組合物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，涉及一種用于水稻干尖線蟲LAMP快速檢測的引物組合物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻干尖線蟲(Aphelenchoides besseyi)，又稱貝西滑刃線蟲，是水稻上重要的種傳外寄生線蟲，世界范圍內(nèi)各水稻產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生[1]，能引起水稻干尖或白尖病[2]。水稻干尖線蟲病于1915年在日本九州島發(fā)現(xiàn)[3]，大約20世紀(jì)40年代傳入中國，曾被列為中國對(duì)內(nèi)檢疫對(duì)象[4]，后因采取檢疫及種子處理等措施，該病害在80年代得到控制。但是近年來，該病害的發(fā)生范圍和危害程度在我國又開始加大，目前，廣東、廣西、湖南、湖北、浙江、江蘇、安徽、山東、河北、上海、遼寧、陜西、貴州、四川、云南、臺(tái)灣等地的主要稻區(qū)均有分布，局部地區(qū)發(fā)生和危害嚴(yán)重[5]。為了阻止水稻干尖線蟲病傳播范圍的不斷擴(kuò)大，對(duì)其進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地檢測鑒定尤為重要。
[0003]傳統(tǒng)的水稻干尖線蟲檢測方法，主要以形態(tài)學(xué)鑒定為主，但由于線蟲形態(tài)特征細(xì)微復(fù)雜，且常具有一定的變化，因此鑒定往往比較困難，需要專業(yè)人士操作，過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且需要大量線蟲樣本，在單條線蟲水平上難以準(zhǔn)確鑒定。近年來隨著分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，基于PCR的方法已經(jīng)成功用于檢測水稻干尖線蟲[6]，盡管以PCR為基礎(chǔ)的分子鑒定方法一定程度上克服了傳統(tǒng)形態(tài)鑒定上的缺陷，但由于檢測需要PCR儀、凝膠電泳和成像系統(tǒng)儀等昂貴的專業(yè)儀器設(shè)備，同時(shí)需要操作人員具有一定的分子生物學(xué)專業(yè)技能，并且只能在實(shí)驗(yàn)室條件下完成， 需要較長的時(shí)間，檢測過程復(fù)雜，不能滿足快速檢測的需求，限制了 PCR檢測方法在生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用。
[0004]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop- mediated isothermal amplification, LAMP)是Notomi等開發(fā)的一種恒溫?cái)U(kuò)增方法m，該方法針對(duì)靶基因的6個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)出4條引物，利用一種具有鏈?zhǔn)街脫Q活性的DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)，在恒溫條件下(60°C左右)保溫30 - 90分鐘，即可完成擴(kuò)增反應(yīng)。由于該反應(yīng)過程中產(chǎn)生焦磷酸鎂沉淀物，出現(xiàn)渾濁沉淀，因此用肉眼就判定擴(kuò)增結(jié)果，也可通過向其擴(kuò)增產(chǎn)物中添加熒光染料通過顏色變化來判斷，因此不需要專業(yè)的儀器設(shè)備，在普通水浴鍋中或者其他穩(wěn)定熱源即可完成，具有簡單、快速、高效、經(jīng)濟(jì)等特征。
[0005]憑借快速靈敏的優(yōu)越性，LAMP技術(shù)已在松材線蟲W (Bursaphelenchuhxylophilus)、南方根結(jié)線蟲[9] (Meloidogyne incognita)、象耳豆根結(jié)線蟲[10](Meloidogyne enterolobii)、香蕉穿孔線蟲[n] (Radopholus similis)等植物寄生線蟲快速檢測中得到了應(yīng)用，極大的提高了針對(duì)上述植物寄生線蟲的鑒定效率和準(zhǔn)確率，為進(jìn)一步采取適宜的防控措施控制其危害提供了便利，但目前在水稻干尖線蟲中尚無相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種用于水稻干尖線蟲LAMP快速檢測的引物組合物。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供該弓丨物組合物的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的又一目的是提供一種水稻干尖線蟲LAMP快速檢測方法。
