一種海水池塘沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)的分析方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明以海水養(yǎng)殖池塘沉積物為研究對(duì)象，首先優(yōu)化提取沉積物樣品DNA的方法；然后對(duì)PCR退火溫度、循環(huán)次數(shù)、引物添加量、模板添加量進(jìn)行優(yōu)化篩選，建立擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA?V3區(qū)的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序；再?gòu)淖冃詣舛忍荻确秶?、電泳條件、染色方法等方面優(yōu)化篩選了變性梯度凝膠電泳反應(yīng)條件，最終完整建立并優(yōu)化了池塘沉積物微生物群落PCR-DGGE檢測(cè)體系，有利于獲得養(yǎng)殖池塘優(yōu)勢(shì)微生物信息，為從海水池塘沉積物分離篩選有益功能微生物奠定了基礎(chǔ)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明適用于對(duì)池塘沉積物微生物群落分析，具成本低廉、具可重復(fù)性、可直接快速分析的優(yōu)點(diǎn)，無(wú)需分離培養(yǎng)的過(guò)程，便可獲得原生環(huán)境微生物群落完整的相關(guān)信息。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種海水池塘沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)的分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物種群分子檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種海水池塘沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)的分析方法
【背景技術(shù)】
[0002]底泥微生物是海水池塘生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)不可或缺的角色，直接影響?zhàn)B殖動(dòng)物及底棲生物的生長(zhǎng)與存活，從微生物群體基因組的角度研究微生物群落種類(lèi)及功能多樣性已得到國(guó)內(nèi)外廣泛關(guān)注。微生物傳統(tǒng)的研究方法是平板培養(yǎng)法，即選取合適的培養(yǎng)基對(duì)環(huán)境樣品微生物篩選培養(yǎng)，依據(jù)微生物的生理生化特征運(yùn)用顯微鏡觀察，研究生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落多樣性及結(jié)構(gòu)。但此方法僅能從固體培養(yǎng)基上分離微生物，而底泥微生物中僅有1%的可培養(yǎng)細(xì)菌，無(wú)法全面反映微生物的信息。因此，需要提供一種能夠有效的進(jìn)行海水池塘沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)的分析方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有傳統(tǒng)平板培養(yǎng)技術(shù)存在的問(wèn)題及沉積物樣品富含腐殖酸等特性，利用構(gòu)建的細(xì)菌16SrDNA V3區(qū)通用引物，建立了海水池塘沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)的技術(shù)分析體系。本發(fā)明適用于對(duì)池塘沉積物微生物群落分析，可應(yīng)用于不同池塘和不同養(yǎng)殖周期的樣品進(jìn)行了檢測(cè)，并利用Quantity One軟件將電泳圖譜轉(zhuǎn)化成二維數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，具成本低廉、具可重復(fù)性、直接快速分析等優(yōu)點(diǎn)，無(wú)需分離培養(yǎng)過(guò)程，便可獲得原生環(huán)境微生物群落的相關(guān)信息。
[0004]海水池塘沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)的分析方法，包括如下步驟:
[0005]I)從池塘沉積物樣品中提取基因組DNA ;提取的DNA稀釋后于_20°C保存?zhèn)溆茫?br>
[0006]2)建立擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA V3區(qū)的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，其中擴(kuò)增所用的引物為 Fl:5' -CC TAC GGG AGG CAG CAG-3' (SEQ ID N0:1),R1:5/ -ATT ACC GCG GCT GCTGG-3/ (SEQ ID N0:2)；
[0007]3)將步驟2)的擴(kuò)增產(chǎn)物與上樣液混合進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，電泳結(jié)束后進(jìn)行銀染檢測(cè)；
[0008]4)利用Quantity One軟件對(duì)圖譜進(jìn)行分析；
[0009]5)回收銀染獲得的條帶，
[0010]6)對(duì)回收條帶的PCR產(chǎn)物進(jìn)行T-克隆測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank比對(duì)得到海水池塘沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)。
[0011]其中步驟(1)用CTAB法提取的池塘沉積物樣品基因組DNA，
[0012]步驟2)反應(yīng)體系一種組成為如下:總體積50 μ 1，包括DNA模板lOOng，10 X buffer5 μ I，dNTPs4 μ I，rTaq DNA 聚合酶 0.5 μ I，加 ddH20 至 50 μ I;
