一種使用重組耶氏解脂酵母菌株生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法

一種使用重組耶氏解脂酵母菌株生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種使用重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法，該方法包括平板活化培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)、由菌體提取脂肪與由發(fā)酵上清液提取脂肪等步驟。使用較廉價(jià)的紅花籽油代替昂貴的游離LA作為發(fā)酵用底物，既能提高t10，c12-CLA的產(chǎn)量，又能很大程度降低發(fā)酵成本，因此，本發(fā)明使用重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法具有非常好的應(yīng)用前景。
【專利說明】—種使用重組耶氏解脂酵母菌株生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001]本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地，本發(fā)明涉及一種使用重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法。
【【背景技術(shù)】】
[0002]共軛亞油酸(Conjugated linoleic acid, CLA)是由一系列含有共軛雙鍵、具有位置和幾何異構(gòu)的十八碳二烯酸的總稱，是必需脂肪酸亞油酸(Linoleic acid, LA)的立體幾何異構(gòu)體，也可看作是亞油酸的次生衍生物。CLA具有多種異構(gòu)體形式，其中cis-9，trans-11-CLA (c9，tll-CLA)、trans_10，cis-12-CLA (tlO，cl2_CLA)兩種異構(gòu)體是含量最多并且確認(rèn)具有生理活性功能的共軛亞油酸單體。CLA作為一種新型的脂肪酸，其生理功能已逐漸被人們所認(rèn)同。CLA具有包括抗癌、抗動(dòng)脈粥樣硬化、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)以及抑制脂肪積累等對(duì)人類健康有益的效果，并且CLA能夠提高飼料效價(jià)防霉變作用而被廣泛的研究。
[0003]因?yàn)镃LA具有多種獨(dú)特的生理功能，被譽(yù)為“21世紀(jì)的新型營(yíng)養(yǎng)素”，越來越多地引起了世界各國(guó)政府及科研工作者的重視，美國(guó)、加拿大等國(guó)已經(jīng)開始把CLA作為營(yíng)養(yǎng)添加劑大量用于農(nóng)業(yè)及食品工業(yè)。CLA正成為藥物、食品、飼料等研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。由于天然CLA主要存在于反芻動(dòng)物乳制品中，含量非常低；而通過堿催化異構(gòu)化等化學(xué)方法合成的CLA是多種異構(gòu)體的混合物，較難分離純化具有活性功能的異構(gòu)體；所以，研究生物轉(zhuǎn)化法獲得成分單一的功能CLA具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0004]到目前為止，c9, 111-CLA生物合成的最高產(chǎn)量是Shimizu研究小組通過Delacroixia coronata菌株的delta-9脫飽和酶作用，以33.3mg/mL異油酸(trans-11-octadecenoic acid, t_0A)為底物轉(zhuǎn)生產(chǎn)了 10mg/mL 的 CLA,其中 98% 為 c9,111-CLA ;而tlO，C12-CLA生物合成的最高產(chǎn)量是江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心陳衛(wèi)研究小組構(gòu)建的重組耶氏解脂酵母菌株(CCFM-JU277-9)，通過添加20g/L大豆油，在5L發(fā)酵罐中發(fā)酵38.5h得到CLA的最高產(chǎn)量為4g/L，其中全部為tlO，cl2_CLA。由于CCFM-JU277-9能夠在胞內(nèi)合成亞油酸異構(gòu)酶(PAI)，并催化LA形成專一的tlO，cl2-CLA單體形式，因此增加底物L(fēng)A的含量將有助于增加tlO，C12-CLA的產(chǎn)量。
[0005]因此，本發(fā)明希望通過在培養(yǎng)基中添加LA含量較高的廉價(jià)植物油、優(yōu)化植物油的添加時(shí)間及添加量，從而實(shí)現(xiàn)提高tio, C12-CLA產(chǎn)量的目標(biāo)。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0006][要解決的技術(shù)問題]