[0009]本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0010]一種用于水稻干尖線蟲LAMP快速檢測的引物組合物，由以下引物組成:AB1_F3:SEQ ID N0.2,AB1-B3:SEQ ID N0.3,ABl-BIP:SEQ ID N0.4,ABl-FIP:SEQ ID N0.5,ABl-LF:SEQ ID N0.6。
[0011]本發(fā)明所述的引物組合物在檢測和/或鑒定水稻干尖線蟲中的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明所述的引物組合物在制備水稻干尖線蟲檢測和/或鑒定試劑中的應(yīng)用。
[0013]一種水稻干尖線蟲檢測試劑,包含本發(fā)明所述的引物組合物。
[0014]一種水稻干尖線蟲LAMP快速檢測方法，包括以下步驟:
[0015](1)提取待檢樣品DNA ；
[0016](2)以提取的DNA為模板，利用本發(fā)明所述的LAMP引物組合物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增；
[0017](3) LAMP擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束按照以下任意一種方式觀察結(jié)果:
[0018]I)向擴(kuò)增產(chǎn)物中加入顯色劑，輕晃混勻，即可觀察，擴(kuò)增產(chǎn)物具有綠色熒光，表明含有水稻干尖線蟲；
[0019]2)取擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳中電泳，EB染色，在紫外燈下觀測，擴(kuò)增產(chǎn)物呈梯形條帶，表明含有水稻干尖線蟲；
[0020]3)將反應(yīng)后的離心管3000rpm離心30sec，管底觀察到白色沉淀，表明含有水稻干尖線蟲。
[0021]其中，步驟(2)所述LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)體系優(yōu)選為25 μ 1，由
[0022]I)引物混合液:外引物ABl -F3和ABl - Β3各0.2 μ mol/L，內(nèi)引物ABl - FIP和ABl - BIP 各 0.8 μ mol/L,環(huán)引物 ABl - LF 為 0.4 μ mol/L ;
[0023]2)反應(yīng)混合液:0.8mmol/L dNTP, 20mmol/L Tris - HCl (ρΗ8.8)，10mmol/L KCl,5mmol/L MgCl2, lOmmol/L (NH4) 2S04,0.l%Triton x - 100，0.2mol/L 甜菜堿，8U Bst DNA 聚合酶大片段；
[0024]3) I μ I DNA 模板；
[0025]4)滅菌雙蒸餾水組成。其中各成分的濃度均表示在反應(yīng)體系中的終濃度。
[0026]步驟(2)所述LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)條件優(yōu)選:61~65°C保溫30~90min，85°C保溫IOmin0
[0027]所述的顯色劑優(yōu)選SYBR green I與PCR級(jí)DMSO以1:9體積比的混合物。
[0028]有益效果:
[0029]一、特異性強(qiáng)，所用的特異引物根據(jù)水稻干尖線蟲的28S6個(gè)不同區(qū)域設(shè)計(jì)出5條引物，特異性明顯強(qiáng)于常規(guī)PCR。
[0030]二、靈敏度高，對(duì)水稻干尖線蟲的檢測極限可達(dá)到1/10000條幼蟲水平，比常規(guī)PCR檢測水稻干尖線蟲的檢測靈敏度高100倍。
[0031]三、檢測用時(shí)短，I小時(shí)左右可獲得檢測結(jié)果，比常規(guī)PCR節(jié)省2 - 4h。
[0032]四、對(duì)儀器設(shè)備要求低，不需要任何PCR儀、凝膠電泳和成像系統(tǒng)，只需要一個(gè)水浴鍋或者保溫瓶就可以完成檢測。
[0033]五、操作簡單，結(jié)果容易辨別，通過不同顏色，肉眼即可觀察結(jié)果，不需要繁瑣的電泳和紫外觀察，一般技術(shù)人員即可完成檢測。
