一種新型t載體及其應(yīng)用方法

一種新型t載體及其應(yīng)用方法
【專利摘要】將待克隆的DNA片段成功插入載體DNA，是篩選目標(biāo)克隆，進(jìn)而測(cè)定基因序列、分析基因結(jié)構(gòu)與功能、進(jìn)行基因重組表達(dá)等研究工作的首要步驟。本發(fā)明的新型載體pHsh-T具有以下特征：（1）同時(shí)具有T載體易于克隆和pHsh載體高效表達(dá)的功能；（2）具有雙向基因表達(dá)元件，使正、反向連接的外源基因都得到有效表達(dá)，可用于基因文庫(kù)的構(gòu)建和活性篩選；（3）質(zhì)粒分子小，是基因容量大、轉(zhuǎn)化率高、易于進(jìn)行原位基因改造的表達(dá)型T載體。用本發(fā)明的載體進(jìn)行PCR產(chǎn)物的克隆、基因文庫(kù)的構(gòu)建和篩選，以及基因的超量表達(dá)，可以簡(jiǎn)化操作步驟、節(jié)約材料和時(shí)間；提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和成功率；加快研究進(jìn)程以期獲得更多科技成果。
【專利說明】一種新型T載體及其應(yīng)用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及分子生物技術(shù)、微生物工程、基因工程等【技術(shù)領(lǐng)域】中的一種新型T載體，更涉及一種高效轉(zhuǎn)化、雙向表達(dá)型T載體的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及應(yīng)用技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]將待克隆的DNA片段成功插入載體DNA，是篩選目標(biāo)克隆進(jìn)而測(cè)定基因序列、分析基因結(jié)構(gòu)與功能、進(jìn)行基因重組表達(dá)等研究工作的首要步驟。發(fā)展能夠與DNA片段高效連接和聞效轉(zhuǎn)化的新型載體有利于簡(jiǎn)化基因操作步驟、節(jié)省材料和時(shí)間；提聞基因克隆的準(zhǔn)確性和成功率；加快研究進(jìn)展、獲得更多科技成果。
[0003]DNA的末端狀態(tài)和首尾匹配狀況對(duì)插入片段與載體之間的連接率的影響很大。粘性末端連接要比平末端連接的效率高，人們通常選用限制性DNA內(nèi)切酶對(duì)片段和載體進(jìn)行切割，產(chǎn)生帶粘性末端的插入片段和線性化載體以便連接。但是，由于這些DNA首尾粘性末端的序列互補(bǔ)，易發(fā)生插入片段的自相連接，以及線性載體自身的首尾連接，從而降低了連接效率。TA克隆技術(shù)采用另一種方式進(jìn)行粘性末端連接:Taq DNA聚合酶擴(kuò)增產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的雙鏈兩端各帶有I個(gè)3’端懸掛的A(腺苷酸)，能夠與末端帶有T (胸腺核苷酸)的載體進(jìn)行連接(Holto et al., 1991, Nucleic Acids Res，19:1156)。因?yàn)?TA 克隆中每一段線性DNA的兩端序列不能相互配對(duì)，從而有效地避免了目標(biāo)基因片段之間的相互連接或載體的自身環(huán)化。
[0004]TA克隆技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于PCR產(chǎn)物的克隆，其原理是TaqDNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶活性，能夠在雙鏈DNA的3’末端加上I個(gè)核苷酸。用Taq DNA聚合酶擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物的末端通常被`加上I個(gè)A ;為了與之互補(bǔ)，人們用限制性內(nèi)切酶如EcoRV切割載體質(zhì)粒產(chǎn)生平末端，再用TaqDNA聚合酶在線性質(zhì)粒兩端添加T，所制成的兩端帶有3’端懸掛T的、用于TA克隆的載體被稱為T載體。
