日本短體線蟲的pcr檢測試劑及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了日本短體線蟲的PCR檢測試劑及試劑盒，包括一對特異性引物，上游引物的核苷酸序列：GGCAACGGGCCTAGTTATGA，下游引物的核苷酸序列：GACTCGCGCACACGATAAAC。該特異性引物對蘋果根結線蟲特異、靈敏，擴增的特異性片段大小為176bp，對其它短體線蟲無特異性條帶片段；應用本發(fā)明的特異性引物及試劑盒，可在4小時內完成測試，靈敏度高，實用性強。
【專利說明】日本短體線蟲的PCR檢測試劑及試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及短體屬線蟲的檢測技術，具體涉及日本短體線蟲的PCR檢測試劑及試劑盒。
【背景技術】
[0002]短體屬線蟲(Pratylenchus Filipjev, 1936)為植物根系專性內寄生線蟲,是植物病原線蟲中種類最多、分布最廣、為害最嚴重的類群之一，具有十分重要的經濟意義。我國于2007年將短體線蟲(非中國種)列入《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》，在口岸實施嚴格檢疫，以保護我國農業(yè)和生態(tài)安全。日本短體線蟲Pratylenchus japonicusRyss, 1988為寧波口岸首次從來自日本的雞爪槭中截獲。國內尚無分布，為非中國種，是我國進境植物檢疫性有害生物。日本短體線蟲在1963年首次由日本的Gotoh和Ohshima提到，當時只鑒定到短體屬，1974年Gotoh又將這個種歸于穿孔屬，1982年Minagawa將該種鑒定為大針短體線蟲Pratylenchus macrostylus Wu, 1971。1988年,俄羅斯學者Ryss將在日本發(fā)現的該種線蟲與加拿大發(fā)現的大針短體線蟲進行區(qū)分，把它描述為新的亞種P.macrostylus japonicus, Ryss, 1988。直到 1997 年，日本的 Mizukubo 等根據形態(tài)學特征、測計值及分子生物學特征，將其與大針短體線蟲區(qū)分開來，并將其從亞種提升到種，命名為日本短體線蟲。日本短體線蟲僅發(fā)現于日本，我國尚未有相關報道。其寄主包括櫟屬的扁果麻櫟、槲樹、抱櫟以及蘋果、枇杷、矮櫻桃等幾種果樹，可以對寄主造成侵染，影響寄主植物的生長。
[0003]我國口岸出入境 檢疫實驗室或其他相關部門，都面臨著對短體線蟲進行快速、準確的鑒定這一難題。近年來，雖然在形態(tài)學鑒定的基礎上，PCR - RFLP、熒光PCR、特異性PCR、序列測定、LAMP技術等已在線蟲鑒定上廣泛應用，但在短體線蟲上應用很少。目前還未
【公開日】本短體線蟲的分子生物學方面的檢測報道。
【發(fā)明內容】
[0004]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種快速、特異、準確的日本短體線蟲的PCR檢測試劑及試劑盒。
[0005]本發(fā)明系選擇參考GenBank中日本短體線蟲的核糖體28S基因(InternalTranscribed Spacer),使用 Primer Explorer V4 (http://primerexplorer.jp)設計了特異性引物，經過大量的反應條件優(yōu)選、對比試驗和驗證試驗，并經過大量實際樣品的檢測應用評估(以日本短體線蟲的DNA為模板，穿刺短體線蟲、咖啡短體線蟲、傷殘短體線蟲、盧斯短體線蟲為陰性對照，水為空白對照，利用引物進行PCR檢測。通過觀察擴增產物的保守性和特異性，篩選最適引物)，篩選得到擴增效率和特異性好的一對特異性引物。引物均由上海英濰捷基生物技術有限公司合成。
[0006]本發(fā)明的日本短體線蟲的PCR檢測試劑，包括一對特異性引物，所述一對特異性引物的核苷酸序列分別為:[0007]上游引物:5’-GGCAACGGGC CTAGTTATGA-3’
[0008]下游引物:5’ -GACTCGCGCA CACGATAAAC-3 ’。
[0009]日本短體線蟲的PCR檢測試劑盒，由無Mg2+的10XPCR緩沖液，濃度為25mM的MgCl2溶液，濃度為0.1mM的dNTP溶液，濃度5U/ y L的Taq酶溶液，濃度都為IOyM的上游引物溶液和下游引物溶液組成。