[0034]六、對(duì)人和環(huán)境友好，檢測過程不需要使用EB等有毒試劑，減少環(huán)境污染。
[0035]綜上所述，本發(fā)明具有比現(xiàn)有普通PCR技術(shù)檢測水稻干尖線蟲的方法具有更高的特異性、靈敏度和可操作性。該技術(shù)可應(yīng)用于對(duì)水稻干尖線蟲稻種檢驗(yàn)檢疫及田間植物上水稻干尖線蟲病發(fā)生的早期快速分子檢測，具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1為水稻干尖線蟲28S序列的LAMP引物設(shè)計(jì)示意圖。
[0037]圖2為水稻干尖線蟲LAMP方法檢測
[0038]A圖為加入熒光染料檢測結(jié)果，1:陽性結(jié)果，具有綠色熒光；2:陰性對(duì)照，為紅褐色；
[0039]B圖檢測結(jié)果為電泳圖，M:DL2000DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Takara) ；1:陽性結(jié)果，為LAMP擴(kuò)增梯形條帶；2:陰性對(duì)照，無擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0040]圖3為水稻干尖線蟲LAMP檢測方法特異性檢測結(jié)果圖
[0041]A為LAMP加熒光染料檢 測結(jié)果圖，I為陽性，2 - 12為陰性；
[0042]B為LAMP檢測結(jié)果電泳圖；
[0043]C為常規(guī)PCR檢測結(jié)果電泳圖；
[0044]上述各圖中1- 12泳道的DNA來源如表1所示。
[0045]圖4為水稻干尖線蟲靈敏度檢測結(jié)果
[0046]A 為 LAMP 加熒光染料檢測結(jié)果圖，1- 8 分別為:10_1、10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10 -7條線蟲DNA和陰性對(duì)照；
[0047]B為LAMP檢測結(jié)果電泳圖，M:DL2000DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Takara);1-8分別為:10_1、10-2UO-3、10 _ 4、10-5UO-6UO-7 條線蟲 DNA 和陰性對(duì)照；
[0048]C為普通PCR法檢測結(jié)果電泳圖，M:DL2000DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Takara) ；1 - 8分別%:10'1UO'2UO'3UO'4UO-5UO-6, UO-7 條線蟲 DNA 陰性對(duì)照。
[0049]圖5顏色判定種子調(diào)運(yùn)帶病稻粒中水稻干尖線蟲
[0050]1- 7為種子調(diào)運(yùn)帶病稻粒中的水稻干尖線蟲擴(kuò)增結(jié)果，呈現(xiàn)綠色，表明稻種中攜帶水稻干尖線蟲；8為陰性對(duì)照，顯紅褐色，表明不攜帶水稻干尖線蟲。
【具體實(shí)施方式】
[0051]下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0052]所述試劑均為市售，主要試劑:Taq DNA聚合酶、DNA marker購自TaKaRa公司；弓丨物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成；pGEM-T EasyVector購于美國promega ；ProteinaseK(蛋白酶K)購自Roche公司；Bst DNA聚合酶大片段購自New England Biolabs公司；SYBRgreen I 購自 Invitrogen 公司。
[0053]實(shí)施例1水稻干尖線蟲DNA的提取、rDNA28S擴(kuò)增及序列分析
[0054]1.1水稻干尖線蟲DNA的提取[0055]挑取單條水稻干尖線蟲或雌蟲放入含有8μ LddH2O和I μ LlO X PCRBuffer (Mg2+free)的0.2mL離心管中，放入液氮中冷凍Imin后，置于95°C下2min,重復(fù)4~5次；向PCR管中加入1 μ L10mg/ml蛋白酶K，然后將離心管在65°C下溫育90min，95°C反應(yīng)IOmin處理后上清液作為線蟲DNA模板直接用于LAMP和PCR反應(yīng)。
[0056]1.2水稻干尖線蟲rDNA28S擴(kuò)增及序列分析
