轉基因水稻科豐2號外源插入基因和側翼水稻序列的連接區(qū)序列及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了轉基因水稻科豐2號外源插入基因和側翼水稻序列的連接區(qū)序列及應用。本發(fā)明通過Hi-TAIL?PCR獲得外源插入基因載體和其兩側5’端及3’端側翼水稻序列的連接區(qū)序列，其核苷酸為SEQ?ID?No.2所示；本發(fā)明進一步公開了外源插入載體和3’端側翼水稻序列的連接區(qū)序列，其核苷酸序列為SEQ?ID?No.13所示。本發(fā)明進一步公開了所述連接區(qū)序列作為靶基因應用于轉基因水稻科豐2號品系特異性的檢測。本發(fā)明為建立轉基因水稻科豐2號品系特異性PCR檢測方法奠定了基礎。
【專利說明】轉基因水稻科豐2號外源插入基因和側翼水稻序列的連接區(qū)序列及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及轉基因水稻的側翼序列，尤其涉及轉基因水稻科豐2號插入基因載體和側翼水稻序列的連接區(qū)序列及其應用，屬于轉基因水稻品系特異性的檢測領域。
【背景技術】
[0002]隨著轉基因植物的廣泛種植，轉基因食品的安全性問題也引起人們極大的關注，已有30多個國家相繼實施轉基因產品標識制度，包括中國。轉基因標識制度的實施依賴于對轉基因植物及其加工產品的成分檢測。PCR技術是目前國內外檢測轉基因產品中應用最廣泛的方法。在應用這種技術進行轉基因作物定性檢測時，根據(jù)其特異性，將其分為篩選檢測法、基因特異性方法、構建特異性方法和品系特異性方法。品系特異性檢測是通過檢測插入載體與植物基因組的連接區(qū)序列實現(xiàn)的，由于每一個轉基因植物品系，都具有特異的外源插入載體與植物基因組的連接區(qū)序列，和前三種方法比較，品系特異性具有更高的特異性和準確性，最適合做轉基因產品檢測。[0003]目前，已有部分專利和文獻報道了轉基因植物的品系特異性檢測方法。例如:張大兵等人于2006年建立了轉基因M0N863玉米的品系特異性檢測方法；謝家建等人建立了轉基因水稻克螟稻、Bt汕優(yōu)63、科豐6號和科豐8號等一系列品系特異性檢測方法；盧長明等人于2007年建立了一系列轉基因油菜的品系特異性檢測方法。但是，目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)任何關于轉基因水稻科豐2號的品系特異性PCR檢測方法。確定外源插入基因和側翼水稻序列的連接區(qū)序列是建立轉基因水稻科豐2號的品系特異性PCR檢測方法的前提。
【發(fā)明內容】
[0004]本發(fā)明的目的之一是獲取轉基因水稻科豐2號外源插入基因載體和側翼水稻序列的連接區(qū)序列；
[0005]本發(fā)明的目的之二是將獲取轉基因水稻科豐2號外源插入基因載體和側翼水稻序列的連接區(qū)序列作為靶基因應用于轉基因水稻科豐2號品系特異性的定性檢測。
[0006]本發(fā)明的上述目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的:
[0007]本發(fā)明根據(jù)轉基因水稻科豐2號品系中插入的目的基因為SCK基因(SEQ IDN0.1)通過H1-TAIL PCR獲得外源插入基因5’端水稻側翼序列和3’端水稻側翼序列，最終所獲得的含有SCK基因的外源插入基因載體及其兩側5’端和3’端側翼水稻序列的連接區(qū)核苷酸序列為SEQ ID N0.2所示；本發(fā)明進一步根據(jù)科豐2號外源插入載體和5’端水稻側翼序列形成的5段連接區(qū)序列設計了 5對轉化體引物，這5對轉化體引物雖然均能特異性地從科豐2號樣品中擴增出特異性片段，但是在華恢I號，抗優(yōu)97，遼粳371，M0N89788,H7-1等水稻品種也均有擴增條帶，所以采用這些連接區(qū)作為靶基因設計的特異性引物檢測的特異性不好。
