含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液和制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液，以黃孢原毛平革菌菌體為被提取物，以磷酸鹽緩沖液為提取劑，將黃孢原毛平革菌菌體和磷酸鹽緩沖液混合，研磨，離心分離，得到含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液，包含超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶，本發(fā)明的抗氧化性能高，本發(fā)明還提供其制備方法，步驟是，稱取黃孢原毛平革菌菌體，轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器中，加入磷酸鹽緩沖液，研磨，離心，得上清液；再加入磷酸鹽緩沖液至玻璃勻漿器中，研磨，離心，得上清液；在上清液中加入磷酸鹽緩沖液定容，本發(fā)明工藝簡單。
【專利說明】含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液和制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及抗氧化組合物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是涉及到一種含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液和制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]活性氧是微生物生長代謝過程不可避免的產(chǎn)物，細(xì)胞內(nèi)最常見的活性氧包括超氧自由基(O2‘_)、過氧化氫(H2O2)以及羥自由基(.0Η)。在正常情況下，低水平的活性氧(ROS)是細(xì)胞行使生物學(xué)功能所必需的，因為ROS可參與細(xì)胞內(nèi)許多重要途徑的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控。但在某些特殊的情況下，比如細(xì)胞自身氧化還原代謝紊亂或外界離子輻射等原因就會造成細(xì)胞內(nèi)ROS的大量積聚。由于自由基高度的活潑性與極強的氧化反應(yīng)能力，能通過氧化作用來攻擊其所遇到的任何分子，這種過量的ROS可以攻擊蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及DNA，細(xì)胞內(nèi)自由基的積累還會引起膜脂過氧化，使機體內(nèi)大分子物質(zhì)產(chǎn)生過氧化變性，交聯(lián)或斷裂，從而引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。
[0003]在正常的生理情況下，體內(nèi)自由基不斷產(chǎn)生，同時細(xì)胞自身有自由基清除系統(tǒng)，可及時清除代謝產(chǎn)生的自由基而免受傷害，使之維持在一個正常的生理水平上。但在逆境下，比如重金屬脅迫條件下，一方面自由基產(chǎn)生過多，另一方面自由基清除系統(tǒng)會發(fā)生紊亂，從而使細(xì)胞受到傷害。大量研究已經(jīng)證實，細(xì)胞內(nèi)本身就具有清除多余自由基的能力，這主要是靠內(nèi)源性自由基清除系統(tǒng)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高效抗氧化的含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液和制備方法。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液，以黃孢原毛平革菌菌體為被提取物，以磷酸鹽緩沖液為提取劑，將黃孢原毛平革菌菌體和磷酸鹽緩沖液混合，研磨，離心分離，得到含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液，所述含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液中包含超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶，每10 ml含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液中，所述超氧化物歧化酶的活性為15~33U，所述谷胱甘肽過氧化物酶的活性為31~61 U，所述過氧化氫酶的活性為20~81 U。
[0006]黃孢原毛平革菌為黃孢原毛平革菌BKMF-1767，保藏號為CCTCC AF96007，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學(xué)。 [0007]所述黃孢原毛平革菌菌體的制備方法為，將黃孢原毛平革菌在30~35°C下培養(yǎng)3~5天,超純水清洗。
[0008]所述含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液為Iml時，使用的所述黃孢原毛平革菌菌體的質(zhì)量為10~100 mg。黃孢原毛平革菌體質(zhì)量和含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液的體積配比表示為黃孢原毛平革菌菌體濃度。