[0057]采用28S 區(qū)的通用引物 D2A(5’ - ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG - 3’，SEQ ID N0.7)和 D3B(5’ - TCGGAAGGAACCAGCTACTA - 3’，SEQ ID N0.8)擴(kuò)增水稻干尖線蟲種群 rDNA28S區(qū)片段。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為 10XBuffer(Mg2+free)2y 1，10mmol/L dNTP2 μ 1，10mmol/LMgCl22 μ 1，引物 TW81 和 AB28(2.5ymol/L)各 2μ l，Taq 酶(5U/μ 1，Takara) 0.5 μ 1，模板DNA5y 1，滅菌ddH20補(bǔ)足至25 μ I。PCR擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性4min，94°C變性30sec,56°C退火30sec，72°C延伸lmin，40個(gè)循環(huán)；7°C再次延伸10min，4°C保存。PCR擴(kuò)增后，取5 μ I擴(kuò)增產(chǎn)物加I μ I加樣緩沖液在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，在紫外燈下觀察并拍照，回收、克隆和測序如SEQ ID N0.1，序列測定由上海英俊生物技術(shù)有限公司完成。
[0058]實(shí)施例2LAMP技術(shù)檢測水稻干尖線蟲方法的建立
[0059]2.1LAMP 引物設(shè)計(jì)
[0060]根據(jù)水稻干尖線蟲28S區(qū)擴(kuò)增后測序結(jié)果，設(shè)計(jì)并篩選下列LAMP引物(見圖1)，弓丨物交上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。引物序列如下:
[0061]①ABl - F3:5，- ATTCCGCAAGGTTGTCTAGG - 3，(SEQ ID N0.2)；
[0062]②ABl - B3:5，- CCGCAACCACAACTCACA - 3，(SEQ ID N0.3)；
[0063]③ABl-BIP:
[0064]5，- CGAGAATCCTGTGCGTTCGGAATTCACCCGCACTCCACA - 3，(SEQ ID N0.4)；
[0065]④AB 1-FIP:
[0066]5’ -AGCGACATCGACCCACTCGGAGTGTTGTTGTTGTGCTCGT - 3’ (SEQ ID N0.5)；
[0067]⑤ABl - LF:5，- CGCACGCAAATGCATCCA - 3，(SEQ ID N0.6)；
[0068]2.2LAMP反應(yīng)體系配置:
[0069]引物混合液:外引物ABl - F3和ABl - B3各0.2 μ mol/L,內(nèi)引物ABl - FIP和ABl -BIP 各 0.8 μ mol/L,環(huán)引物 ABl - LF 為 0.4 μ mol/L ;
[0070]反應(yīng)混合液:0.8mmol/L dNTP, 20mmol/L Tris - HCl (ρΗ8.8)，IOmmoI/L KCl,5mmol/L MgCl2, lOmmol/L (NH4) 2S04,0.l%Triton x - 100，0.2mol/L 甜菜堿，8U Bst DNA 聚合酶大片段，I μ IDNA模板，加滅菌雙蒸餾水補(bǔ)全到25 μ I。
[0071]2.3LAMP反應(yīng)擴(kuò)增條件:將以上混合液置于62°C恒溫水浴中等溫?cái)U(kuò)增60min，85°C保溫lOmin，反應(yīng)結(jié)束后加入2μ I配制好的顯色劑混勻后觀察結(jié)果(圖2Α)。取2μ I產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，在紫外燈下觀測并拍照，可看到有LAMP特征性梯形帶(圖2B)。
[0072]實(shí)施例3水稻干尖線蟲LAMP特異性檢測
[0073]收集水稻干尖線蟲，大連滑刃線蟲，單性滑刃線蟲，雙尾滑刃線蟲，腐爛莖線蟲,松材線蟲,擬松材線蟲，阿蘇里傘滑刃線蟲，南方根結(jié)線蟲，小麥孢囊線蟲，大豆孢囊線蟲，穿刺短體線蟲(見表1)，分別提取其DNA作為模板與水稻干尖線蟲DNA模板一起進(jìn)行LAMP檢測，以檢測水稻干尖線蟲LAMP檢測方法的特異性。同時(shí)以提取DNA為模板，以 SCAR 標(biāo)記特異性引物(BSF:5，- TCGATGAAGAACGCA GTGAATT - 3，(SEQ ID N0.9)，BSR:5’ - AGATCAAAAGCCAAT CGAATCAT - 3’ (SEQ ID N0.10))，進(jìn)行常規(guī) PCR 檢測，體系如下:10 X Buffer (Mg2+free) 2.5 μ I，IOmmoI/L dNTP2 μ I，IOmmoI/L MgCl22 μ I，引物 BSF 和BSR (2.5 μ mol/L)各 2 μ I，Taq 酶(5U/ μ I，Takara) 0.5 μ I，模板 DNAl μ I，滅菌 ddH20 補(bǔ)足至25 μ I，凝膠電泳觀察結(jié)果。