[0008]本發(fā)明進一步根據(jù)科豐2號外源插入載體和3’端水稻側翼序列所形成的連接區(qū)核苷酸序列(SEQ ID N0.13)設計5對轉化體特異性引物，5對引物的核苷酸序列分別為SEQID N0.3-SEQ ID N0.12所示，應用常規(guī)的PCR反應條件，分別采用5對引物進行PCR擴增，設置2個重復；從擴增結果可見，這5對引物均能特異性地從科豐2號樣品中擴增出預期片段，但是用SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示的引物擴增的條帶最為清晰；SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示的引物是以SEQ ID N0.13所示的外源插入載體和3’端水稻側翼序列所形成的連接區(qū)核苷酸序列為靶基因所設計的一對特異性檢測引物，這說明以SEQ ID N0.13所示的連接區(qū)核苷酸序列能夠作為轉基因水稻科豐2號品系特異性檢測的靶基因，例如，以該靶基因設計檢測引物，能夠準確的對轉基因水稻科豐2號品系特異性進行定性檢測。
[0009]因此，本發(fā)明進一步將所獲取的轉基因水稻科豐2號外源插入基因和側翼水稻序列的連接區(qū)序列應用于轉基因水稻科豐2號的品系特異性的定性檢測，包括:(I)提取待檢測水稻樣品的DNA; (2)以SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.13為靶基因設計特異性檢測引物，建立PCR擴增體系并進行PCR擴增；(3)如果從待檢測的樣品中擴增出預期的特異性條帶，則待檢測的水稻樣品是轉基因水稻科豐2號；如果從待檢測的樣品中未能擴增出預期的特異性條帶，則待檢測的水稻樣品不是轉基因水稻科豐2號。
[0010]其中，所述的從待檢測水稻樣品中提取DNA的方法，可以是從植物材料中提取DNA的各種常用方法，例如可以是CTAB法、異硫氰酸胍法或鹽酸胍法等各種方法。
[0011]PCR反應體系中引物的終濃度以及退火溫度對于檢測結果的特異性靈敏度均有一定的影響；本發(fā)明考察了 PCR反應體系中引物的終濃度以及退火溫度對于檢測的特異性和靈敏度的影響，實驗結果發(fā)現(xiàn)在引物終濃度為0.2 μ M、退火溫度為58°C時，檢測結果的特異性最強，靈敏度最高。
[0012]本發(fā)明中所述的PCR擴增體系可參考以下方法建立:反應體系的總體積為25.0 μ L，其中，10 XPCR緩沖液2.5 μ L, 25mmol/L氯化鎂溶液1.5 μ L，dNTPs混合溶液(各
2.511111101/1)2 4 1^，0.2 4 11101/1上游引物 0.5 μ L, 0.2 μ mol/L 下游引物 0.5μ L，0.025U/μ LTaq酶1.5yL，25mg/L DNA模板2.0 μ L，余量為雙蒸水。
[0013]所述的PCR 擴增條件優(yōu)選為:94°C,5min ;94°C，30s，58°C，30s，72°C，30s，35 個循環(huán)；94°C，2min。
[0014]本發(fā)明進一步的目的是提供一種轉基因水稻科豐2號的品系特異性PCR定性檢測試劑盒，包括=IOXPCR緩沖液，氯化鎂溶液，dNTPs混合溶液，檢測上下游引物對，Taq酶和雙蒸水；其中，所述檢測上下游引物對的核苷酸序列分別為SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示。
[0015]采用本發(fā)明建立的轉基因水稻科豐2號的品系特異性PCR定性檢測方法對轉基因水稻π優(yōu)科豐6號、汕優(yōu)10、汕優(yōu)63、皖80-4B、抗優(yōu)97、華恢I號、科豐2號、常規(guī)水稻明恢63以及其它轉基因植物(例如:M0N863玉米、GHB614棉花、M0N89788大豆和油菜GT73等)進行了定性檢測，定性PCR擴增結果表明，在科豐2號水稻基因組中擴增得到了目的片段大小的條帶(201bp)，在其它轉基因水稻Π優(yōu)科豐6號、汕優(yōu)10、汕優(yōu)63、皖80-4B、抗優(yōu)97、華恢I號和其它轉基因植物(M0N863玉米、GHB614棉花、M0N89788大豆和油菜GT73)以及常規(guī)水稻明恢63等基因組中沒有擴增得到目的片段大小的片段；通過測序分析表明科豐2號水稻基因組中擴增獲得的序列與目的擴增片段序列一致。實驗結果表明，本發(fā)明所建立的轉基因水稻科豐2號品系特異性定性PCR檢測方法具有較強的特異性。[0016]靈敏度實驗結果表明，科豐2號水稻成分為1%，0.5%, 0.1%，0.05%，采用本發(fā)明建立的PCR反應都擴增出了目的片段大小的條帶，說明本發(fā)明所建立的科豐2號水稻品系特異性PCR定性檢測方法的靈敏度為0.05%，具有高度的靈敏性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1H1-TAIL PCR擴增結果；M:1Kb plus Markerl:下游第二輪PCR產物2:下游第三輪PCR產物；3:上游第二輪PCR產物4:上游第三輪產物。