[0007]本發(fā)明的目的是提供一種使用重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法。
[0008][技術(shù)方案]
[0009]本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。[0010]本發(fā)明涉及一種使用重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法。
[0011]所述生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法的步驟如下:
[0012]A、平板活化培養(yǎng)
[0013]使用接菌環(huán)將重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接種于裝在平板中的固體培養(yǎng)基上，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中在溫度20~32°C的條件下平板活化培養(yǎng)2~6天，得到平板培養(yǎng)物；
[0014]B、種子培養(yǎng)
[0015]使用接菌環(huán)挑取在步驟A平板活化培養(yǎng)的培養(yǎng)物接種到液體種子培養(yǎng)基中，然后置于試管中，在溫度20~32°C與150~250rpm的條件下培養(yǎng)40~52小時(shí)；
[0016]C、發(fā)酵培養(yǎng)
[0017]按照以發(fā)酵培養(yǎng)基體積計(jì)0.5%~2.0%接種量，將步驟B得到的種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于發(fā)酵錐形瓶中在溫度20~32°C與150~250rpm的條件下震蕩培養(yǎng)，在發(fā)酵0-45小時(shí)期間添加終濃度為10~70g/L的乳化植物油，震蕩培養(yǎng)48~100小時(shí)，得到一種發(fā)酵培養(yǎng)物，它在7500~8500rpm的條件下離心分離10~18分鐘，得到菌體與發(fā)酵上清液；
[0018]所述的菌體使用以重量計(jì)0.70~1.00%NaCl水溶液洗滌2~3次，得到的洗滌液與所述的發(fā)酵上清液合并，合并的發(fā)酵上清液用于后續(xù)處理；洗滌的菌體接著進(jìn)行凍干；
[0019]D、由菌體提取脂肪
[0020]按照以mg計(jì)凍干菌體與以ml計(jì)8~12%鹽酸-甲醇溶液之比為20~50:0.5~1.5，讓步驟C所得到的凍干菌體與8~12%鹽酸-甲醇溶液在溫度45~-65°C的條件下進(jìn)行甲酯化2.5~3.5小時(shí)，然后加入與鹽酸-甲醇溶液等體積的正己烷提取5~15分鐘，接著在5000~7000rpm的條件下離心分離2~5分鐘,在分離上清液后所得到的殘余物再重復(fù)上述提取操作I~2次，分離上清液合并，用氮?dú)獯蹈桑玫剿龅暮泄曹梺営退岬闹舅峒柞ィ?br> [0021]E、由發(fā)酵上清液提取脂肪
[0022]按照以ml計(jì)發(fā)酵上清液與氯仿甲醇混合液之比為1:8.0~12.0，用按照體積比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并發(fā)酵上清液2~4次，提取液合并，用氮?dú)獯蹈?，再加入與氯仿甲醇混合液等體積的8~12%鹽酸-甲醇溶液在溫度45~65°C的條件下進(jìn)行甲酯化0.5~3小時(shí)，然后加入與鹽酸-甲醇溶液等體積的正己烷提取5~15分鐘，接著在3000~7000rpm的條件下離心分離2~5分鐘，在分離上清液后所得到的殘余物再重復(fù)上述提取操作I~2次，分離上清液合并，用氮?dú)獯蹈?，得到所述的含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯?br> [0023]根據(jù)本 發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的平板固體培養(yǎng)基制備方法如下:
[0024]按照20g/L葡萄糖、1.7g/L無(wú)硫酸銨無(wú)氨基酸酵母氮源、5g/L硫酸銨和20g/L瓊脂粉，將葡萄糖、無(wú)硫酸銨無(wú)氨基酸酵母氮源與硫酸銨溶解于蒸餾水中，再使用無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿水溶液將所得到溶液的PH調(diào)節(jié)至5.5，再加入瓊脂粉，然后在溫度115°C的條件下滅菌20mino