[0009]所述磷酸鹽緩沖液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，濃度為50mM，pH值為7。[0010]本發(fā)明還提供一種含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液的制備方法，步驟是，稱取黃孢原毛平革菌菌體，轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器中，加入磷酸鹽緩沖液，充分研磨，離心，得上清液；再加入磷酸鹽緩沖液至玻璃勻漿器中，充分研磨，離心，得上清液；合并上述上清液，在合并后的上清液中加入磷酸鹽緩沖液定容。
[0011]本發(fā)明的有益效果是， 1、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,簡稱SOD)是重要的活性氧防護(hù)酶,廣泛存在于各類生物體中，能催化生物體內(nèi)超氧自由基(02‘_)發(fā)生歧化反應(yīng)，是機體內(nèi)O2的天然消除劑，維持機體中自由基產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡，對機體細(xì)胞起保護(hù)作用，SOD將O2.—歧化成H2O2,再由CAT和過氧化物酶(POD)將H2O2分解成H2O和O2。SOD的活性和含量也在一定程度上反映了機體清除氧自由基的能力，對其進(jìn)行準(zhǔn)確測定，具有重要意義。
[0012]2、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶。GSH-Px催化還原型谷胱甘肽氧化與H2O2還原反應(yīng)，生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)，阻斷由脂氫過氧化物(LOOH)引發(fā)自由基的二級反應(yīng)，減少LOOH對生物體的損害，從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受活性氧的干擾及損害。
[0013]3、過氧化氫酶(CAT)是一類廣泛存在于動物、植物和微生物體內(nèi)的末端氧化酶，以過氧化氫為底物，通過催化一對電子的轉(zhuǎn)移而最終將其分解為水和氧氣，能夠高效催化H2O2分解，避免了 H2O2在體內(nèi)的積累，從而維持體內(nèi)正常的活性氧水平，具有清除生物體內(nèi)自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損害等作用。
[0014]本發(fā)明的含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液具有穩(wěn)定的抗氧化能力和自由基清除能力，能有效維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，并能緩解由細(xì)胞失去氧化還原平衡而引起的氧化損傷，用于保護(hù)細(xì)胞，抵抗自由基的毒性。
[0015]本發(fā)明的含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液對活性氧有著獨特的親附性，具有較好的溶解性，分子量小，能滲透到細(xì)胞中，在細(xì)胞的某一氧化損傷位點定點作用，并且能夠被細(xì)胞再生，從而起到保護(hù)作用。
[0016]本發(fā)明的含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液的制備方法，工藝簡單，操作方便。
[0017]本發(fā)明的黃孢原毛平革菌為黃孢原毛平革菌BKMF-1767，保藏號為CCTCCAF96007，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學(xué)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為本發(fā)明的含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液的抗氧化酶活性。
[0019]圖2為本發(fā)明的含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液的總抗氧化能力效果圖。
[0020]圖3為本發(fā)明的含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液對H2O2和.0H的清除效果圖。
【具體實施方式】
[0021]實施例1
一種含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液，以黃孢原毛平革菌菌體為被提取物，以磷酸鹽緩沖液(50 mM, pH 7.0)為提取劑，將黃孢原毛平革菌菌體和磷酸鹽緩沖液混合，研磨，離心分離，得到含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液，黃孢原毛平革菌為黃孢原毛平革菌BKMF-1767，保藏號為CCTCC AF96007，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學(xué)。所述含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液中包含超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶，每10 ml含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液中，所述超氧化物歧化酶的活性為33U，所述谷胱甘肽過氧化物酶的活性為61 U，所述過氧化氫酶的活性為81 U。
[0022]制備方法包括如下步驟:
(I)無菌條件下，在100 ml Kirk培養(yǎng)基中接種2ml黃孢原毛平革菌孢子懸浮液，30°C下培養(yǎng)5天。
