一種簡單異尖線蟲Ani s4抗原基因的克隆和表達方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術領域】，特別涉及一種簡單異尖線蟲Ani?s4抗原基因的克隆和表達方法。本發(fā)明以簡單異尖線蟲第三期幼蟲總RNA為模板，用RT-PCR的方法擴增得到500bp大小的特異片段，將擴增產(chǎn)物克隆至pMD18-T轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌DH5-α,經(jīng)酶切鑒定獲得陽性重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒和表達載體pET-32a分別以BamHI和HindШ雙酶切后構建重組表達載體pET-32a-Ani-s4，并將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中，提取質(zhì)粒經(jīng)酶切和PCR鑒定正確后，用IPTG誘導表達。表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot檢測顯示，融合蛋白的分子量約為25kDa，Ani?s4基因在大腸桿菌中成功表達。同時所構建的表達蛋白具有的His-tag為其后的純化工作提供了極大的便利。該ES抗原蛋白的成功表達，為后續(xù)的簡單異尖線蟲免疫學檢測方法的研究奠定了基礎。
【專利說明】一種簡單異尖線蟲Ani s4抗原基因的克隆和表達方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術領域】，特別涉及一種簡單異尖線蟲Ani s4抗原基因的克隆和表達方法。
【背景技術】
[0002]排泄分泌抗原(ES抗原)是在寄生蟲的感染過程中，由其口器和排泄孔分泌或排泄的抗原物質(zhì)。線蟲的ES系統(tǒng)有許多功能，包括滲透調(diào)節(jié)、離子調(diào)節(jié)及排泄、分泌等。分泌的物質(zhì)在體外可以降解細胞基質(zhì)，破壞宿主組織，引起臨床的過敏反應，如麻疹和水腫。運用分子克隆技術獲得純化的重組寄生蟲抗原，其有效性和特征性已經(jīng)在許多寄生蟲感染的診斷中得到了印證。這些合成的蛋白包括了寄生生活及感染過程中的分泌排泄抗原一 ES抗原。
[0003]相關研究表明，簡單異尖線蟲三期幼蟲可以侵入宿主的胃腸黏膜釋放ES蛋白。Anis4是簡單異尖線蟲的一個抗原基因，相關研究結果顯示，體外表達的該蛋白具有ES蛋白性質(zhì)，其具有高度的耐熱性，表達的抗原中不包含糖基化作用。該抗原蛋白經(jīng)過長時間的加熱，仍然能夠識別在人體病原感染病例中的陽性血清樣本，所以研究認為該蛋白與臨床檢測相關。在應用該抗原檢測人體感染病例研究中，顯示Ani s4表達抗原能與大部分病人血清產(chǎn)生特異反應。天然的ES蛋白獲得具有非常大的難度，且國內(nèi)尚無Ani s4基因體外表達的相關方法報道。鑒于Ani s4基因的抗原特性以及表達ES蛋白良好的免疫原性和保護效果，本發(fā)明研究對其進行克隆和表達，作為深入研究簡單異尖線蟲相關檢測的工具。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明提供一種簡單異尖線蟲Ani s4抗原基因的克隆和表達方法。
[0005]本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是:
[0006]一種簡單異尖線蟲Ani s4抗原基因的克隆和表達方法，包括如下步驟:
[0007]①簡單異尖線蟲總RNA的提取，
[0008]②簡單異尖線蟲Ani s4抗原基因的RT-PCR擴增，
[0009]根據(jù)Ani s4抗原基因其閱讀框的序列特點，在序列的兩端分別加上BamH I和Hind ΠΙ酶切位點設計引物，同時增加保護性堿基；設計的引物如下:
[0010]上游引物5，一CGGGATCCATGCAATCCAGAATCGTCGT—3，(SEQ ID N0.1),
[0011]下游引物5’ 一CCCAAGCTTGCAAACAAGCCAGTGTCATA— 3’ (SEQ ID N0.2),
[0012]以步驟①提取的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄出單鏈cDNA，經(jīng)PCR擴增，獲得目的基因Anis4，
[0013]③將純化后的目的基因PCR產(chǎn)物和pMD18-T載體進行連接，獲得重組質(zhì)粒pMD18-T-Ani_s4 ；
[0014]④原核表達載體的構建和鑒定:
[0015]BamH I和Hindm雙酶切質(zhì)粒pMD18-T-Ani_s4和質(zhì)粒pET_32a，回收所需目的片段，加入T4DNA連接酶進行連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，抽提質(zhì)粒；再應用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，BamH I和Hindm雙酶切篩選陽性克隆，命名為pET32a-Ani_s4 ；
[0016]⑤IPTG誘導大腸桿菌表達目的蛋白，