[0018]圖2上下游測序拼接結果(2614bp)。
[0019]圖3從已知序列的兩端設計H1-TAIL PCR的嵌套引物。
[0020]圖4H1-TAIL PCR 擴增結果；M:1Kb plus Markerl、上游第二輪 PCR 產物；2、上游第三輪產物；注:下游引物無條帶。
[0021]圖5上下游測序拼接結果。
[0022]圖6PCR擴增結果；M:1Kb plus Markerl:空白對照；2:明恢86陰性對照3:科豐2號。
[0023]圖7長片段驗證獲得的整合結構、②、③、④、⑤分別代表:從所示意的位置設計長片段引物進行擴增。
[0024]圖8 I號引物 擴增結果:M:lKb plus Marker ；1:空白對照2:明恢86陰性對照3:科豐2號。
[0025]圖9 2號引物擴增結果:M:100bp Marker ；1:空白對照2:明恢86陰性對照3:科
豐2號。
[0026]圖10 3號引物擴增結果:M:lKb plus Marker, I:空白對照2:明恢86陰性對照3:科豐2號。
[0027]圖11 4號引物擴增結果:M:lKb plus Marker, I:空白對照2:明恢86陰性對照3:科豐2號。
[0028]圖12 5號引物擴增結果:M:lKb plus Marker, I:空白對照2:明恢86陰性對照3:科豐2號。
[0029]圖13科豐2號轉化體5’端旁側序列特異性引物篩選結果。
[0030]圖14 5’端旁側序列引物的特異性驗證結果；A:M:100bp Marker ；1:空白對照；2:明恢86陰性對照；3:科豐2號陽性對照；4-19分別是:明恢63、皖21-B、中花11、汕優(yōu)63、科豐6號、II優(yōu)科豐6號、II優(yōu)明恢86、華恢I號、汕優(yōu)10、bar68-l、皖80-4B、抗優(yōu)97、東農、遼粳371、松粳6 ；B:M:1OObp Marker ；1:空白對照；2:明恢86陰性對照；3:科豐2號陽性對照；4-7分別為:玉米陰性、M0N863、Btl76、M0N810 ;8_10分別為:棉花陰性、LL25、M0N15985 ;11_13 分別為:大豆陰性、M0N89788、40-3-2 ;14、15 分別為:油菜 T45、MS1 ;16、17分別為:甜菜GT73、H7-1。
[0031]圖15科豐2號轉化體3’端旁側序列特異性引物篩選結果。
[0032]圖16PCR反應體系中引物的終濃度和退火溫度優(yōu)化結果；引物的終濃度為0.1 μ M/L ；Μ: IOObp Markerl:明恢 86 陰性對照，2:科豐 2 號 a:54 °C b:56 °C c:58 °C d:60°C e:62。。。
[0033]圖17PCR反應體系中引物的終濃度和退火溫度優(yōu)化結果；引物的終濃度為0.2 μ M/L ；Μ:IOObp Markerl:明恢 86 陰性對照；2:科豐 2 號 a:54 °C b:56 °C c:58 °C d:60°C e:62。。。
[0034]圖18PCR反應體系中引物的終濃度和退火溫度優(yōu)化結果；引物的終濃度為0.4 μ M/L ；M:IOObp Markerl:明恢 86 陰性對照；2:科豐 2 號；a:54°C b:56°C c:58°C d:60°C e:62°C。
[0035]圖19PCR反應體系中引物的終濃度和退火溫度優(yōu)化結果；引物的終濃度為0.8 μ M/L ；M: IOObp Markerl:明恢 86 陰性對照;2:科豐 2 號 a:54 °C b:56 °C c:58 °C d:60°C e:62。。。
[0036]圖20科豐2號轉化體方法特異性檢測；M: IOObp Markerl:空白對照2:明恢86陰性對照3:科豐2號陽性對照；4-19分別是:明恢63、皖21-B、中花11、汕優(yōu)63、科豐6號、II優(yōu)科豐6號、II優(yōu)明恢86、華恢I號、汕優(yōu)10、bar68-l、皖80-4B、抗優(yōu)97、東農、遼粳371、松粳6。