[0025]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的種子培養(yǎng)基制備方法如下:[0026]按照20g/L葡萄糖、1.7g/L無(wú)硫酸銨無(wú)氨基酸酵母氮源與5g/L硫酸銨，將葡萄糖、無(wú)硫酸銨無(wú)氨基酸酵母氮源與硫酸銨溶解于蒸餾水中，再使用無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿水溶液將所得到溶液的PH調(diào)節(jié)至5.5，然后在溫度115°C的條件下滅菌20min。
[0027]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基制備方法如下:
[0028]按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉與20g/L蛋白胨，將葡萄糖、酵母粉與蛋白胨溶解于蒸餾水中，再使用無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿水溶液將所得到溶液的pH調(diào)節(jié)至6.5，然后在溫度115 °C的條件下滅菌20min。
[0029]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的無(wú)機(jī)酸選自硫酸或鹽酸；所述的無(wú)機(jī)堿選自氫氧化鈉或氫氧化鉀；所述無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿水溶液的濃度是2.0~4.0moI/Lο
[0030]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的乳化植物油制備方法如下:
[0031 ] 把植物油添加到以重量計(jì)0.6%吐溫80水溶液中，直到植物油的濃度達(dá)到150~250g/L，接著使用超聲設(shè)備在功率200W的條件下進(jìn)行超聲處理4~6分鐘，再使用0.22 μ m無(wú)菌濾膜過濾除菌。
[0032]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的添加的植物油為紅花籽油。
[0033]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的乳化植物油是在重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn) 定期時(shí)添加的。
[0034]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的洗滌菌體在溫度-10°C~-30°C與真空度1.0~10.0Pa的條件下進(jìn)行凍干。
[0035]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方式，在步驟D中，所述共軛亞油酸的tlO，cl2_CLA含量分別是1.3g/L~3.5g/L ;在步驟E中，所述共軛亞油酸的tlO，cl2_CLA含量分別是
0.5g/L ~6.8g/L。
[0036]下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
[0037]本發(fā)明涉及一種使用重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法。
[0038]重組耶氏解脂酵母菌株(Yarrowialipolytica) CCFM-JU277-9 已于 2013 年 3 月06日在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，其保藏號(hào)為CGMCCN0.7284，具體參見CN 103233036A。
[0039]所述生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法的步驟如下:
[0040]A、平板活化培養(yǎng)
[0041]使用接菌環(huán)將重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接種于裝在平板中的固體培養(yǎng)基上，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中在溫度20~32°C的條件下平板活化培養(yǎng)2~6天，得到平板培養(yǎng)物。
[0042]所述的平板固體培養(yǎng)基制備方法如下:
[0043]按照20g/L葡萄糖、1.7g/L無(wú)硫酸銨無(wú)氨基酸酵母氮源、5g/L硫酸銨和20g/L瓊脂粉，將葡萄糖、無(wú)硫酸銨無(wú)氨基酸酵母氮源與硫酸銨溶解于蒸餾水中，再使用無(wú)機(jī)酸水溶液或無(wú)機(jī)堿水溶液，將所得到溶液的PH調(diào)節(jié)至5.5，再加入瓊脂粉，然后在溫度115°C的條件下滅菌20min。