[0017]含重組表達質(zhì)粒的菌種活化后，將陽性菌接種到含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至菌液的OD值為0.5-0.6時，加入誘導劑IPTG至終濃度為lmmol/L后34°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)進行誘導表達；
[0018]誘導表達后通過SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)有特異性條帶出現(xiàn)，即完成簡單異尖線蟲Ani s4抗原基因的克隆和表達。
[0019]作為優(yōu)選，IPTG誘導大腸桿菌表達目的蛋白的具體步驟如下:
[0020]含重組表達質(zhì)粒的菌種活化后，取Iml陽性菌接種到50mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C搖床中以195rpm振搖培養(yǎng)，至菌液的OD值約為0.5-0.6時，加入誘導劑IPTG至終濃度為lmmol/L后34°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，分別在誘導前(Oh)和誘導后2、4、6、8h吸取2mL菌樣于4°C，5000rpm離心5min，收集細菌沉淀，用PBS重懸洗滌2次，加入40 μ I的I X SDS上樣緩沖液，煮沸7min，冰浴2min，12000rpm離心5分鐘，同時設立帶pET_32a質(zhì)粒的BL21大腸桿菌對照；
[0021 ] 同時，將剩余的40ml菌液用PBS洗2次，加ImL裂解緩沖液、10 μ I溶菌酶，將40ml菌液濃縮至4ml，超聲波裂解濃縮菌液后12000rpm離心lmin，沉淀用PBS重懸加入40 μ I的I X SDS上樣緩沖液，上清加入等量的2 X SDS上樣緩沖液，煮沸5min，冰浴2min，_20°C備 用。
[0022]作為優(yōu)選，超聲波裂解濃縮菌液的條件為200?，處理4s，間隔4s，共99次。
[0023]作為優(yōu)選，RT-PCR擴增的反應體系為:10XPCR buffer5 μ I, IOmM dNTPs4 μ I,ANCE-Upl μ 1，ANCE-Downl μ 1，cDNA2 μ 1，ddH2036.5μ l,5U/y I Taq 酶 0.5 μ 1，總體積 50.0 μ I ;擴增程序:94 0C 5min — 94 °C 30sec, 55 °C 30sec, 72 °C lmin, 30 個循環(huán)—72°C IOmin。
[0024]本發(fā)明對簡單異尖線蟲的Ani s4抗原基因進行了克隆和表達。根據(jù)已報道的簡單異尖線蟲的Ani s4抗原基因序列設計引物，以簡單異尖線蟲第三期幼蟲總RNA為模板，用RT-PCR的方法擴增得到500bp大小的特異片段，將擴增產(chǎn)物克隆至PMD18-T轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌DH5-a，經(jīng)酶切鑒定獲得陽性重組質(zhì)粒并對其進行測序。測序結果與參考序列比較，同源性為97.8%。然后將重組質(zhì)粒和表達載體pET-32a分別以BamH I和Hindm雙酶切后構建重組表達載體pET-32a-An1-s4，并將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中，提取質(zhì)粒經(jīng)酶切和PCR鑒定正確后，用IPTG誘導表達。表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot檢測顯示，融合蛋白的分子量約為25kDa，Ani s4基因在大腸桿菌中成功表達。同時所構建的表達蛋白具有的His-tag為其后的純化工作提供了極大的便利。該ES抗原蛋白的成功表達，為后續(xù)的簡單異尖線蟲免疫學檢測方法的研究奠定了基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]圖1是Ani s4基因的RT-PCR擴增圖，其中M.DNA Marker ;1.陰性對照；2.RT-PCR擴增產(chǎn)物；
[0026]圖2是pl8-T-An1-s4PCR及雙酶切鑒定，其中M.DNA Marker ；1.陰性對照；2.重組質(zhì)粒PCR鑒定；3.雙酶切產(chǎn)物；
[0027]圖3是pl8-T-Ani_s4序列比對結果；
[0028]圖4是pET32a-Ani_s4重組質(zhì)粒PCR及雙酶切鑒定圖，其中MDNA Marker; 1.陰性對照；2.DH5- α重組質(zhì)粒PCR擴增產(chǎn)物；3.BL21重組質(zhì)粒PCR擴增產(chǎn)物；
4.pET32a-An1-s4BamH I 和 HindIII 雙酶切產(chǎn)物；
[0029]圖5是pET32a-Ani_s4與公布序列比較圖；
[0030]圖6是pET32a-Ani_s4與公布序列的有效作用蛋白氨基酸序列比較圖譜；
[0031]圖7 是本發(fā)明 SDS-PAGE 圖，其中 M.Protein Molecular weight Marker ；1.pET-32a 空載體 BL21 誘導 8 小時；2.pET32a_Ani_s4BL21 未誘導；3_6.pET32a_Ani_s4 分別誘導2，4，6，8小時的表達產(chǎn)物；
