一種鑒定紅鰭東方鲀親子關(guān)系的分子標(biāo)記方法及其微衛(wèi)星與試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供利用分子標(biāo)記方法對紅鰭東方純親子關(guān)系進(jìn)行鑒定的方法及其微衛(wèi)星引物與試劑盒，所選擇的44對微衛(wèi)星引物在紅鰭東方純PCR擴(kuò)增反應(yīng)穩(wěn)定、擴(kuò)增片段清楚、多態(tài)性高。運(yùn)用本技術(shù)，可將混雜的不同家系的紅鰭東方純個(gè)體區(qū)分開來，有助于快速、準(zhǔn)確鑒別不同家系的紅鰭東方純，對紅鰭東方純保種、繁殖配組和選擇育種具有極大的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】—種鑒定紅鰭東方鈍親子關(guān)系的分子標(biāo)記方法及其微衛(wèi)星與試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子標(biāo)記【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及利用分子標(biāo)記方法對紅鰭東方純親子關(guān)系進(jìn)行鑒定的方法及其微衛(wèi)星引物與試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]紅鰭東方純(Takifugu rubripes)屬硬骨魚綱(Osteichthyes)、純形目(Tetraodontiformes)、純亞目(Tetraodontoidei)、純總科(Tetraodntoidea)、純科(Tetraodontidae)、東方純屬(Takifugu),俗稱為“河豚”,主要產(chǎn)于我國的渤海、黃海和東海，在國外則主要分布于日本沿海和朝鮮半島。紅鰭東方純?nèi)赓|(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、高蛋白低脂肪、含有豐富的維生素和微量元素，素有“魚中之王”的美譽(yù)。紅鰭東方純雖然具有較為全面的優(yōu)良性狀，但在現(xiàn)階段實(shí)際養(yǎng)殖過程中無品種可言，有關(guān)紅鰭東方純的選擇育種研究也相對較少。因此，通過遺傳改良手段，培育出經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)良的紅鰭東方純新品種或新品系是十分重要的。
[0003]從目前的研究基礎(chǔ)分析，改良紅鰭東方純的主要經(jīng)濟(jì)性狀采用多家系選擇育種技術(shù)是較為有效的方法。多家系選育技術(shù)主要為:以雌雄1:1配組建立多個(gè)全同胞家系，通過養(yǎng)殖對比實(shí)驗(yàn)，分析每個(gè)家系的生長、抗病、抗逆、品質(zhì)等性狀，經(jīng)過多代優(yōu)良性狀組合，選育出經(jīng)濟(jì)性狀更加優(yōu)良的新品種或新品系。在養(yǎng)殖對此實(shí)驗(yàn)中，通常是將不同家系飼養(yǎng)在獨(dú)立的水槽中，這就需要占用大用的養(yǎng)殖設(shè)施和水槽。目前，也可通過對個(gè)體進(jìn)行電子標(biāo)記，然后混合飼養(yǎng)在一個(gè)大的水泥池中，以減少環(huán)境對不同家系的影響，但此方法也存在一定的弊端:在個(gè)體進(jìn)行電子標(biāo)記錢仍需要將不同家系在獨(dú)立水槽中飼養(yǎng)4-5個(gè)月，當(dāng)個(gè)體體重達(dá)到50g左右才能進(jìn)行電子標(biāo)記。此外，養(yǎng)殖在獨(dú)立水槽中的魚苗比大池中養(yǎng)殖的魚苗生長緩慢。另外，個(gè)體電子標(biāo)記的成本也較高，平均一個(gè)電子標(biāo)記牌要20元左右。
[0004]因此，在不影響魚·體生長的情況下尋找到一種準(zhǔn)確鑒定親子關(guān)系，快速、準(zhǔn)確的區(qū)分不同家系，將有效推動(dòng)紅鰭東方純新品種的選育進(jìn)程。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明旨在提供利用分子標(biāo)記方法對紅鰭東方純親子關(guān)系進(jìn)行鑒定的方法及其微衛(wèi)星引物與試劑盒，有助于快速、準(zhǔn)確鑒別不同家系的紅鰭東方純，在紅鰭東方純選擇育種和遺傳保種中有極大的應(yīng)用價(jià)值。
[0006]本發(fā)明一方面涉及一種鑒定紅鰭東方純親子關(guān)系的微衛(wèi)星引物，其特征在于，所述引物針對紅鰭東方純基因組的不同連鎖群。
[0007]優(yōu)選地，所述引物選自如下引物對中的3-10對:
[0008]
【權(quán)利要求】
1.一種鑒定紅鰭東方純親子關(guān)系的微衛(wèi)星引物，其特征在于，所述引物針對紅鰭東方純基因組的不同連鎖群。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微衛(wèi)星引物，其特征在于，所述引物選自如下引物對中的3-10 對:
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的微衛(wèi)星引物，其特征在于，所述引物由如下引物對組成:
4.一種鑒定紅鰭東方純親子關(guān)系的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1_3中任一項(xiàng)所述的鑒定紅鰭東方純親子關(guān)系的微衛(wèi)星引物。
5.一種鑒定紅鰭東方純親子關(guān)系的分子標(biāo)記方法其特征在于采用以下步驟: (1)選擇表1中44對特異微衛(wèi)星引物進(jìn)行PCR反應(yīng)； (2)采集不同家系親本和子代個(gè)體的鰭條，提取基因組DNA； (3)用步驟(2)的基因組DNA為模板，步驟⑴所選擇的44對微衛(wèi)星引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (4)對步驟(3)的PCR產(chǎn)物用擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，硝酸銀染色、顯色后，凝膠在HP scanjet G4010掃描儀成像； (5)將PCR的電泳檢測結(jié)果數(shù)字化處理，用遺傳分析軟件進(jìn)行分析； (6)獲得每個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的排除率，統(tǒng)計(jì)3-10個(gè)標(biāo)記的累積排除率；利用排除率前5位的標(biāo)記組合使用，完成家系子代與親本的親子關(guān)系鑒定； (7)利用親本與子代的親子關(guān)系，就能將不同紅鰭東方純家系區(qū)分開來。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，PCR反應(yīng)總體積為 25 μ L,包括:10 X Buffer2.5 μ L, 25mmol/L 的 Mg2+I μ L，各 2mmol/L 的 dNTPsl μ L,ΙΟμ mol/L的正、反向引物各I μ L，50ng/μ L的模版DNAl μ L，Taq DNA聚合酶1U，加適量ddH20。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，退火30s—72°C延伸30s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(5)中，使用的遺傳分析軟件為Gel-Pro Analyzer4.5 凝膠分析軟件和 CERVUS Version3.0。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(6)中，用遺傳分析軟件對電泳譜帶進(jìn)行數(shù)字化處理，計(jì)算每個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的排除率；按照排除率高低，挑選排序前10位的微衛(wèi)星標(biāo)記，3-10個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的累積排除率范圍為95.79% -99.99% ;利用5個(gè)排除率排序在前的微衛(wèi)星標(biāo)記完成了家系親本與子代的親子關(guān)系鑒定。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(6)中，排除率前5位的微衛(wèi)星標(biāo)記名稱和序列信息如下:
【文檔編號】C12Q1/68GK103866004SQ201410033662
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年1月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月24日
【發(fā)明者】劉永新, 周勤, 張紅濤 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院, 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實(shí)驗(yàn)站