一種異尖科三種線蟲多重pcr檢測(cè)方法

一種異尖科三種線蟲多重pcr檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)和動(dòng)物檢疫【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種異尖科三種線蟲多重PCR檢測(cè)方法。本發(fā)明根據(jù)公布的對(duì)盲囊線蟲，簡(jiǎn)單異尖線蟲和宮脂線蟲核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)(ITS-1、5.8S、ITS-2)序列設(shè)計(jì)特異性引物，建立異尖科三種線蟲的多重PCR反應(yīng)，對(duì)線蟲樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增并將產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體后測(cè)序。結(jié)果表明，擴(kuò)增的目的片段大小符合預(yù)期的設(shè)計(jì)，與預(yù)期擴(kuò)增序列同源性分別達(dá)到96.2%、99.1%和99.9%。該多重PCR檢測(cè)方法的特異性強(qiáng)，不能在除了檢測(cè)的三種線蟲之外的其他線蟲DNA中擴(kuò)增出條帶；敏感性高，宮脂線蟲能夠檢測(cè)到的最低濃度為500pg/μL，而對(duì)盲囊線蟲和異尖線蟲能夠檢測(cè)到的最低濃度則為50pg/μL。
【專利說(shuō)明】—種異尖科三種線蟲多重PCR檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)和動(dòng)物檢疫【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種異尖科三種線蟲多重PCR檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]異尖線蟲病的病原的確定具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義，在《中華人民共和國(guó)進(jìn)境動(dòng)物一、二類傳染病、寄生蟲病名錄》中所分類的可引起人異尖線蟲病的主要有6類線蟲，SP簡(jiǎn)單異尖線蟲、典型異尖線蟲、抹香鯨異尖、偽地新線蟲、對(duì)盲囊線蟲和宮脂線蟲。在線蟲的分類鑒定方法中，形態(tài)學(xué)鑒定是對(duì)異尖線蟲進(jìn)行分類鑒定的傳統(tǒng)方法。但是由于魚體內(nèi)存在不同發(fā)育期的幼蟲，其形態(tài)、結(jié)構(gòu)存在很大差異，致使目前各屬異尖線蟲的鑒定存在很大的混亂，依據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定，很難將異尖科的線蟲和其他種類的線蟲進(jìn)行區(qū)分，因此該檢測(cè)方法并非檢測(cè)異尖線蟲的理想方法，只有通過(guò)應(yīng)用更快捷和特異的方法對(duì)異尖線蟲的種屬進(jìn)行鑒定。
[0003]多重PCR是指在同一 PCR反應(yīng)體系中加入兩對(duì)或者兩對(duì)以上的引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)，該技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)菌性、病毒性、寄生蟲性疾病等的診斷，被公認(rèn)為是一種方便、快速、敏感、特異的診斷方法。相關(guān)研究表明，異尖科線蟲核糖體 DNA 的內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)(internal transcribed spacer ITS_1、5.8S、ITS-2)序列在線蟲進(jìn)化的過(guò)程中顯示出種的特異性，在分類鑒定中發(fā)揮重要的作用。
[0004]在東海海域魚類感染的異尖科線蟲中，感染病原主要以異尖線蟲、對(duì)盲囊線蟲和宮脂線蟲的幼蟲為主，為了能夠準(zhǔn)確的鑒別異尖科線蟲，該研究建立了異尖科三種線蟲的多重PCR檢測(cè)體系。根據(jù)對(duì)盲囊線蟲、異尖線蟲和宮脂線蟲的核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)設(shè)計(jì)特異性的引物，采用多重PCR的方法，對(duì)舟山地區(qū)被檢魚類的感染蟲種進(jìn)行鑒定，建立異尖科三種線蟲的多重PCR檢測(cè)方法，為魚類感染異尖科線蟲的檢測(cè)、鑒定和流行病學(xué)調(diào)查提供了有力的技術(shù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供一種特異性強(qiáng)、敏感性高的異尖科三種線蟲多重PCR檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法主要用于對(duì)盲囊線蟲、簡(jiǎn)單異尖線蟲、宮脂線蟲的檢測(cè)。