[0010]與現有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點是日本短體線蟲的PCR檢測試劑及試劑盒，包括一對特異性引物，上游引物的核苷酸序列:GGCAACGGGC CTAGTTATGA，下游引物的核苷酸序列:GACTCGCGCA CACGATAAAC。該特異性引物對日本短體線蟲特異、靈敏，擴增的特異性片段大小為176bp，對其它短體線蟲無特異性條帶片段；應用本發(fā)明的特異性引物及試劑盒，可在4小時內完成檢測，靈敏度高，實用性強。
【具體實施方式】
[0011]以下結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
[0012]實施例1、日本短體線蟲的PCR檢測試劑盒
[0013]100次或200次反應體系，50 ii L反應體系包括:無Mg2+的10 X PCR緩沖液5.0 y L，濃度為25mM的MgCl2溶液5.0 y L，濃度為0.1mM的dNTP溶液4.0 y L，濃度5U/ y L的Taq酶溶液0.6 ii L，濃度都為10 ii M的上游引物溶液和下游引物溶液各3.0 ii L。Taq酶液，dNTP液購于寶生物工程(大連)有限公司，其中上游引物溶液含有核苷酸序列為GGCAACGGGCCTAGTTATGA的引物，下游引物溶 液含有核苷酸序列為GACTCGCGCACACGATAAAC弓丨物。
[0014]實施例2、DNA提取方法
[0015]挑取單條線蟲放入200 u L PCR管中[已加有10 ii L雙蒸水和5 u LlO XPCR緩沖液(無Mg2+)]，液氮中放置Imin (或-70度放置0.5h)以上，取出后立即85°C加熱2min。然后向PCR管中加入liiLlmg/mL蛋白酶K，56°C加熱30min以上，95°C加熱lOmin，得到DNA模板。
[0016]實施例3、PCR檢測方法
[0017]用日本短體線蟲的PCR檢測試劑盒進行檢測，PCR反應體系為:無Mg2+的IOXPCR緩沖液5.0uL,濃度為25mM的MgCl2溶液5.0 u L,濃度為0.1mM的dNTP溶液4.0 u L,濃度5U/ ii L的Taq酶溶液0.6 y L，濃度都為10 y M的上游引物溶液和下游引物溶液各3.0 y L，DNA 模板 1.0 ~5.0 ii L，ddH20 補齊 50 u L0 PCR 反應條件:94°C預變性 3min ;94°C變性 30S,55°C退火30S，72°C延伸30S，共35個循環(huán)；最后一個循環(huán)結束后，72°C延伸6min。電泳:將5uL PCR產物用1.0% (重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳分離，經DNA染料染色后于紫外凝膠成像系統(tǒng)下顯像，出現特異性片段大小為176bp，則為日本短體線蟲。
[0018]實施例4、日本短體線蟲的特異性和敏感性試驗
[0019]用實施例2的提取方法，實施例3的PCR檢測方法，分別對日本短體線蟲(采自日本進口的雞爪槭)、盧斯短體線蟲(采自日本進口的山茶)、咖啡短體線蟲(采自寧波的大豆)、傷殘短體線蟲(采自日本進口的雞爪槭)、朱頂紅短體線蟲(采自以色列進口的孤挺花)、玻利維亞短體線蟲(采自新西蘭進口的麻)、假草地短體線蟲(采自俄羅斯進口的郁金香)和最短尾短體線蟲(采自臺灣進口的苗)進行檢測，只有日本短體線蟲能進行有效擴增，出現條帶，且其特異性片段大小為176bp，說明本發(fā)明一對引物具有很好的特異性。對日本短體線蟲的DNA模板進行10°、10_ 1、10_ 2、10_ 3、10_ 4、10_ 5、10_ 6稀釋再PCR檢測，結果顯示PCR檢測限為原液稀釋10—1倍。
【權利要求】
1.日本短體線蟲的PCR檢測試劑，包括一對特異性引物，其特征在于一對特異性引物的核苷酸序列分別為: 上游引物:GGCAACGGGC CTAGTTATGA 下游引物:GACTCGCGCA CACGATAAAC。
2.如權利要求1所述的日本短體線蟲的PCR檢測試劑組成的檢測試劑盒，其特征在于由無Mg2+的IOXPCR緩沖液，濃度為25mM的MgCl2溶液，濃度為0.1mM的dNTP溶液，濃度5U/ ii L的Taq酶溶液， 濃度都為10 y M的上游引物溶液和下游引物溶液組成。
【文檔編號】C12Q1/68GK103789427SQ201410030404
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月23日 優(yōu)先權日:2014年1月23日
【發(fā)明者】顧建鋒, 何潔, 陳先鋒 申請人:寧波檢驗檢疫科學技術研究院