[0044]在這個(gè)步驟中，使用的恒溫培養(yǎng)箱是目前市場(chǎng)上銷售的產(chǎn)品，例如由上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限.公司以商品名隔水式恒溫培養(yǎng)箱銷售的產(chǎn)品。[0045]在這個(gè)步驟以及后續(xù)步驟中，所述的無(wú)機(jī)酸選自硫酸或鹽酸。在本發(fā)明中使用的是無(wú)機(jī)酸水溶液。所述的無(wú)機(jī)堿選自氫氧化鈉或氫氧化鉀。使用的是無(wú)機(jī)堿水溶液。所述無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿水溶液的濃度是2.0-4.0moI/Lο
[0046]B、種子培養(yǎng)
[0047]使用接菌環(huán)挑取在步驟A平板活化培養(yǎng)的培養(yǎng)物接種到液體種子培養(yǎng)基中，然后置于試管中，在 溫度20~32°C與150~250rpm的條件下培養(yǎng)40~52小時(shí)。
[0048]所述的種子培養(yǎng)基制備方法如下:
[0049]按照20g/L葡萄糖、1.7g/L無(wú)硫酸銨無(wú)氨基酸酵母氮源與5g/L硫酸銨，將葡萄糖、無(wú)硫酸銨無(wú)氨基酸酵母氮源與硫酸銨溶解于蒸餾水中，再使用無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿水溶液將所得到溶液的PH調(diào)節(jié)至5.5，然后在溫度115°C的條件下滅菌20min。
[0050]在這個(gè)步驟中，所述的種子培養(yǎng)是在培養(yǎng)搖床中進(jìn)行的，本發(fā)明使用的培養(yǎng)搖床是目前市場(chǎng)上銷售的產(chǎn)品，例如由上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司以商品名恒溫培養(yǎng)振蕩器銷售的產(chǎn)品。
[0051]C、發(fā)酵培養(yǎng)
[0052]按照以發(fā)酵培養(yǎng)基體積計(jì)0.5%~2.0%接種量，將步驟B得到的種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于發(fā)酵錐形瓶中在溫度20~32°C與150~250rpm的條件下震蕩培養(yǎng)，在發(fā)酵0-45小時(shí)期間添加終濃度為10~70g/L的乳化植物油，震蕩培養(yǎng)48~100小時(shí)，得到一種發(fā)酵培養(yǎng)物，它在7500~8500rpm的條件下離心分離10~18分鐘，得到菌體與發(fā)酵上清液；
[0053]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基制備方法如下:
[0054]按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉與20g/L蛋白胨，將葡萄糖、酵母粉與蛋白胨溶解于蒸餾水中，再使用無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿水溶液將所得到溶液的pH調(diào)節(jié)至6.5，然后在溫度115 °C的條件下滅菌20min。
[0055]在這個(gè)步驟中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)是在震蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行的，本發(fā)明使用的震蕩培養(yǎng)箱是目前市場(chǎng)上銷售的產(chǎn)品，例如由上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司以商品名恒溫培養(yǎng)振蕩器銷售的產(chǎn)品。
[0056]所述的乳化植物油制備方法如下:
[0057]把植物油添加到以重量計(jì)0.6%吐溫80水溶液中，直到植物油的濃度達(dá)到150~250g/L，接著使用超聲設(shè)備在功率200W的條件下進(jìn)行超聲處理4~6分鐘，再使用0.22 μ m無(wú)菌濾膜過濾除菌。
[0058]根據(jù)本發(fā)明，所述的植物油是小麥胚芽油、大豆油、紅花籽油、亞麻油、菜籽油、葵花籽油或核桃仁油。
[0059]優(yōu)選地，所述的植物油是小麥胚芽油、大豆油、紅花籽油、葵花籽油或核桃仁油。
[0060]更優(yōu)選地，所述的植物油是紅花籽油。
[0061]在這個(gè)步驟中，使用的超聲設(shè)備是目前市場(chǎng)上銷售的產(chǎn)品，例如由美國(guó)SONICS公司以商品名超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)銷售的產(chǎn)品。
[0062]在這個(gè)步驟中，使用的0.22 μ m無(wú)菌濾膜是目前市場(chǎng)上銷售的產(chǎn)品，例如由上海興亞凈化材料廠公司以商品名微孔濾膜銷售的產(chǎn)品。