[0005]目前市場(chǎng)上銷售的T載體的應(yīng)用效果不夠穩(wěn)定，因?yàn)門核苷酸并非TaqDNA聚合酶優(yōu)先聚合的核苷酸，僅部分載體的3’端能添加上T，并且有些末端可能被加上過多的T。市售T載體的另一個(gè)欠缺是基因表達(dá)功能較弱，PCR產(chǎn)物克隆成功后，還需要用限制性內(nèi)切酶切下目的片段，亞克隆到經(jīng)同樣酶切處理的表達(dá)載體中，才能進(jìn)行基因的超量表達(dá)研究。因此通常T載體只能作為中間載體，后續(xù)還要進(jìn)行一系列繁瑣的操作。
[0006]鐘星等最近發(fā)表了關(guān)于構(gòu)建一種用于基因克隆和表達(dá)的定向T載體pETG的研究論文(鐘星等，2012，生物工程學(xué)報(bào)，29:510-519)。本文中作者對(duì)TA克隆技術(shù)作了三方面的改進(jìn):⑴通過限制性內(nèi)切酶Bfu I切割產(chǎn)生T載體，保證載體末端序列正確；(2)以表達(dá)載體pET-23a為基礎(chǔ)，可用于基因的表達(dá)；(3)弓丨入IacO序列鑒定PCR擴(kuò)增的目標(biāo)基因的正反向連接。該論文在構(gòu)建自制的可用于基因表達(dá)的T載體方面，以及TA克隆的定向選擇方面為基因工程工作者提供了有效的方法。但是，由于PET系統(tǒng)的表達(dá)載體本身的性質(zhì)問題，所產(chǎn)生的T載體pETG在應(yīng)用中表現(xiàn)有以下不足之處:(1)必須添加昂貴的化學(xué)誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)基因的表達(dá)；(2)被誘導(dǎo)表達(dá)的許多外源基因易產(chǎn)生包涵體或細(xì)胞毒性，從而限制基因產(chǎn)物的活性或抑制轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)；(3)因?yàn)镮acO的部分序列必須合成在引物上，定向篩選僅適用于PCR產(chǎn)物的克??；(4)pET質(zhì)粒分子較大，轉(zhuǎn)化率相應(yīng)較低，并且因基因反向插入，約有50%的轉(zhuǎn)化子中的基因不能表達(dá)。
[0007]大腸桿菌表達(dá)載體pHsh是本研究組發(fā)明的熱激誘導(dǎo)型高效表達(dá)系統(tǒng)，2010年獲得美國(guó)發(fā)明專利授權(quán)(US7，807，460B2)，相關(guān)技術(shù)在國(guó)內(nèi)已經(jīng)有論文綜述(蔣鈺瑤等，2012，微生物學(xué)通報(bào)，39:394-400)。熱激載體pHsh與國(guó)際通用的pET等表達(dá)系統(tǒng)相比具有以下獨(dú)特的優(yōu)勢(shì):(I)避免添加化學(xué)誘導(dǎo)劑，降低成本減少污染；(2)通過激活分子伴侶的表達(dá)提高細(xì)胞生長(zhǎng)密度和目標(biāo)蛋白的可溶性；(3)pHsh是最小型的表達(dá)載體，容量大、轉(zhuǎn)化率高，并且有利于對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行原位定點(diǎn)誘變或定向進(jìn)化。但是，pHsh系統(tǒng)的質(zhì)粒中還沒有用于TA克隆的T載體，迄今還需要通過多克隆位點(diǎn)將外源基因克隆到pHsh載體中進(jìn)行基因表達(dá)。這種方式不僅使工作繁瑣，而且常常受限制性內(nèi)切酶的匹配性的限制。本發(fā)明利用表達(dá)載體PHsh的優(yōu)勢(shì)，設(shè)計(jì)并構(gòu)建一種兼有克隆、表達(dá)和目標(biāo)基因活性篩選功能的高效T載體，pHsh-T。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]1.發(fā)明目的
[0009]利用pHsh系統(tǒng)的表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)，構(gòu)建一種具有以下特征的新型T載體:(I)同時(shí)具有T載體易于克隆和pHsh系統(tǒng)的高效表達(dá)的功能；(2)質(zhì)粒分子小，具有基因容量大、轉(zhuǎn)化率高等特點(diǎn)，可提高基因的轉(zhuǎn)化效率；(3)具有雙向基因表達(dá)元件，使正、反向連接的外源基因都得到表達(dá)，適用于基因文庫(kù)的構(gòu)建和基因產(chǎn)物的活性篩選。
[0010]2.本發(fā)明的具體描述
[0011]本發(fā)明載體的設(shè)計(jì)方案:
[0012]表達(dá)載體pHsh-Cm是環(huán)狀質(zhì)粒，不具有T載體功能。為了達(dá)到本發(fā)明的目的，我們?cè)O(shè)計(jì)新型T載體的前體質(zhì)粒。前體質(zhì)粒中保留了 pHsh-Cm中的氯霉素抗性基因和Hsh啟動(dòng)子(Hsh pro)表達(dá)元件；修改了質(zhì)粒復(fù)制元件中的I個(gè)限制性內(nèi)切酶Bfu I識(shí)別位點(diǎn)中的堿基；切除了多克隆位點(diǎn)；插入了 I個(gè)與Hsh啟動(dòng)子方向相反、由Sigma70識(shí)別的持家基因啟動(dòng)子(Hkg pro)和相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄終止子；并且在兩個(gè)雙向的啟動(dòng)子之間加入兩個(gè)背向的Bfu I識(shí)別位點(diǎn)。前體質(zhì)粒為環(huán)狀，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后在細(xì)胞中可以得到大量復(fù)制；用Bfu I酶對(duì)前體質(zhì)粒進(jìn)行切割后，即可獲得本發(fā)明的T載體(圖1)。
[0013]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的操作技術(shù):
[0014](I)選擇合適的目標(biāo)載體和限制性內(nèi)切酶。
[0015]首先，選擇合適的目標(biāo)載體進(jìn)行改造，本發(fā)明選擇的是本研究組構(gòu)建的新型大腸桿菌高效表達(dá)載體pHsh-Cm(GenBank登錄號(hào):FJ571620)。再選擇合適的限制性內(nèi)切酶，所選擇的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)在載體上應(yīng)該盡可能的稀有，更重要的是酶切以后要在線性化載體的兩端各留下I個(gè)3’端懸掛的堿基T。限制性內(nèi)切酶Bfu I的識(shí)別和切割位點(diǎn)如圖3-a所示。其中，“N”為A、T、C或G任意堿基。將酶切位點(diǎn)的堿基設(shè)計(jì)成如圖3-b所示序列,切割后可以產(chǎn)生3’端懸掛T的末端。因?yàn)锽fu I的識(shí)別和切割位點(diǎn)是非對(duì)稱性的，因此，正負(fù)鏈上各設(shè)置一個(gè)Bfu I位點(diǎn)就可以產(chǎn)生帶有兩個(gè)T末端的線性化載體。[0016]
[0017]
[0018]
[0019]
[0020]
[0021]
[0022]
[0023]
[0024]
[0025]
[0026](2)突變目標(biāo)載體。
[0027]對(duì)選定的目標(biāo)載體進(jìn)行定點(diǎn)誘變，消除目標(biāo)載體上的Bfu I酶切位點(diǎn)。這里及以下涉及的限制性內(nèi)切酶及DNA修飾酶的使用、基因克隆、大腸桿菌轉(zhuǎn)化等相關(guān)操作的具體方法均按《分子克隆手冊(cè)》第三版上的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行(Sambrook and Russell, 2001, CSHLPress, Cold Spring Harbor, New York)。
`[0028](3)切除多克隆位點(diǎn)和引入反向啟動(dòng)子等。
[0029]利用反向PCR在誘變完成后的載體的NcoI和Xho I之間引入反向啟動(dòng)目的基因表達(dá)的啟動(dòng)子Hkg pro ;通過反向PCR在Hsh pro和Hkg pro之間引入2個(gè)Bfu I酶切位點(diǎn)，從而形成如下結(jié)構(gòu):Hsh pro-Bfu 1-Bfu 1-Hkg pro ;再通過反向PCR引入反向的轉(zhuǎn)錄終止子(Hkg term),從而獲得pHsh-T的前體質(zhì)粒。
[0030](4)制備新型雙向啟動(dòng)表達(dá)的T載體。
[0031]將上述前體質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞,培養(yǎng)細(xì)胞后從中提取純化pHsh-T的前體質(zhì)粒；用Bfu I切割前體質(zhì)粒后，通過瓊脂糖凝膠電泳分離和回收的2，280bp線性化DNA片段，即為具有雙向基因表達(dá)元件、3’末端帶T的載體；這種新型T載體被命名為pHsh-T (圖1)。新型雙向啟動(dòng)表達(dá)的T載體中的抗藥基因可以通過環(huán)狀質(zhì)粒擴(kuò)增法更換(實(shí)施例6)。