[0032]圖8 是本發(fā)明 Western-blot 圖，其中 M.預染蛋白 Marker; 1.pET32a-Ani_s4BL21誘導8小時的表達產(chǎn)物。 【具體實施方式】
[0033]下面通過具體實施例，對本發(fā)明的技術方案作進一步的具體說明。應當理解，本發(fā)明的實施并不局限于下面的實施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護范圍。
[0034]在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所采用的設備和原料等均可從市場購得或是本領域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規(guī)方法。
[0035]實施例
[0036]一、方法
[0037]線蟲蟲種簡單異尖線蟲蟲種由舟山出入境檢驗檢疫局提供。
[0038]質(zhì)粒和細菌pMD18-T載體為TaKaRa有限公司產(chǎn)品，pET_32a質(zhì)粒、E.coli DH5 α、E.coli BL21由本實驗室保存。
[0039]工具酶T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamH I,HindIH和Taq DNA聚合酶為TaKaRa有限公司產(chǎn)品，cDNA合成試劑盒為申能博彩公司產(chǎn)品，DNA片段純化回收試劑盒為上海生工生物工程技術服務有限公司產(chǎn)品。
[0040]抗體鼠Ant1-His抗體、羊抗鼠IgG-HRP均為Novagen公司產(chǎn)品。
[0041]其他試劑dNTP、DL2000DNA Marker、小分子量蛋白質(zhì)Marker為TaKaRa公司產(chǎn)品，Trizol 試劑為上海生工產(chǎn)品，Prestained Protein Molecular Weight Marker 為Fermentas公司產(chǎn)品。LB培養(yǎng)基、SDS-PGAE和Western-blot所用溶液配制參照《分子克隆實驗指南(第三版)》，具體參照附錄。純化蛋白用的鎳瓊脂糖凝膠FF購自北京韋氏博慧色譜科技有限公司，緩沖液等配制參照附錄。
[0042]主要儀器生化培養(yǎng)箱、高速臺式冷凍離心機、-70°C超低溫冰箱、PCR儀、核酸電泳儀、紫外分光光度計、PH計、電子天平、凝膠自動成像系統(tǒng)、Mi 11 ipore超濾純水系統(tǒng)等。
[0043]1、簡單異尖線蟲總RNA的提取
[0044]參照Trizol Reagent Total RNA Isolation Kit說明書進行操作，提取簡單異尖線蟲的總RNA。步驟如下:[0045](I)取適量純化簡單異尖線蟲m期幼蟲經(jīng)DEPC處理水離心洗滌后轉(zhuǎn)入玻璃研磨器中，不斷研磨，使蟲體充分破碎，轉(zhuǎn)入1.5mL EP離心管中，加入ImL Trizol試劑(_20°C下預冷)，冰浴研磨lOmin，然后倒入DEPC預處理的1.5mL EP離心管中，顛倒混勻15s，室溫放置5min,使核蛋白分解完全；
[0046](2)加氯仿1/5體積(0.2mL),用力顛倒混勻15s,室溫靜置5min ；
[0047](3)4°C，12000rpm離心15min，轉(zhuǎn)上層水相(約400 μ I)于另一支1.5mL EP離心管管中，加等體積(0.5mL)異丙醇，混勻，_20°C靜置20min ；
[0048](4)4°C，12000rpm 離心 lOmin，棄上清，沉淀為 RNA,加 _20°C預冷用 DEPC 水配 75%乙醇ImL洗滌RNA ；
[0049](5) 4°C, 12000rpm離心5min,棄上清，室溫下使乙醇揮發(fā)完全；
[0050](6)加20 μ I DEPC水溶解RNA，_20°C加入70%乙醇保存。
[0051]2、簡單異尖線蟲Ani s4抗原基因的RT-PCR擴增
[0052]①引物設計
[0053]擴增的簡單異尖線蟲抗原基因按照Rodriguez-Mahillo等(Ana
1.Rodriguez-MahiIlo，Miguel Gonzalez-Munj Fernando Gomez-Aguado，etal.Cloning and characterisation of the Anisakis simplex allergen Ani s4asa cysteine-protease inhibitor.1nternational Journal for Parasitology.2007,37:907-917.)發(fā)表的序列。根據(jù)其閱讀框的序列特點，在序列的兩端分別加上BamH I和HindIH酶切位點設計引物，同時增加保護性堿基:
[0054]上游引物(ANCE-Up):5’一CGGGATCCATGCAATCCAGAATCGTCGT— 3’ (SEQ ID N0.1),
[0055]下游引物(ANCE-Down):5，一CCCAAGCTTGCAAACAAGCCAGTGTCATA—3，(SEQ IDN0.2)，
[0056]引物退火溫度為55°C，預期擴增片段為510bp。