[0013]PCR反應(yīng)程序?yàn)榻德銹CR，95°C預(yù)變性5min，前10個(gè)循環(huán)94°C變性30s，58°C退火30s ;每個(gè)循環(huán)降低0.5°C;72°C延伸30s ;后25個(gè)循環(huán)94°C變性30s，53。。退火30s，72。。延伸 30sec ;最后 72°C延伸 IOmin0
[0014]其中步驟(3)中，進(jìn)行變性梯度凝膠電泳的條件如下:丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性劑濃度梯度是45%-55%，電壓60v，60°C電泳IOh
[0015]本發(fā)明以海水養(yǎng)殖池塘沉積物為研究對(duì)象，首先優(yōu)化提取沉積物樣品DNA的方法；然后對(duì)PCR退火溫度、循環(huán)次數(shù)、引物添加量、模板添加量進(jìn)行優(yōu)化篩選，建立擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA V3區(qū)的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序；再?gòu)淖冃詣舛忍荻确秶?、電泳條件、染色方法等方面優(yōu)化篩選了變性梯度凝膠電泳反應(yīng)條件，最終完整建立并優(yōu)化了池塘沉積物微生物群落PCR-DGGE檢測(cè)體系，有利于獲得養(yǎng)殖池塘優(yōu)勢(shì)微生物信息，為從海水池塘沉積物分離篩選有益功能微生物奠定了基礎(chǔ)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明適用于對(duì)池塘沉積物微生物群落分析，具成本低廉、具可重復(fù)性、可直接快速分析的優(yōu)點(diǎn)，無(wú)需分離培養(yǎng)的過(guò)程，便可獲得原生環(huán)境微生物群落完整的相關(guān)信息。本發(fā)明可同時(shí)分析不同時(shí)期采集的樣品，檢測(cè)微生物群落在不同時(shí)空上的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律?！緦?zhuān)利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1:養(yǎng)殖池塘底泥DGGE指紋圖譜示意圖。
[0017]圖2:養(yǎng)殖池塘底泥DGGE圖譜UPGMA聚類(lèi)分析。
【具體實(shí)施方式】
[0018]通過(guò)實(shí)施例詳細(xì)敘述本發(fā)明的技術(shù)方法:首先利用CTAB法提取池塘沉積物樣品基因組DNA，PCR擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA V3區(qū)，變性梯度凝膠電泳分離DNA片段，銀染后顯著條帶切膠回收重PCR，產(chǎn)物T-克隆測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果到GenBank比對(duì)可獲得養(yǎng)殖池塘沉積物優(yōu)勢(shì)微生物的信息。
[0019]實(shí)施例1基因組DNA提取
[0020]稱(chēng)取500mg海水養(yǎng)殖池塘的樣品，加入800 μ I CTAB抽提緩沖液，漩渦混勻后加入30 μ I蛋白酶K (20mg/mL)，37 V溫浴30min，每15min顛倒混勻；加入45 μ 120%的SDS65O溫浴2h,每15min顛倒混勻；6000rpm離心IOmin,收集上清液,沉淀中加入裂解緩沖液450 μ 1、SDS50 μ 1，混勻后65°C溫浴30min，6000rpm離心IOmin,收集上清液；集合上清液到一個(gè)離心管內(nèi)，加入等體積酹-氯仿-異戍醇(25:24:1)抽提IOmin, 12000rpm離心lOmin，取上清液到新EP管中；收集上一步驟所得的上清，加入等體積氯仿-異戊醇(24:1)，抽提10min，20000rpm離心IOmin ;將上述抽提收集到的上清液置_20°C冰箱過(guò)夜沉淀，12000rpm離心IOmin,收集沉淀,70%乙醇洗漆，12000rpm離心IOmin,乙醇揮發(fā)后加無(wú)菌水20 μ I，溶解DNA，保存于-20°C。
[0021]實(shí)施例2PCR-DGGE分析
[0022]設(shè)計(jì)16SrDNA引物，此引物為擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA V3區(qū)的引物對(duì)，并在正向引物的5’ 端加上 GC 夾；引物是:F1:5’ -CC TAC GGG AGG CAG CAG-3’，Rl:5’ -ATT ACC GCG GCTGCT GG-3，。
[0023]擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA V3 區(qū) PCR 反應(yīng)體系包括:DNA 模板 lOOng，IOXbuffer (withMgC12) 5μ I, dNTPs4y I, rTaq DNA 聚合酶 0.5 μ 1，加 ddH20 至 50 μ I。反應(yīng)程序?yàn)榻德銹CR:95°C預(yù)變性5min,前10個(gè)循環(huán)94°C變性30s, 58°C，退火30s (每個(gè)循環(huán)降低0.5°C )，72°C延伸30s;后25個(gè)循環(huán)94 °C變性30s，53 °C退火30s，72 °C延伸30s，最后72°C延伸IOmin0擴(kuò)增產(chǎn)物與上樣液以1:1的比例混合，變性梯度凝膠電泳相關(guān)參數(shù)是:丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性劑濃度梯度是45%-55%，電壓60v，60°C電泳10h，銀染方法:①固定:10%的乙醇及0.5%的冰醋30min;②漂洗:ddH20漂洗三次，每次2min ;③染色:染色15_20min，銀染液組成:1.5gAgN03+2.25mL37%甲醛+ILddH2O ;④顯影:顯影l(fā)_2min，顯影液組成:
7.5gNa0H+2.25mL37% 甲醛 +ILddH2O ;⑤固定:ILddH2O 固定 5min。
[0024]實(shí)施例3利用軟件對(duì)圖譜進(jìn)行分析