[0006]本發(fā)明還提供一種用于同時(shí)檢測(cè)對(duì)盲囊線蟲、簡(jiǎn)單異尖線蟲、宮脂線蟲的引物。
[0007]本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是:
[0008]一種異尖科三種線蟲多重PCR檢測(cè)方法，所述方法不包括疾病診斷方法，其特征在于包括如下步驟:
[0009]①對(duì)盲囊線蟲、簡(jiǎn)單異尖線蟲、宮脂線蟲的蟲體DNA提??；
[0010]②引物設(shè)計(jì)與篩選:設(shè)計(jì)的引物序列為:
[0011]對(duì)盲囊線蟲的特異性引物:
[0012]上游引物Contra F:5-GGATATGCGGGCGTGTTGAT-3 (SEQ ID N0.1),[0013]下游引物Contra R:5-CGTTCAAACCAGACAAGGAGC-3 (SEQ ID N0.2),
[0014]異尖線蟲的特異性引物:
[0015]上游引物Anisk F:5-CCGTCAGTTGCGATGAAAGAT_3 (SEQ ID N0.3),
[0016]下游引物Anisk R:5-CCCTACGAAATGGCATACTTG-3 (SEQ ID N0.4),
[0017]宮脂線蟲的特異性引物:
[0018]上游引物Hystero F:5-GGGGCATAGGTGACATACTGG_3 (SEQ ID N0.5),
[0019]下游引物Hystero R:5-ACCACCAGCAGCACATCACC_3 (SEQ ID N0.6),
[0020]③對(duì)步驟②所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)條件優(yōu)化，得到最佳多重PCR模式；
[0021]④按照步驟③的最佳PCR反應(yīng)條件進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增特異性驗(yàn)證；
[0022]⑤按照步驟③的最佳PCR反應(yīng)條件進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增特異性驗(yàn)證；
[0023]⑥按照步驟③的最佳PCR反應(yīng)條件進(jìn)行PCR敏感性驗(yàn)證。
[0024]作為優(yōu)選，步驟①中蟲體DNA提取方法為:將魚體中采集的線蟲樣本用蒸餾水洗凈后，應(yīng)用DNA試劑盒進(jìn)行DNA的提取，將提取的線蟲的DNA置_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0025]作為優(yōu)選，步 驟③中，所述的PCR反應(yīng)條件優(yōu)化具體方法為:選擇25 μ I的PCR反應(yīng)體系，體系包含 5U/μ I 的 Taq聚合酶0.5 μ 1、10XPCR Buffer2.5 μ IUOmM dNTPl.6μ 1、模板DNA2y 1、工作濃度為20μΜ的引物0.4μ I ;退火溫度根據(jù)引物Tm值范圍進(jìn)行51°C、52 °C、53 °C、54°C、55 °C、56 °C、57 °C、58 °C退火溫度梯度試驗(yàn)，根據(jù)實(shí)際PCR反應(yīng)結(jié)果，確定最佳的退火溫度；引物濃度的調(diào)整:初次三種線蟲采用相同的引物濃度，根據(jù)反應(yīng)的結(jié)果，進(jìn)行各引物濃度的調(diào)整，確定最佳的濃度。
[0026]作為優(yōu)選，步驟③中，所述的最佳多重PCR反應(yīng)條件為:25μ I的PCR反應(yīng)體系，體系包含 5υ/μ I 的 Taq 聚合酶 0.5μ 1U0XPCR Buffer2.5 μ 1、IOmM dNTP 各 1.6μ 1、20 μ M的對(duì)盲囊線蟲上下游引物各0.8 μ 1、簡(jiǎn)單異尖線蟲上下游引物各0.4μ 1、宮脂線蟲上下游引物各0.4 μ 1、三種線蟲模板DNA2 μ 1，加蒸餾水至25 μ 1，多重PCR檢測(cè)擴(kuò)增程序:940C 5min — 94°C 30sec, 55.(TC 30sec, 72°C lmin, 30 個(gè)循環(huán)—72°C IOmin0
[0027]用于同時(shí)檢測(cè)對(duì)盲囊線蟲、簡(jiǎn)單異尖線蟲、宮脂線蟲的引物，其特征在于其序列為:
[0028]對(duì)盲囊線蟲的特異性引物:
[0029]上游引物Contra F:5-GGATATGCGGGCGTGTTGAT-3 (SEQ ID N0.1),
[0030]下游引物Contra R:5-CGTTCAAACCAGACAAGGAGC-3 (SEQ ID N0.2),
[0031]異尖線蟲的特異性引物:
[0032]上游引物Anisk F:5-CCGTCAGTTGCGATGAAAGAT_3 (SEQ ID N0.3),
[0033]下游引物Anisk R:5-CCCTACGAAATGGCATACTTG_3 (SEQ ID N0.4),
[0034]宮脂線蟲的特異性引物:
[0035]上游引物Hystero F:5-GGGGCATAGGTGACATACTGG_3 (SEQ ID N0.5),
[0036]下游引物Hystero R:5-ACCACCAGCAGCACATCACC_3 (SEQ ID N0.6)。
[0037]與常規(guī)PCR相比，多重PCR不但保持了較高的特異性和敏感性，而且更加方便、快捷和經(jīng)濟(jì)，一次反應(yīng)可檢測(cè)多個(gè)基因。尤其是在檢測(cè)病原體的多重感染、流行病學(xué)調(diào)查、病原體的分型鑒定等方面具有常規(guī)PCR無(wú)可比擬的優(yōu)越性。很多單一的PCR已經(jīng)被組合為多重PCR應(yīng)用于實(shí)踐。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，很多病原體特異性保守基因序列已經(jīng)被獲得，多重PCR技術(shù)將會(huì)有更加廣闊的應(yīng)用前景。
[0038]引物選擇方面，本實(shí)驗(yàn)利用所設(shè)計(jì)的三對(duì)引物建立的檢測(cè)異尖科三種線蟲的多重PCR方法，其中引物Contra FXontra R為對(duì)盲囊線蟲特異性，引物Anis F、Anis R為異尖線蟲特異性，引物Hyster F.Hyster R為宮脂線蟲特異性。本方法不僅可以分別擴(kuò)增對(duì)盲囊線蟲、異尖線蟲以及宮脂線蟲的DNA片段，還可以同時(shí)擴(kuò)增并區(qū)分這三種線蟲的混合DNA。本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的引物不能擴(kuò)增偽地線蟲、秀麗線蟲和附紅細(xì)胞體等其他病原的DNA，具有良好的特異性，這與引物設(shè)計(jì)選擇的線蟲核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)序列高度保守有關(guān)。采用該檢測(cè)體系，能夠在魚類混合感染異尖科線蟲時(shí)，對(duì)感染的蟲種能夠進(jìn)行特異性的鑒定，從而避免了肉眼觀察判定所帶來(lái)的誤差。該實(shí)驗(yàn)方法的建立為魚類感染異尖科線蟲的檢測(cè)、鑒定和流行病學(xué)調(diào)查提供了有力的技術(shù)支持。
[0039]引物設(shè)計(jì)方面，單一 PCR只能鑒定一種蟲種，但多重PCR可區(qū)別三種或者更多的不同類型的蟲種。在這過(guò)程中，引物是決定PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度、位置和結(jié)果的關(guān)鍵，引物設(shè)計(jì)也就更為重要。不同于單重PCR的引物設(shè)計(jì)，多重PCR對(duì)引物設(shè)計(jì)有著更高的要求。由于異尖科線蟲核糖體 DNA 的內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)(internal transcribed spacer ITS_1、5.8S、ITS-2)序列在線蟲進(jìn)化的過(guò)程中顯示出種的特異性，該區(qū)域的序列高度保守，所以可以采用該區(qū)域的基因來(lái)進(jìn)行多重PCR引物的設(shè)計(jì)。在設(shè)計(jì)的過(guò)程中，引物的(G+C)%含量組成應(yīng)均勻，盡量避免含有相同的堿基多聚體。兩個(gè)引物中(G+C)%含量應(yīng)盡量相似，在已知擴(kuò)增片段(G+C)%含量時(shí)宜接近于待擴(kuò)增片段，一般以40%~60%為佳。引物內(nèi)部應(yīng)避免形成明顯的次級(jí)結(jié)構(gòu)，尤其是發(fā)夾結(jié)構(gòu)。引物3’端配對(duì)DNA聚合酶是在引物3’端添加單核苷酸，所以引物3’端5~6個(gè)堿基與靶DNA的配對(duì)要求必須精確和嚴(yán)格，這樣才能保證PCR有效擴(kuò)增。多重PCR組合的設(shè)計(jì):各對(duì)引物應(yīng)有相同的退火溫度；各產(chǎn)物之間片段大小應(yīng)該有適當(dāng)?shù)牟罹?，以在聚丙烯酰胺凝膠電泳上能夠清晰的分開為原則；擴(kuò)增片段一般在150bp以上，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度相差最好在50bp以上，以便于瓊脂糖凝膠電泳時(shí)觀察分辨。引物設(shè)計(jì)完成后，最好到互聯(lián)網(wǎng)上進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，保證引物序列和靶基因之間是高度特異的。