[0032]本發(fā)明可取得的有益效果:
[0033]本發(fā)明產(chǎn)生的新型載體pHsh-T在使用方法、作用功能和應(yīng)用效果等方面優(yōu)于一股pHsh載體、商業(yè)化T載體或最近報(bào)道的T載體。pHsh-T是一個(gè)多功能載體，不僅能用于克隆測(cè)序，還能直接進(jìn)行基因高效表達(dá)；更重要的是它不僅適用于PCR產(chǎn)物的克隆表達(dá)，而且是一個(gè)構(gòu)建基因文庫(kù)和進(jìn)行目標(biāo)基因活性篩選的高效載體。本發(fā)明的主要有益效果總結(jié)如下:
[0034]1.最新發(fā)展的pHsh系統(tǒng)的載體具有表達(dá)水平高和不需要化學(xué)誘導(dǎo)等特點(diǎn)，但是PHsh系統(tǒng)中還沒有應(yīng)用于TA克隆的T載體，目標(biāo)基因的克隆還有賴于多克隆位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列，不僅工作繁瑣，而且受到酶切位點(diǎn)的匹配性限制；pHsh-T成為該系統(tǒng)的第一個(gè)T載體，為基因在該系統(tǒng)中的克隆表達(dá)提供了方便。
[0035]2.市場(chǎng)上銷售的T載體是PCR克隆載體，基因表達(dá)功能較弱，經(jīng)過克隆和序列測(cè)定的基因還需要亞克隆到其他表達(dá)型的載體如pET、pHsh系統(tǒng)中，才能獲得基因產(chǎn)物的高水平表達(dá)，而pHsh-T僅需I次TA克隆就可以獲得基因產(chǎn)物的有效表達(dá)，表達(dá)水平低的基因經(jīng)定向改造的序列有機(jī)會(huì)達(dá)到超量表達(dá)。[0036]3.最新報(bào)道的T載體pETG可用于基因的克隆和IPTG誘導(dǎo)的高效表達(dá)，但是在化學(xué)品IPTG存在時(shí)許多克隆的生長(zhǎng)受抑制或產(chǎn)生包涵體；pHsh-T中的基因表達(dá)不需要化學(xué)品誘導(dǎo)，并且外源基因的表達(dá)受到分子伴侶的保護(hù)，可以使在PET系統(tǒng)中難克隆或難表達(dá)的基因得到研究。
[0037]4.本發(fā)明的pHsh-T作為分子量最小的帶雙向表達(dá)元件的表達(dá)型T載體，其特點(diǎn)是轉(zhuǎn)化率高、正反向插入的轉(zhuǎn)化子都能有效表達(dá)。因此，它不僅是一個(gè)PCR產(chǎn)物的高效克隆和表達(dá)載體，而且是構(gòu)建基因文庫(kù)和目標(biāo)基因活性篩選的高效載體(具體方法參見實(shí)施例5)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1.新型T載體pHsh-T的結(jié)構(gòu)圖。BfuI酶切后構(gòu)建完成的T載體DNA序列:7-76bp 為 Hkg-pro ； 115_136bp 為 Hsh-term ;581_1，231bp 為 CmR ; 1，391-2，006bp 為 ColEl ；
2,175-2，206bp 為 Hkg-term ；2, 212-2，246bp 為 Hsh-pro。
[0039]圖2.還原力感應(yīng)蛋白(RSP)基因通過TA克隆正向或反向插入pHsh-T后基因表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析。圖中M為蛋白質(zhì)標(biāo)樣；1，未加入RSP基因的載體；2_4，外源基因正向插入的3個(gè)克隆，RSP基因由Hsh pro啟動(dòng)表達(dá)；5_7，外源基因反向插入的3個(gè)克隆，RSP基因由Hkg pro啟動(dòng)表達(dá)。箭頭所指的蛋白質(zhì)條帶是重組蛋白R(shí)SP。
圖3.Bfu I酶切位點(diǎn)。(a)BfuI酶通用識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)。(b)在切割位點(diǎn)處設(shè)計(jì)加入T-A堿基對(duì)，以產(chǎn)生粘性“T”末端。
【具體實(shí)施方式】:
[0040]本發(fā)明中所用術(shù)語，除非有另外說明，一股具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面的方法結(jié)合具體實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)該理解，實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0041]實(shí)施例中涉及的限制性內(nèi)切酶及DNA修飾酶的使用、基因克隆、大腸桿菌轉(zhuǎn)化等相關(guān)操作的一股方法均按《分子克隆手冊(cè)》第三版上的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行的(Sambrook andRussell,2001, CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York)。
[0042]實(shí)施例1.本發(fā)明的T載體的制備
[0043]材料與方法:
[0044]大腸桿菌(E.coli)菌株BL21(DE3)和DH10B用作基因克隆和表達(dá)宿主；感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自Promrga(USA)。所用質(zhì)粒pHsh的來源或制備參見(Wu et al.,2010, BiotechnolLett, 32:795-801)。質(zhì)粒中限制性內(nèi)切酶Bfu I酶切位點(diǎn)的設(shè)計(jì)參照鐘星等采用的方法(鐘星等，2012，生物工程學(xué)報(bào)，29:510-519)?；蜣D(zhuǎn)化采用電穿孔系統(tǒng)(Bio-rad GenePulser Xcell ?)并按其操作要求進(jìn)行大腸桿菌的電轉(zhuǎn)化。大腸桿菌轉(zhuǎn)化子在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)(30-37 °C )。
[0045]限制性內(nèi)切酶Bfu I購(gòu)自Fermentas公司；T4DNA連接酶、PrimeSTAR? HS DNA聚合酶、DNA分子量Marker購(gòu)自大連Takara生物公司；DNA片段割膠回收試劑盒購(gòu)自Qiagen公司。PCR反應(yīng)和DNA片段連接反應(yīng)均按照相應(yīng)說明書操作?；蛐蛄械臏y(cè)定由上海生工生物工程公司完成。[0046]定點(diǎn)誘變、短序列切除或插入都用反向PCR技術(shù)完成:設(shè)計(jì)一對(duì)與質(zhì)粒上擬改造的位點(diǎn)兩端序列互補(bǔ)、方向相背的引物，在引物的5’端加上擬插入序列、減去擬刪除序列或修改擬突變序列；以環(huán)狀質(zhì)粒為模板，用高度保真性且產(chǎn)生平末端的DNA聚合酶如Pyrobest或PrimeSTAR? HS等DNA聚合酶(大連Takara生物公司)進(jìn)行DNA擴(kuò)增；以T4多聚核苷酸激酶將PCR產(chǎn)物的5’端磷酸化以后，再用T4DNA連接酶將其環(huán)化，獲得序列改造的質(zhì)粒。
[0047]實(shí)驗(yàn)步驟:
[0048](I)消除目標(biāo)載體上的Bfu I酶切位點(diǎn):對(duì)pHsh-Cm進(jìn)行定點(diǎn)誘變的位點(diǎn)為GTATCCGGTA AG;反向 PCR 引物 1:5’-CGGTA AGCGG CAGGG TCG-3’；引物 2:5’-TTTAC CTGTC CGCCTTTCTC C-3，。
[0049](2)切除多克隆位點(diǎn)和引入反向啟動(dòng)子:利用反向PCR在誘變完成后的載體的NcoI和Xho I之間引入反向啟動(dòng)目的基因表達(dá)的啟動(dòng)子Hkg pro ;根據(jù)Sigma70識(shí)別的啟動(dòng)子的保守序列設(shè)計(jì)和人工合成的Hkg pro的序列是ACGAC TTGAC ACCAA CTCTT CCTTTTGATA TAATT GGAAA AGTCG。反向 PCR 引物設(shè)計(jì)為引物 3:5’ -TCCAA TTATA TCAAA AGGAAGAGTT GGTGT CAAGT CGTCT CGAGC ACCAC CACCA C-3，；引物4:5，-MAGT CGATT TTACT TATCAATGCG AAGGA GGTGT GAGCC ATGGG TATAT CTCCT TCT-3’。