[0057]引物由上海英駿生物技術有限公司合成，用ddH20溶解配成20 μ M的濃度。
[0058]②簡單異尖線蟲cDNA的合成
[0059]按照cDNA合成試劑盒說明書進行簡單異尖線蟲cDNA的合成。取一 0.5mL PCR管，按20 μ I體系調(diào)制反應液:
[0060]
【權利要求】
1.一種簡單異尖線蟲Ani S 4抗原基因的克隆和表達方法，其特征在于包括如下步驟: ①簡單異尖線蟲總RNA的提取， ②簡單異尖線蟲Anis 4抗原基因的RT-PCR擴增， 根據(jù)Ani s 4抗原基因其閱讀框的序列特點，在序列的兩端分別加上及和歷Π1酶切位點設計引物，同時增加保護性堿基；設計的引物如下:
上游引物 5’一CGGGATCCATGCAATCCAGAATCGTCGT — 3’ (SEQ ID N0.1), 下游引物 5’一CCCAAGCTTGCAAACAAGCCAGTGTCATA — 3’ (SEQ ID N0.2), 以步驟①提取的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄出單鏈cDNA，經(jīng)PCR擴增，獲得目的基因Ani s4, ③將純化后的目的基因PCR產(chǎn)物 和pMD18-T載體進行連接，獲得重組質(zhì)粒pMD18-T-Ani_s4 ； ④原核表達載體的構建和鑒定: BamHl取Hind似雙酶切質(zhì)粒pMD18-T-Ani_s4和質(zhì)粒pET_32a，回收所需目的片段，加入T4 DNA連接酶進行連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，抽提質(zhì)粒；再應用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，BamH I細ind /Z/雙酶切篩選陽性克隆，命名為pET32a-Ani_s4 ； ⑤IPTG誘導大腸桿菌表達目的蛋白， 含重組表達質(zhì)粒的菌種活化后，將陽性菌接種到含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 V振蕩培養(yǎng)至菌液的OD值為0.5-0.6時，加入誘導劑IPTG至終濃度為I mmol/L后34 °C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)進行誘導表達； 誘導表達后通過SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)有特異性條帶出現(xiàn)，即完成簡單異尖線蟲Ani s4抗原基因的克隆和表達。
2.根據(jù)權利要求1所述的簡單異尖線蟲Anis 4抗原基因的克隆和表達方法，其特征在于IPTG誘導大腸桿菌表達目的蛋白的具體步驟如下: 含重組表達質(zhì)粒的菌種活化后，取Iml陽性菌接種到50mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，于37 °C搖床中以195rpm振搖培養(yǎng)，至菌液的OD值約為0.5-0.6時，加入誘導劑IPTG至終濃度為I mmol/L后34 °C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，分別在誘導前(Oh)和誘導后2、4、6、8 h吸取2mL菌樣于4°C，5000 rpm離心5 min,收集細菌沉淀，用PBS重懸洗滌2次，加入40 μ I的I X SDS上樣緩沖液,煮沸7 min,冰浴2 min, 12000rpm離心5分鐘，同時設立帶pET_32a質(zhì)粒的BL21大腸桿菌對照； 同時，將剩余的40ml菌液用PBS洗2次，加I mL裂解緩沖液、10 μ I溶菌酶，將40ml菌液濃縮至4ml，超聲波裂解濃縮菌液后12000 rpm離心I min，沉淀用PBS重懸加入40 μ I的I XSDS上樣緩沖液，上清加入等量的2XSDS上樣緩沖液，煮沸5 min，冰浴2 min,-20°C備用。
3.根據(jù)權利要求2所述的簡單異尖線蟲Anis 4抗原基因的克隆和表達方法，其特征在于:超聲波裂解濃縮菌液的條件為200 W，處理4 S，間隔4 S，共99次。
4.根據(jù)權利要求1或2或3所述的簡單異尖線蟲Anis 4抗原基因的克隆和表達方法，其特征在于:RT_PCR擴增的反應體系為:10XPCR buffer 5 μ I, IOmM dNTPs 4μ I,ANCE-Up I μ I, ANCE-Down I μ I, cDNA 2 μ 1，ddH20 36.5 μ 1，5 U/ μ I Taq 酶 0.5 μ 1，總體積 50.0μ I ;擴增程序:94°C 5min — 94 °C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin, 30 個循環(huán)—72°C IOmin。
【文檔編號】C12N15/70GK103993004SQ201410027151
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年1月21日 優(yōu)先權日:2014年1月21日
【發(fā)明者】李孝軍, 王素華, 張明哲, 杜愛芳, 陳璐敏, 周圓, 洪青林, 唐行忠 申請人:舟山出入境檢驗檢疫局綜合技術服務中心