[0023]Kirk 培養(yǎng)基的具體成分為，KH2PO4 2.0 g, MgSO4.7H20 0.71 g, VB1 (維生素 BI)
0.01 g，酒石酸銨0.2 g，葡萄糖10 g;微量元素液70 ml;緩沖溶液850 ml，緩沖溶液為20 mmol/L的酒石酸鈉緩沖液:3.0018 g酒石酸/1000 ml，用3% (m/v)的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5 ;用水定容至1L。
[0024]其中，微量元素的成分為:NaCl1.0 g, CoCl2.6H20 0.18 g, Na2MoO4.2H20 0.01g, ZnSO4.7H20 0.1 g, CaCl2 0.1 g, CuSO4.5H20 0.01 g, , MnSO4.H2O 0.5 g, FeSO4.7H20
0.1 g, AlK (SO4)2.12H20 0.01 g，MgSO4.7Η20 3.0 g，H3BO3 0.018，甘氨酸1.5 g，用水定容
至IL0
[0025](2)收集黃孢原毛平革菌菌體，無菌超純水清洗3遍，濾去水分，并用濾紙吸干黃孢原毛平革菌菌體表面的水分，分別稱取0.1 g黃孢原毛平革菌菌體，轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器中，分別加入4 ml磷酸鹽緩沖液(50 mM,pH 7.0),充分研磨,在10000 rpm下高速旋轉(zhuǎn)離心10 min,取上清液。
[0026](3)將上清液轉(zhuǎn)移至離心管中，再加入4 ml磷酸鹽緩沖液(50 mM,pH 7.0)至玻璃勻衆(zhòng)器中，在10000 rpm下高速旋轉(zhuǎn)離心10 min,取上清液；將兩次上清液充分混合,加入適量磷酸鹽緩沖液(50 mM,pH 7.0)定容至10 ml，得到含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液。
[0027]實施例2
一種含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液，以黃孢原毛平革菌菌體為被提取物，以磷酸鹽緩沖液(50 mM, pH 7.0)為提取劑，將黃孢原毛平革菌菌體和磷酸鹽緩沖液混合，研磨，離心分離，得到含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液，黃孢原毛平革菌為黃孢原毛平革菌BKMF-1767，保藏號為CCTCC AF96007，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國.武漢.武漢大學(xué)。所述含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液中包含超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶，每10 mL含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液中，所述超氧化物歧化酶的活性為15U，所述谷胱甘肽過氧化物酶的活性為32 U，所述過氧化氫酶的活性為20 U。
[0028]制備方法包括如下步驟:
(I)無菌條件下，在100 ml Kirk培養(yǎng)基中接種5 ml黃孢原毛平革菌孢子懸浮液，35°C下培養(yǎng)5天。
[0029](2)收集黃孢原毛平革菌菌體，無菌超純水清洗5遍，濾去水分，并用濾紙吸干黃孢原毛平革菌菌體表面的水分，分別稱取1.0 g黃孢原毛平革菌菌體，轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器中，分別加入4 ml磷酸緩沖液(50 mM,pH 7.0),充分研磨,在15000 rpm下高速旋轉(zhuǎn)離心5min,取上清液。
[0030](3)將上清液轉(zhuǎn)移至離心管中，再加入4 ml磷酸緩沖液(50 mM,pH 7.0)至玻璃勻衆(zhòng)器中，在15000 rpm下高速旋轉(zhuǎn)離心5 min,取上清液；將兩次上清液充分混合,加入適量磷酸緩沖液(50 mM, pH 7.0)定容至10 ml，得到含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液。
[0031]實施例3 超氧化物歧化酶測定
①鄰苯三酚自氧化速率的測定:在25 °C下加入2.5 ml緩沖液(0.1 M Tris-HCl, pH8.0)，超純水0.1 ml，加入25°C預(yù)熱過的鄰苯三酚0.15 ml，迅速搖勻，倒入光徑I cm的比色杯內(nèi)，在320 nm波長下每隔30 s測吸光度值(A值)一次，以緩沖液(0.1 M Tris-HCl,pH 8.0)作為對照樣，測定鄰苯三酚自氧化速率。
[0032]②SOD酶活性測定:
以每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50%的酶量定義為一個SOD活性單位，以U表示。
[0033]測定方法為，在25°C下加入2.5ml緩沖液(0.1M Tris-HCl, pH為8.0)，含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液0.1ml，加入25°C預(yù)熱過的鄰苯三酚0.15ml，總體積為2.75ml,迅速搖勻，倒入光徑為Icm的比色杯內(nèi)，在320nm波長下每隔30s測吸光度值(A值)一次，以Tris-HCl緩沖液為對照樣，測定含抗氧化酶的含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液存在下，鄰苯三酚的氧化速率。
[0034]SOD酶活性 計算:
SOD酶活性(U) =[(鄰苯三酚自氧化速率-鄰苯三酚的氧化速率)/鄰苯三酚自氧化速率]*總體積(ml) / (含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液體積(ml) *50%)。
[0035]超氧化物歧化酶測定實驗結(jié)果如圖1所示，含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液中的超氧化物歧化酶活性較高，其中，黃孢原毛平革菌菌體濃度為10 mg/ml時，超氧化物歧化酶(SOD)活性為15.65 U ;黃孢原毛平革菌菌體濃度為30 mg/ml時，SOD活性為21.56 U ；黃孢原毛平革菌菌體濃度為100 mg/ml時，SOD活性為32.01 U。
[0036]谷胱甘肽過氧化物酶測定
取含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液0.4 ml加入離心管中，加入I mM GSH 0.4 ml。離心管置于37 °C預(yù)溫5 min，然后加入已預(yù)溫至37 °〇的1.5 mM H2O2溶液0.2 ml，混勻并立即記錄反應(yīng)開始時間，繼續(xù)保溫5 min，反應(yīng)完畢后，立即依次加入質(zhì)量濃度為1.67%的偏磷酸沉淀液4.0 ml,使蛋白酶失活。以3000 rpm/min離心10 min,取出上清液2 ml,加Λ 0.32 M Na2HPO4沉淀液2.5 ml，與5，5- 二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)試劑0.5 ml(I mM)混勻，反應(yīng)5 min，以超純水代替含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液作為空白樣調(diào)零，用UV-2550島津紫外分光光度計測定412 nm光波處測定光密度值，即OD412,計算GSH-Px活性。
[0037]GSH-Px活性(U)= 0D412*A*6.25/(5 (min)*含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液體積(ml))
其中，A:標(biāo)準(zhǔn) GSH(uM) / 標(biāo)準(zhǔn) GSH(OD412)。
[0038]谷胱甘肽過氧化物酶測定實驗結(jié)果如圖1所示，含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液中，谷胱甘肽過氧化物酶活性較高，其中，黃孢原毛平革菌菌體濃度為10 mg/ml時，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性為31.56 U，黃孢原毛平革菌菌體濃度為30 mg/ml時，GSH-Px活性為42.75 U，黃孢原毛平革菌菌體濃度為100 mg/ml時，GSH-Px活性為60.28U。
[0039]過氧化氫酶測定
取2.5 ml 0.1 mol/L，pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液，加入0.1 ml含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液，以PBS代替含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液為對照調(diào)零，以0.5 ml
0.1 M的過氧化氫啟動反應(yīng)，測定0D240 (測定40s)。以單位時間內(nèi)A24tl減少0.1的酶量為I個酶活單位(U)。
[0040]CAT 活性(U) = [ Λ Α240 XVt]/ (Vs X 0.1 X t)
AA24tl:為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化；t為反應(yīng)時間(min) ;Vt為含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液總體積(ml );Vs為測定時取用的含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液體積(ml)。
[0041]過氧化氫酶測定實驗結(jié)果如圖1所示，含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液中，過氧化氫酶活性較高，黃孢原毛平革菌菌體濃度為10 mg/ml時，過氧化氫酶(CAT)活性為20.76 U ;黃孢原毛平革菌菌體濃度為30 mg/ml時，CAT活性為45.43 U ;黃孢原毛平革菌菌體濃度為100 mg/ml時，CAT活性為89.95 U。
[0042]實施例4 總抗氧化能力測定 ABTS.+自由基的生成:
0.549 g 2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)溶解在100 ml配制的過氧化氫溶液中(10 _01/1)，室溫下(25~30°0避光靜置I小時，有特征的藍(lán)綠色的ABTS ‘ +產(chǎn)生，保存至4°C冰箱中備用。
[0043]總抗氧化能力測定步驟:
取10 mmol/L的ABTS‘+，用醋酸鈉鹽緩沖液(pH 3.6)稀釋至734 nm下吸光度為
0.70±0.02。取上述制備的不同濃度的含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液50 ul，加入3ml ABTS.+溶液，得反應(yīng)液，準(zhǔn)確震蕩30 S，在30°C下測定反應(yīng)液在734 nm處3 min內(nèi)吸光度值的變化，以超純水代替含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液作為空白對照樣，計算含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液的總抗氧化能力(ΛΑ)。