[0040]多重PCR的反應(yīng)條件的優(yōu)化要比單一的PCR復(fù)雜的多，這也是多重PCR成功的關(guān)鍵。先進(jìn)行單一的PCR反應(yīng)，分別設(shè)定各引物的最佳反應(yīng)條件。通過(guò)對(duì)單一 PCR反應(yīng)的條件進(jìn)行摸索，然后選擇公共的反應(yīng)條件進(jìn)行三重的摸索，不斷的調(diào)整反應(yīng)條件，直至所有的引物都能夠在同一條件下正確擴(kuò)增。在PCR反應(yīng)體系中，引物用量、Mg2+濃度、Taq聚合酶用量、退火溫度及循環(huán)次數(shù)等因子對(duì)擴(kuò)增結(jié)果都有較大影響，PCR中各種反應(yīng)成份的最佳量是PCR成功的關(guān)鍵。通常，多重PCR中反應(yīng)成份如DNA聚合酶、dNTP等都要增加，但要適度，有時(shí)過(guò)量會(huì)抑PCR反應(yīng)。另外，不同PCR反應(yīng)緩沖液也會(huì)明顯影響多重PCR反應(yīng)。體系容量大小可與單擴(kuò)增相同，如果引物量比較多，可適當(dāng)?shù)卦龃蠓磻?yīng)體系，如反應(yīng)總體積可為20μ I或25μ I。在建立的多重PCR方法中，使用相同濃度引物時(shí)，對(duì)盲囊線蟲DNA的擴(kuò)增效果較差，相應(yīng)提高其引物濃度后，使得擴(kuò)增效果得到了改善。[0041]本實(shí)驗(yàn)中采用將采用試劑盒提取的線蟲DNA稀釋100倍后作為模板，同時(shí)保證三種線蟲的DNA濃度大致相同，從而方便進(jìn)行各種反應(yīng)試劑及反應(yīng)條件的確定。未稀釋的高濃度DNA的或者10倍稀釋的DNA作為模板時(shí)，隨Taq DNA聚合酶、引物量的增加等其他反應(yīng)條件變化時(shí)，不能形成明顯的梯度差別。但采用100倍稀釋DNA作為模板，不同濃度的TaqDNA聚合酶、引物的PCR擴(kuò)增時(shí)根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果的明顯梯度變化，可初步判定出反應(yīng)的適宜條件。
[0042]本發(fā)明根據(jù)公布的對(duì)盲囊線蟲，簡(jiǎn)單異尖線蟲和宮脂線蟲核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)(ITS-U5.8S、ITS-2)序列設(shè)計(jì)特異性引物，建立異尖科三種線蟲的多重PCR反應(yīng)，對(duì)線蟲樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增并將產(chǎn)物克隆到PMD18-T載體后測(cè)序。結(jié)果表明，擴(kuò)增的目的片段大小符合預(yù)期的設(shè)計(jì)，與預(yù)期擴(kuò)增序列同源性分別達(dá)到96.2%,99.1%和99.9%。該多重PCR檢測(cè)方法的特異性強(qiáng)，不能在除了檢測(cè)的三種線蟲之外的其他線蟲DNA中擴(kuò)增出條帶；敏感性高，宮脂線蟲能夠檢測(cè)到的最低濃度為500pg/μ L，而對(duì)盲囊線蟲和異尖線蟲能夠檢測(cè)到的最低濃度則為50pg/yL。該檢測(cè)體系的成功構(gòu)建為魚類感染異尖科線蟲的檢測(cè)、鑒定和流行病學(xué)調(diào)查提供了有力的技術(shù)支持。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0043]圖1是對(duì)盲囊線蟲PCR圖，其中M:DL2000DNA Marker ；1:陰性對(duì)照；2:對(duì)盲囊線蟲DNA ；3:異尖線蟲DNA ；4:宮脂線蟲DNA ；
[0044]圖2是異尖線蟲PCR圖，其中M:DL2000DNA Marker ；1:陰性對(duì)照；2:異尖線蟲DNA ；3:對(duì)盲囊線蟲DNA ；4:宮脂線蟲DNA ；
[0045]圖3是宮脂線蟲PCR圖，其中M:DL2000DNA Marker ; 1:陰性對(duì)照；2:宮脂線蟲DNA ；3:對(duì)盲囊線蟲DNA ；4:異尖線蟲DNA ；
[0046]圖4是對(duì)盲囊線蟲重組質(zhì)粒PCR及酶切圖，其中M:1OObp DNA Marker ；1:陰性對(duì)照；2:重組質(zhì)粒PCR結(jié)果；3:酶切鑒定結(jié)果；
[0047]圖5是異尖線蟲 重組質(zhì)粒PCR及酶切圖，其中M:1OObp DNA Marker ； I:陰性對(duì)照；2:重組質(zhì)粒PCR結(jié)果；3:酶切鑒定結(jié)果；
[0048]圖6是宮脂線蟲重組質(zhì)粒PCR及酶切圖，其中M:1OObp DNA Marker ； I:陰性對(duì)照；