[0037]圖21科豐2號轉化體方法特異性檢測；M: IOObp Markerl:空白對照2:明恢86陰性對照，3:科豐2號陽性對照，4-7分別為:玉米陰性、M0N863、Btl76、M0N810 ;8_10分別為:棉花陰性、LL25、M0N15985 ;11_13分別為:大豆陰性、M0N89788、40-3-2 ;14、15分別為:油菜 T45、MS1 ; 16、17 分別為:甜菜 GT73、H7-1。
[0038]圖22科豐2號轉化體方法靈敏度測試結果；M:IOObp Markerl:空白對照2、陰性對照 3、4、5、6、7、陽性 100%、1%、0.5%、0.1%、0.05%。
[0039]圖23檢測限測試結果；M:100bp Marker A:空白對照B:陰性對照；1_10:陽性
0.1%的10個平行11-20:陽性0.05%的10個平行；21-30:陽性0.01%的10個平行。
[0040]實施例1轉基因水稻科豐2號品系中外源插入SCK基因的側翼序列的獲取
[0041]轉基因水稻科豐2號品系外源插入目的基因為SCK基因，共415bp，其堿基序列為SEQ ID N0.1 所示。
[0042]通過H1-TAIL PCR獲得整合結構(外源插入基因側翼序列)
[0043]1、第一步:在目的基因SCK上設計H1-TAIL PCR的嵌套引物
[0044]①下游引物:
【權利要求】
1.轉基因水稻科豐2號外源插入基因載體和其兩端側翼水稻序列形成的連接區(qū)序列，其特征在于:其核苷酸序列為SEQ ID N0.2所示。
2.轉基因水稻科豐2號外源插入基因載體和3’端側翼水稻序列形成的連接區(qū)序列，其特征在于:其核苷酸序列為SEQ ID N0.13所示。
3.權利要求1所述的連接區(qū)序列作為靶基因應用于轉基因水稻科豐2號品系特異性定性檢測中的應用。
4.權利要求2所述的連接區(qū)序列作為靶基因應用于轉基因水稻科豐2號品系特異性定性檢測中的應用。
5.按照權利要求3所述的應用，其特征在于，包括:(I)提取待檢測水稻樣品的DNA；(2)以提取的DNA為模板，以SEQ ID N0.2為靶基因設計檢測引物，建立PCR反應體系并進行PCR擴增；(3)如果從待檢測的樣品中擴增出預期的特異性條帶，則待檢測的水稻樣品是轉基因水稻科豐2號；如果從待檢測的樣品中未能擴增出預期的特異性條帶，則待檢測的水稻樣品不是轉基因水稻科豐2號。
6.按照權利要求4所述的應用，其特征在于，包括:(I)提取待檢測水稻樣品的DNA;(2)以提取的DNA為模板，以SEQ ID N0.13為靶基因設計檢測引物，建立PCR反應體系并進行PCR擴增；(3)如果從待檢測的樣品中擴增出預期的特異性條帶，則待檢測的水稻樣品是轉基因水稻科豐2號；如果從待檢測的樣品中未能擴增出預期的特異性條帶，則待檢測的水稻樣品不是轉基因水稻科豐2號。
7.按照權利要求6所述的應用，其特征在于:所述的檢測引物為SEQID N0.7和SEQID N0.8 所示。
8.按照權利要求6所述的應用，其特征在于:所述預期的特異性條帶的大小是201bp。
9.按照權利要求5或6所述的應用，其特征在于，所述的PCR反應體系為:反應體系的總體積為25.0 μ L，其中，10 XPCR緩沖液2.5 μ L，25mmol/L氯化鎂溶液1.5 μ L，dNTPs混合溶液 2μ L，0.2ymol/L SEQ ID N0.7 所示的引物 0.5 μ L，0.2 μ mol/L SEQ ID N0.8 所示的引物 0.5 μ L，0.025U/ μ LTaq 酶 1.5 μ L，25mg/L DNA 模板 2.0 μ L,余量為雙蒸水。
10.按照權利要求5或6所述的應用，其特征在于，所述的PCR擴增條件為:94°C，5min；94°C，30s, 58°C，30s, 72°C，30s, 35 個循環(huán)；94°C，2min。
【文檔編號】C12N15/11GK103834645SQ201410081007
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月6日 優(yōu)先權日:2014年3月6日
【發(fā)明者】宛煜嵩, 梁利霞, 張秀杰, 朱禎, 金蕪軍, 苗朝華, 李亮, 黃衛(wèi)紅 申請人:中國農業(yè)科學院生物技術研究所