[0050](3)引入Bfu I酶切位點(diǎn):通過反向PCR在啟動(dòng)子Hsh pro和Hkg pro之間引入2個(gè)Bfu I酶切位點(diǎn)，從而形成Hsh pro-Bfu 1-Bfu 1-Hkg pro序列；所用引物為引物5:5，-CGCGT ATCCT CTAGA CTCAC ACCTC CTTCG CATT-3，；引物 6:5，-CGCGT ATCCG AAGAAGGGTA TATCT CCTTC TTGTC-3’。
[0051](4)引入反向的轉(zhuǎn)錄終止子:設(shè)計(jì)并合成的反向PCR引物是引物7:5’ -TTTCGGTGCG GGGGC CCCCT TGMT GTGG`G G-3，；引物8:5，-GGTCC GGGGG TTTTT TTTCT CTTCC GCTTCCTCTC TC-3’。分析和驗(yàn)證多個(gè)轉(zhuǎn)化子中質(zhì)粒的序列，選擇序列正確的質(zhì)粒用作pHsh-T的前體質(zhì)粒。
[0052](5)制備新型雙向啟動(dòng)表達(dá)的T載體:將上述前體質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞后從中提取純化前體質(zhì)粒；用Bfu I切割前體質(zhì)粒后，通過瓊脂糖凝膠電泳分離和回收的2，280bp線性化DNA片段，即為具有雙向基因表達(dá)元件、3’末端帶T的載體(圖1)。用TE溶液溶解，于_20°C保存。最終得到的線性T載體序列見附件中的核苷酸序列表SEQ IDN0.1。
[0053]實(shí)施例2.PCR產(chǎn)物的TA克隆試驗(yàn):
[0054]用具有3’末端轉(zhuǎn)移酶活性的Taq DNA聚合酶擴(kuò)增目標(biāo)基因，對(duì)需要表達(dá)的目標(biāo)基因必須擴(kuò)增完整的開放閱讀框，即始于5’端的起始密碼子ATG，直至終止密碼子TCA、TTA或CTA0擴(kuò)增得到的片段與pHsh-T進(jìn)行連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化菌液涂布于帶有氯霉素抗性的LB平板上。30°C培養(yǎng)15-20小時(shí)，挑選平板上的轉(zhuǎn)化子，即可以用于后續(xù)測(cè)序和基因表達(dá)。
[0055](I)嗜熱乙醇桿菌JW200還原力感應(yīng)蛋白(RSP)的PCR擴(kuò)增
[0056]嗜熱厭氧乙醇桿菌Thermoanaerobacter ethanolicus JW200的還原力感應(yīng)蛋白R(shí)SP的編碼基因的GenBank的登錄號(hào)為⑶586295.1，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增完整的開放閱讀框。上游引物從RSP基因的起始密碼子ATG開始，下游引物是從終止密碼子TGA開始的反向互補(bǔ)鏈。引物序列為:
[0057]RSP-UP:5，-ATGAG CAAAA AGACT ATAGT AT-3，
[0058]RSP-DOWN:5，-TCACC CATCT ATTTT AGCAG-3’
[0059]用具有3’末端轉(zhuǎn)移酶活性的Taq DNA聚合酶擴(kuò)增RSP蛋白的基因序列，得到的3’端帶有A的RSP基因片段，經(jīng)純化后可以與構(gòu)建好的T載體連接。
[0060](2)連接與克隆
[0061]連接反應(yīng)體系為10 μ 1，其中含有50ng載體pHsh-T和50ng的PCR產(chǎn)物(連接酶和緩沖液按大連Takara生物公司的產(chǎn)品說明書使用)；用連接液轉(zhuǎn)化E.coli DHlOB感受態(tài)細(xì)胞后，將細(xì)胞涂布于含有氯霉素(25g/mL)的LB固體平板上，置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15-20小時(shí)后，挑選平板上的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，并且用pHsh系統(tǒng)測(cè)序引物pHsh-UP/DOWM測(cè)序引物進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序引物的序列為:pHsh-UP:CCGCA GCCGA ACGACCGA ；pHsh-D0WN:GCACA GATGC GTAAG GAGAA。[0062]本次克隆共得到85個(gè)轉(zhuǎn)化子，序列測(cè)定結(jié)果表明，它們都是帶有重組質(zhì)粒PHsh-RSP ;約有50 %的RSP基因?yàn)檎虿迦?，其表達(dá)受Hsh pro啟動(dòng)子的調(diào)控，其余反向插入的RSP基因受Hkg pro調(diào)控表達(dá)。