[0074]表1供試的全部植物線蟲群體樣品代碼及來源
[0075]
【權(quán)利要求】
1.一種用于水稻干尖線蟲LAMP快速檢測的引物組合物，其特征在于:由以下引物組成:
AB1-F3:SEQ ID N0.2，AB1-B3:SEQ ID N0.3, ABl-BIP:SEQ ID N0.4, ABl-FIP:SEQ IDN0.5 及 ABl-LF:SEQ ID N0.6。
2.權(quán)利要求1所述的引物組合物在檢測和/或鑒定水稻干尖線蟲中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的引物組合物在制備水稻干尖線蟲檢測和/或鑒定試劑中的應(yīng)用。
4.一種水稻干尖線蟲檢測試劑，其特征在于包含權(quán)利要求1所述的引物組合物。
5.一種水稻干尖線蟲LAMP快速檢測方法，其特征在于包括以下步驟: (1)提取待檢樣品DNA； (2)以提取的DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的LAMP引物組合物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增； (3)LAMP擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束按照以下任意一種方式觀察結(jié)果: 1)向擴(kuò)增產(chǎn)物中加入顯色劑，輕晃混勻，即可觀察，擴(kuò)增產(chǎn)物具有綠色熒光，表明含有水稻干尖線蟲； 2)取擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳中電泳，EB染色，在紫外燈下觀測，擴(kuò)增產(chǎn)物呈梯形條帶，表明含有水稻干尖線蟲； 3)將反應(yīng)后的離心管300 0rpm離心30sec，管底觀察到白色沉淀，表明含有水稻干尖線蟲。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于步驟(2)所述LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)體系為25 μ I,由 1)引物混合液:外引物AB1-F3和ΑΒ1-Β3各0.2 μ mol/L,內(nèi)引物ABl-FIP和ABl-BIP各 0.8 μ mol/L,環(huán)引物 ABl-LF 為 0.4 μ mol/L ；
2)反應(yīng)混合液:0.8mmol/L dNTP, 20mmol/L Tris-HCl (pH8.8)，IOmmoI/L KCl,5mmol/L MgCl2, lOmmol/L (NH4) 2S04,0.l%Triton x-100，0.2mol/L 甜菜堿，8U Bst DNA 聚合酶大片段；
3)I μ I DNA 模板； 4)滅菌雙蒸餾水組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于步驟(2)所述LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:61 ~65°C保溫 30 ~90min，85°C保溫 lOmin。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于所述的顯色劑為SYBRgreen I與PCR級(jí)DMSO以1:9體積比的混合物。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103805710SQ201410081273
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年3月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月6日
【發(fā)明者】王暄, 李紅梅, 顧建鋒, 魏洪巖 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)