2:重組質(zhì)粒PCR結(jié)果；3:酶切鑒定結(jié)果；
[0049]圖7是對(duì)盲囊線蟲測(cè)序比對(duì)圖；
[0050]圖8是異尖線蟲測(cè)序比對(duì)圖；
[0051]圖9是宮脂線蟲測(cè)序比對(duì)圖；
[0052]圖10是多重PCR圖，其中M:100bp DNA Marker ；1:陰性對(duì)照；2:三種線蟲混合DNA ；3:異尖線蟲和對(duì)盲囊線蟲DNA ；4:對(duì)盲囊線蟲和宮脂線蟲DNA ；5:異尖線蟲和宮脂線蟲DNA ；6:秀麗線蟲DNA ；7:偽地線蟲DNA ；
[0053]圖11是特異性實(shí)驗(yàn)圖，其中M:100bp DNA Marker ；1:陰性對(duì)照；2:對(duì)盲囊線蟲DNA ；3:異尖線蟲DNA ；4:宮脂線蟲DNA ；5:偽地線蟲DNA ；6:秀麗線蟲DNA ；7:附紅細(xì)胞體DNA ；
[0054]圖12是敏感性試驗(yàn)圖，其中M:DL2000DNA Marker ；1:陰性對(duì)照；2:50ng/y L混合線蟲 DNA ；3:5ng/y L 線蟲 DNA ；4:500pg/μ L 線蟲 DNA ；5:50pg/μ L 線蟲 DNA ；6:5pg/y L線蟲 DNA ；7:0.5pg/ μ L 線蟲 DNA ；8:0.05pg/ μ L 線蟲 DNA。
【具體實(shí)施方式】
[0055]下面通過(guò)具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實(shí)施并不局限于下面的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護(hù)范圍。
[0056]在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所采用的設(shè)備和原料等均可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
[0057]實(shí)施例:
[0058]蟲體來(lái)源對(duì)盲囊線蟲、簡(jiǎn)單異尖線蟲、宮脂線蟲樣本由舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局提供。偽地新線蟲DNA樣本由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)朱興全教授惠贈(zèng)，秀麗線蟲DNA樣本由本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0059]主要試劑Takara universal Genomic DNA Extraction kit、10XPCR Buffer>dNTP,Taq聚合酶和限制性內(nèi)切酶BamH I和HindHI試劑、T4DNA連接酶、pMD18_T載體均購(gòu)自Takara公司；、DNA片斷回收試劑盒為上海生工公司產(chǎn)品。DNA片斷回收試劑盒為東盛公司產(chǎn)品。
[0060]主要儀器生化培養(yǎng)箱、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)、_70°C超低溫冰箱、PCR儀、PH計(jì)、電子天平、凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)、Millipore超濾純水系統(tǒng)等。
[0061]1、線蟲基因組DNA的提取
[0062]將魚體中米集的多種線蟲樣本用蒸懼水洗凈后，應(yīng)用Takara universal GenomicDNA Extraction kit試劑盒進(jìn)行DNA的提取:
[0063](I)取1-1OOmg動(dòng)物組織移入冰浴預(yù)冷的Collection tube中，用研磨棒磨成糊狀。
[0064](2)加入350 μ I的Solution A和0.9 μ I的RNase Al后用研磨棒快速研磨成勻漿。
[0065](3)加入350 μ I的Solution A講研磨棒上的勻楽7中入Collection tube中，充分震蕩混合后，65°C保溫5分鐘。
[0066](4)加入 400 μ I 的 Solution B，振蕩均勻。
[0067](5)加入1ml的4°C預(yù)冷的Solution C,充分混勻后，12000rpm離心2分鐘。
[0068](6)棄去上層有機(jī)相，再加入1ml的4°C預(yù)冷的Solution C，充分混勻后，12000rpm離心2分鐘。
[0069](7)棄去上層有機(jī)相，然后講水相溶液(無(wú)色下層)轉(zhuǎn)移到置于Collection tube上的Filter Cap中，12000rpm離心I分鐘。
[0070](8)棄去Fliter Cap,在濾液中加入400μ1的DB Buffer,混合均勻。