[0025]DGGE圖譜導(dǎo)入Quantity One分析軟件中，采用軌跡定量法將凝膠電泳圖譜轉(zhuǎn)化為數(shù)字信息，定量分析結(jié)果可以輸出系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、泳道比對(duì)結(jié)果，進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。池塘底泥DGGE指紋圖譜如圖1，能真實(shí)反映出污水中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，其中DNA條帶能夠回收并進(jìn)行克隆測(cè)序，從而得到DNA條帶所代表的物種信息。，可得知DGGE電泳圖譜條帶數(shù)量豐富，不同時(shí)期樣品的條帶數(shù)量和亮度均有差異，以I~9表示采樣的九個(gè)時(shí)期。并作出DGGE圖譜的形似性做UPGMA聚類(lèi)分析樹(shù)，如圖2可以得到在同一養(yǎng)殖池塘不同養(yǎng)殖時(shí)期的菌群之間的相互關(guān)系。
[0026]實(shí)施例4細(xì)菌群落序列分析
[0027]切膠回收方法:用滅菌刀片切下顯著條帶勿搗碎置于1.5mL無(wú)菌離心管內(nèi)，加入50 μ I無(wú)菌水置4°C冰箱過(guò)夜；上清液作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物及擴(kuò)增程序同實(shí)施例
2。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后連接T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，對(duì)篩選到的白色菌落進(jìn)行陽(yáng)性克隆驗(yàn)證，將陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過(guò)夜后送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果到GenBank比對(duì)可獲得對(duì)應(yīng)微生物的種屬信息。
[0028]本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果參照?qǐng)D1，對(duì)圖1中的優(yōu)勢(shì)條帶進(jìn)行切膠回收測(cè)序。其中測(cè)序結(jié)果如下。
[0029]表1:目標(biāo)序列的比對(duì)結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種海水池塘沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)的分析方法，包括如下步驟: 1)從池塘沉積物樣品中提取基因組DNA;提取的DNA稀釋后于_20 C保存?zhèn)溆茫? 2)建立擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNAV3區(qū)的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序， 3)將步驟2)的擴(kuò)增產(chǎn)物與上樣液混合進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，電泳結(jié)束后進(jìn)行銀染檢測(cè)； 4)利用QuantityOne軟件對(duì)圖譜進(jìn)行分析； 5)回收銀染獲得的條帶， 6)對(duì)回收條帶的PCR產(chǎn)物進(jìn)行T-克隆測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank比對(duì)得到海水池塘沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)。
2.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的步驟I)是用CTAB法提取的池塘沉積物樣品基因組DNA。
3.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的步驟2)中擴(kuò)增所用的引物的序列為 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO: 2。
4.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的步驟2)中反應(yīng)體系組成為如下:總體積 50 μ I，包括 DNA 模板 IOOng, 10 X buffer5 μ I，dNTPs4 μ I，rTaq DNA 聚合酶 0.5 μ I，加 ddH20 至 50 μ I。
5.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的步驟2)中PCR反應(yīng)程序?yàn)榻德溱??，951:預(yù)變性51^11，前10個(gè)循環(huán)94°C變性30s，58°C退火30s ;每個(gè)循環(huán)降低0.5°C；72°C延伸30s ;后25個(gè)循環(huán)94°C變性30s, 53°C退火30s, 72°C延伸30sec ;最后72°C延伸IOmin0
6.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的步驟3)中進(jìn)行變性梯度凝膠電泳的條件如下:丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性劑濃度梯度是45%-55%，電壓60v，60°C電泳10h。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103789437SQ201410050852
【公開(kāi)日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2014年2月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月14日
【發(fā)明者】王 琦, 李健, 陳萍, 高天翔, 張秀梅 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué), 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所