[0063]實(shí)施例3.外源基因的正、反向表達(dá)試驗(yàn)
[0064]從實(shí)施例2得到的不同轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒，取3個(gè)正向和3個(gè)反向插入pHsh-T的RSP基因表達(dá)質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化至BL21 (DE3)，涂布于具有氯霉素抗性的LB平板上于30°C培養(yǎng)，待平板上長(zhǎng)出單菌落后，挑取不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的單菌落轉(zhuǎn)接至LB液體中進(jìn)行基因表達(dá)試驗(yàn)。
[0065]正向插入載體的RSP基因通過熱激誘導(dǎo)表達(dá)，方法是:轉(zhuǎn)化子置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中，180rpm培養(yǎng)至0D600達(dá)到0.6，放入42°C水浴搖床進(jìn)行熱激誘導(dǎo)6_8小時(shí)，離心收獲細(xì)胞；RSP基因反向插入載體的轉(zhuǎn)化子在30°C培養(yǎng)至菌液0D600達(dá)到2.0，離心收獲細(xì)胞。通過SDS-PAGE檢測(cè)目標(biāo)蛋白分析基因表達(dá)情況(圖2)。結(jié)果表明，通過TA連接克隆到pHsh-T中的RSP基因無論在Hsh pro還是Hkg pro的調(diào)控下都得到了有效表達(dá)。
[0066]實(shí)施例4.轉(zhuǎn)化率測(cè)定
[0067]重組質(zhì)粒pET-RSP的構(gòu)建:用Nco I和Xho I酶切割pHsh-RSP分離出RSP基因，與經(jīng)NcoI和XhoI雙酶切的pET-28a載體連接，構(gòu)建成pET-RSP重組質(zhì)粒。
[0068]轉(zhuǎn)化率比較:取pET-RSP質(zhì)粒和實(shí)施例2中得到的pHsh-RSP的質(zhì)粒IOOng分別轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)中，加入SOC培養(yǎng)基30°C振蕩培養(yǎng)45min，按不同稀釋度涂平板。30°C培養(yǎng)18小時(shí)，待菌落長(zhǎng)出后計(jì)算平板上菌落個(gè)數(shù)并計(jì)算轉(zhuǎn)化率。最終測(cè)得pET-RSP轉(zhuǎn)化率為2 X 103cfu/g,而pHsh-RSP轉(zhuǎn)化率平均為I X 104cfu/g。
[0069]實(shí)施例5.用pHsh-T構(gòu)建基因文庫(kù)并進(jìn)行目標(biāo)基因的活性篩選
[0070]基因組基因片段的制備:從亞棲熱菌Meiothermus ruber RH提取DNA,用限制性內(nèi)切酶Sau3A I進(jìn)行不完全切割，瓊脂糖凝膠電泳分離后，割膠回收2kb-4kb的DNA片段，具體操作方法參見分子克隆指南(Sambrook and Russell, 2001, CSHL Press, Cold SpringHarbor, New York)。所獲得的是5’端懸掛的粘性末端DNA片段。
[0071]基因片段的末端修飾:用Taq DNA聚合酶對(duì)上述基因片段的粘性末端進(jìn)行補(bǔ)平并且附加3’端懸掛的堿基A。[0072]基因片段與載體pHsh-T連接:將基因片段與載體以2: 1的比例混合，用T4DNA連接酶進(jìn)行連接(16°C溫箱中孵育12小時(shí))；用連接液轉(zhuǎn)化E.coli DHlOB感受態(tài)細(xì)胞。