[0071](9)將試劑盒中的Spin Column安置于Collection tube上,將上述操作8混合溶液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，12000rpm離心I分鐘,棄濾液。
[0072](10)將 500 μ I 的 Rinse A 加入至 Spin Column, 12000rpm 離心 30 秒，棄濾液。
[0073](11)將 700 μ I 的 Rinse B 加入至 Spin Column, 12000rpm 離心 30 秒，棄濾液。 [0074](12)重復(fù)操作 11。
[0075](13)將Spin Column安置于新的1.5ml的離心管中，在Spin Column膜的中央處加入50-200 μ I的滅菌蒸懼水或Elution Buffer,室溫靜置I分鐘。
[0076](14) 12000rpm 離心 I 分鐘洗脫 DNA。
[0077]將提取的不同線蟲的DNA電泳觀察抽提效果，置_20°C保存?zhèn)溆?。[0078]2、rDNA序列分析及引物設(shè)計(jì)
[0079]參考Genbank上公布的對(duì)盲囊線蟲、異尖線蟲和宮脂線蟲的核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)(18S rRNA, ITS-1, 5.8S rRNA, ITS-2, 28S rRNA)序列，應(yīng)用 MegAlign 軟件將幾種線蟲的序列進(jìn)行比對(duì)，分析內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)序列中的各種線蟲相互之間的相同區(qū)域和不同區(qū)域，從而進(jìn)行特異性引物的設(shè)計(jì)。
[0080]在多重PCR引物設(shè)計(jì)中除了按常規(guī)PCR引物設(shè)計(jì)通用準(zhǔn)則外，要求引物與靶基因具有高度的特異性，引物之間彼此無(wú)同源性，不會(huì)出現(xiàn)交叉錯(cuò)配、引物二聚體等。設(shè)計(jì)的擴(kuò)增片段一般在150bp以上，不同擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度差最好在50bp以上。同時(shí)，設(shè)計(jì)的三對(duì)引物退火溫度都要相近。所設(shè)計(jì)的引物如下:
[0081]對(duì)盲囊線蟲:
[0082]上游引物Contra F:5-GGATATGCGGGCGTGTTGAT-3 (SEQ ID N0.1),
[0083]下游引物Contra R:5-CGTTCAAACCAGACAAGGAGC-3 (SEQ ID N0.2),
[0084]退火溫度為55.1°C，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為293bp。
[0085]異尖線蟲:
[0086]上游引物Anisk F:5-CCGTCAGTTGCGATGAAAGAT_3 (SEQ ID N0.3),
[0087]下游引物Anisk R:5-CCCTACGAAATGGCATACTTG_3 (SEQ ID N0.4),
[0088]退火溫度為53.6°C，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為562bp。
[0089]宮脂線蟲:
[0090]上游引物Hystero F:5-GGGGCATAGGTGACATACTGG_3 (SEQ ID N0.5),
[0091]下游引物Hystero R:5-ACCACCAGCAGCACATCACC_3 (SEQ ID N0.6),
[0092]退火溫度為55.6°C，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為795bp。
[0093]3、單重PCR反應(yīng)
[0094]應(yīng)用設(shè)計(jì)的三種線蟲的檢測(cè)引物分別進(jìn)行單重PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系中各試劑加入量如下:
[0095]
【權(quán)利要求】
1.一種異尖科三種線蟲多重PCR檢測(cè)方法，所述方法不包括疾病診斷方法，其特征在于包括如下步驟: ①對(duì)盲囊線蟲、簡(jiǎn)單異尖線蟲、宮脂線蟲的蟲體DNA提??； ②引物設(shè)計(jì)與篩選:設(shè)計(jì)的引物序列為: 對(duì)盲囊線蟲的特異性引物:
上游引物 Contra F: 5-GGATATGCGGGCGTGTTGAT-3 (SEQ ID N0.1),
下游引物 Contra R: 5-CGTTCAAACCAGACAAGGAGC-3 (SEQ ID N0.2), 異尖線蟲的特異性引物:
上游引物 Anisk F:5- CCGTCAGTTGCGATGAAAGAT-3 (SEQ ID N0.3),
下游引物 Anisk R:5- CCCTACGAAATGGCATACTTG-3 (SEQ ID N0.4), 宮脂線蟲的特異性引物:
上游引物 Hystero F:5_ GGGGCATAGGTGACATACTGG-3 (SEQ ID N0.5),
下游引物 Hystero R:5_ ACCACCAGCAGCACATCACC-3 (SEQ ID N0.6), ③對(duì)步驟②所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)條件優(yōu)化，得到最佳多重PCR模式； ④按照步驟③的最佳PCR反應(yīng)條件進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增特異性驗(yàn)證； ⑤按照步驟③的最佳PCR反應(yīng)條件進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增特異性驗(yàn)證； ⑥按照步驟③的最佳PCR反應(yīng)條件進(jìn)行PCR敏感性驗(yàn)證。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異尖科三種線蟲多重PCR檢測(cè)方法，其特征在于:步驟①中蟲體DNA提取方法為:將魚體中采集的線蟲樣本用蒸餾水洗凈后，應(yīng)用DNA試劑盒進(jìn)行DNA的提取，將提取的線蟲的DNA置_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異尖科三種線蟲多重PCR檢測(cè)方法，其特征在于:步驟③中，所述的PCR反應(yīng)條件優(yōu)化具體方法為:選擇25μ I的PCR反應(yīng)體系，體系包含5υ/μ I的Taq 聚合酶 0.5μ 1U0XPCR Buffer 2.5 μ IUOmM dNTP 1.6 μ 1、模板 DNA 2 μ 1、工作濃度為20 μ M的引物0.4 μ I ;退火溫度根據(jù)引物Tm值范圍進(jìn)行51 °C、52 °C、53 °C、54°C、55 °C、56°C、57°C、58°C退火溫度梯度試驗(yàn)，根據(jù)實(shí)際PCR反應(yīng)結(jié)果，確定最佳的退火溫度；引物濃度的調(diào)整:初次三種線蟲采用相同的引物濃度，根據(jù)反應(yīng)的結(jié)果，進(jìn)行各引物濃度的調(diào)整，確定最佳的濃度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異尖科三種線蟲多重PCR檢測(cè)方法，其特征在于:步驟③中，所述的最佳多重PCR反應(yīng)條件為:25μ I的PCR反應(yīng)體系，體系包含5U/μ I的Taq聚合酶0.5μ 1U0XPCR Buffer 2.5 μ IUOmM dNTP 各 1.6 μ 1、20 μ M 的對(duì)盲囊線蟲上下游引物各0.8 μ 1、簡(jiǎn)單異尖線蟲上下游引物各0.4μ 1、宮脂線蟲上下游引物各0.4μ 1、三種線蟲模板DNA 2 μ 1，加蒸餾水至25 μ 1，多重PCR檢測(cè)擴(kuò)增程序:94°C 5min —94°C 30sec,55.0°C30sec,72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)—72°C IOmin0
5.用于同時(shí)檢測(cè)對(duì)盲囊線蟲、簡(jiǎn)單異尖線蟲、宮脂線蟲的引物，其特征在于其序列為: 對(duì)盲囊線蟲的特異性引物:
上游引物 Contra F: 5-GGATATGCGGGCGTGTTGAT-3 (SEQ ID N0.1),
下游引物 Contra R: 5-CGTTCAAACCAGACAAGGAGC-3 (SEQ ID N0.2), 異尖線蟲的特異性引物:
上游引物 Anisk F:5- CCGTCAGTTGCGATGAAAGAT-3 (SEQ ID N0.3),下游引物 Anisk R:5- CCCTACGAAATGGCATACTTG-3 (SEQ ID N0.4),宮脂線蟲的特異性引物:上游引物 Hystero F:5_ GGGGCATAGGTGACATACTGG-3 (SEQ ID N0.5),下游引物 Hystero R:5_ ACCACCAGCAGCACATCACC-3 (SEQ ID N0.6)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103993067SQ201410026824
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年1月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月21日
【發(fā)明者】李孝軍, 周圓, 陳璐敏, 王素華, 杜愛(ài)芳, 洪青林, 唐行忠 申請(qǐng)人:舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心