[0044]總抗氧化能力實驗結(jié)果如圖2所示，顯示含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液具有一定的抗氧化能力，且隨著黃孢原毛平革菌菌體濃度的增加，抗氧化能力得到有效增強。
[0045]對O2的清除能力測定
取2.5 ml Tris-HCl緩沖液(0.1 Μ,ρΗ 8.0)，加入含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液0.1 ml，加入25°C預(yù)熱過的鄰苯三酚0.15 ml，迅速搖勻，倒入比色杯內(nèi)，以超純水代替鄰苯三酚作為對照樣，在320 nm波長下測定3 min內(nèi)的吸光度變化值(Λ AtlX
[0046]Ο/ —清除能力實驗結(jié)果如圖3所示，顯示含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液對O2具有一定的清除能力，清除率可達(dá)52%。
[0047]對H2O2的清除能力測定
取I ml含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液，加入到初始濃度Ctl為20 mg/L的H2O2溶液中，黑暗條件下振蕩降解1h，測定剩余的H2O2濃度Ct，計算其清除能力。
[0048]H2O2 清除能力=(C0-Ct) / C0* 100%其中，Ctl為H2O2初始濃度，Ct為降解I h后的H2O2濃度。
[0049]H2O2清除能力實驗結(jié)果如圖3所示，顯示含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液對H2O2具有很強的清除能力，清除率接近95%。
[0050]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅局限于上述實施例，凡屬于本發(fā)明思路下的技術(shù)方案均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。應(yīng)該指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來 說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下的改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液，其特征是，以黃孢原毛平革菌菌體為被提取物，以磷酸鹽緩沖液為提取劑，將黃孢原毛平革菌菌體和磷酸鹽緩沖液混合，研磨，離心分離，得到含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液，所述含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液中包含超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶，每10 ml含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液中，所述超氧化物歧化酶的活性為15~33 U，所述谷胱甘肽過氧化物酶的活性為31~61 U，所述過氧化氫酶的活性為20~81 U。
2.如權(quán)利要求1所述的含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液，其特征是，黃孢原毛平革菌為黃孢原毛平革菌BKMF-1767，保藏號為CCTCC AF96007，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。
3.如權(quán)利要求1或2所述的含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液，其特征是，所述黃孢原毛平革菌菌體的制備方法為，將黃孢原毛平革菌在30~35°C下培養(yǎng)3~5天，超純水清洗。
4.如權(quán)利要求1或2所述的含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液，其特征是，所述含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液為Iml時，使用的所述黃孢原毛平革菌菌體的質(zhì)量為10~100 mgο
5.如權(quán)利要求1或2所述的含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液，其特征是，所述磷酸鹽緩沖液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，濃度為50mM, pH值為7。
6.—種如權(quán)利要求1-5任一種所述的含抗氧化酶的黃孢原毛平革菌提取液的制備方法，其特征是，稱取黃孢原毛平革菌菌體，轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器中，加入磷酸鹽緩沖液，充分研磨，離心，得上清液；再加入磷酸鹽緩沖液至玻璃勻漿器中，充分研磨，離心，得上清液；合并上述上清液，在合并后的上清液中加入磷酸鹽緩沖液定容。
【文檔編號】C12N9/02GK103789279SQ201410024331
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月20日
【發(fā)明者】劉亮, 許飄, 陳明, 曾光明, 黃丹蓮, 賴萃, 趙美花, 黃超, 李寧杰, 危臻 申請人:湖南大學(xué)