[0073]建立文庫(kù)與木聚糖酶活性篩選:轉(zhuǎn)化E.coli BL21感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，涂布在含有2%樺樹木聚糖(Sigma，USA)和25g/mL氯霉素的LB培養(yǎng)基平板上，置37°C溫箱中培養(yǎng)長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子單菌落；菌落周圍有透明圈的轉(zhuǎn)化子為產(chǎn)生木聚糖酶活性的克隆；提取其中的質(zhì)粒分析和鑒定被克隆的木聚糖酶基因。
[0074]實(shí)施例6.用環(huán)狀質(zhì)粒擴(kuò)增法更換pHsh-T載體上的抗藥基因
[0075]環(huán)狀質(zhì)粒擴(kuò)增方法是本研究組發(fā)明的“變性-退火-延伸-連接”四步PCR循環(huán)，用于從環(huán)狀質(zhì)粒擴(kuò)增出環(huán)狀質(zhì)粒(PPCP)的新方法(Le et al.，DNA Research, 2013, 20:375-382)。本實(shí)驗(yàn)通過PPCP方法將pHsh_T載體攜帶的氯霉素抗性基因CmR更換為氨芐青霉素抗性基因AmpR或卡那霉素抗性基因KanR。操作步驟如下:
[0076](1)設(shè)計(jì)一對(duì)引物與pHsh系列載體共有序列互補(bǔ)的引物:UP:5’ -TCTCA GTACAATCTG CTCTG-3’ ；D0WN:5’ -GCGAG GTATG TAGGC GGT-3’。
[0077](2)分別以 pHsh-Amp 或 pHsh-Kan (GenBank 登錄號(hào):FJ571619 或 FJ571621)為模板，擴(kuò)增不同的抗藥基因及其兩端的同源臂序列；
[0078](3)用T4多聚核苷酸激酶處理步驟(2)獲得的PCR產(chǎn)物，使其5’端磷酸化；
[0079](4)以本發(fā)明的T載體的環(huán)狀前體質(zhì)粒為模板，以步驟(3)中磷酸化的雙鏈DNA片段為超大引物，通過PPCP獲得更換了抗藥基因的T載體的前體質(zhì)粒；
[0080](5)用Bfu I完全酶切后純化得到的線性DNA為帶有不同抗藥基因的T載體。
【權(quán)利要求】
1.一種新型表達(dá)型T載體，其基本特征在于在兩個(gè)末端TA連接位點(diǎn)的上游各有I個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子及相應(yīng)的基因表達(dá)元件(含轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和下游的轉(zhuǎn)錄終止子)，使正向和反向插入的外源基因都能得到有效表達(dá)。
2.如權(quán)利要求1所述T載體，其特征在于將pHsh系列載體構(gòu)建成T載體，使pHsh表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建不再需要限制性內(nèi)切酶切割，從而基因的克隆不再受限于酶切位點(diǎn)的匹配性。
3.如權(quán)利要求1所述T載體，其特征在于具有大腸桿菌載體系統(tǒng)pHsh的基本結(jié)構(gòu)和高效表達(dá)功能，利用熱激(Hsh)啟動(dòng)子對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。
4.如權(quán)利要求3所述的表達(dá)型T載體，其特征在于在Hsh啟動(dòng)子的相反方向安裝I個(gè)人工設(shè)計(jì)合成的持家基因(Hkg)啟動(dòng)子，使反向插入的目標(biāo)基因能夠自由表達(dá)。
5.如權(quán)利要求4所述T載體的用途，其特征在于不僅適用于PCR產(chǎn)物的克隆和表達(dá)，還可以應(yīng)用于基因文庫(kù)的構(gòu)建和篩選。
6.如權(quán)利要求5所述T載體的應(yīng)用方法，其特征在于在構(gòu)建基因文庫(kù)的過程中，用TaqDNA聚合酶處理擬與T載體連接的DNA`片段的末端，使它們都帶有3’端懸掛的堿基A。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK103865943SQ201410061452
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年2月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月24日
【發(fā)明者】邵蔚藍(lán), 周蓉, 王洪成 申請(qǐng)人:南京仙奕基因科技有限公司