[0063]由于誘導(dǎo)亞油酸異構(gòu)酶(PAI)蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子是在對(duì)數(shù)期末期或穩(wěn)定期初期才啟動(dòng)表達(dá)外源基因(參見文獻(xiàn) MadzakC, TretonB, Blanchin-Roland S.Strong hybridpromoters and integrative expression/secretion vectors for quas1-constitutiveexpression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica.Journal ofMolecular Microbiology and Biotechnology, 2000, 2 (2): 207-216),所以 PAI 蛋白在對(duì)數(shù)期末期或穩(wěn)定期前期大量合成的。如果在發(fā)酵初期添加植物油會(huì)使大量的底物L(fēng)A作為碳源供細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)入穩(wěn)定期后剩余的LA才被PAI蛋白催化合成tlO，cl2-CLA。為了使盡量多的LA作為底物用于合成tlO，C12-CLA,需要確定植物油的最佳添加時(shí)間。
[0064]研究發(fā)現(xiàn)，植物油添加時(shí)間對(duì)tlO，C12-CLA的產(chǎn)量有明顯的影響。以紅花籽油為例研究了植物油的最佳添加時(shí)間。在發(fā)酵開始、重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9菌體對(duì)數(shù)期中期與對(duì)數(shù)期末期添加紅花籽油所得到的tlO，C12-CLA的產(chǎn)量，比進(jìn)入穩(wěn)定期添加紅花籽油時(shí)所達(dá)到的產(chǎn)量低得多，說明在PAI蛋白量積累最多時(shí)添加紅花籽油使更多的底物L(fēng)A流向tlO，C12-CLA合成途徑，具體情況見實(shí)施例2。
[0065]研究還發(fā)現(xiàn)，植物油添加量對(duì)tlO，C12-CLA的產(chǎn)量也有明顯的影響。以紅花籽油為例研究植物油添加量發(fā)現(xiàn)，紅花籽油終濃度從10g/L增加到70g/L時(shí)，tlO，cl2-CLA的產(chǎn)量從逐漸增加轉(zhuǎn)變?yōu)橹饾u降低，而tlO，C12-CLA的得率則從43%逐漸降低到12.3%，具體情況見實(shí)施例3。所述的得率是指tlO，cl2-CLA產(chǎn)量(g/L)與添加紅花籽油量(g/L)的比值。
[0066]得到的菌體使用以重量計(jì)0.70~1.00%NaCl水溶液洗滌2~3次，得到的洗滌液與所述的發(fā)酵上清液合并，合并的發(fā)酵上清液用于后續(xù)處理；洗滌的菌體接著進(jìn)行凍干。
[0067]NaCl水溶液洗滌的目的在于洗掉菌體細(xì)胞表面附著的脂肪酸所述的凍干是讓所述的洗滌菌體在溫度-10°C~-30°c與真空度1.0~10.0Pa的條件下進(jìn)行冷凍干燥。
[0068]在這個(gè)步驟中，進(jìn)行凍干所使用的設(shè)備是目前市場(chǎng)上銷售的產(chǎn)品，例如由美國(guó)LABC0NC0公司以商品名凍干機(jī)銷`售的產(chǎn)品。
[0069]D、由菌體提取脂肪
[0070]按照以mg計(jì)凍干菌體與以ml計(jì)8~12%鹽酸-甲醇溶液之比為20~50:0.5~1.5，讓步驟C所得到的凍干菌體與8~12%鹽酸-甲醇溶液在溫度45~-65°C的條件下進(jìn)行甲酯化2.5~3.5小時(shí)，然后加入與鹽酸-甲醇溶液等體積的正己烷提取5~15分鐘，接著在5000~7000rpm的條件下離心分離2~5分鐘,在分離上清液后所得到的殘余物再重復(fù)上述提取操作I~2次，分離上清液合并，用氮?dú)獯蹈?，得到所述的含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯?br> [0071]在本發(fā)明中，采用常規(guī)氣相色譜定量分析方法(參見文獻(xiàn)Baixi Zhang, ChunchiRong ect.De novo synthesis of trans—10，cis_12conjugated linoleic acid inoleaginous yeast Yarrowia Lipolytica.Microbial Cell Factories, 2012，11:51)分析了在所述脂肪酸甲酯中的共軛亞油酸t(yī)lO，C12-CLA含量。
[0072]在這個(gè)步驟中，所述脂肪酸甲酯中共軛亞油酸t(yī)lO，C12-CLA的含量分別是1.3g/L ~3.5g/L。
[0073]E、由發(fā)酵上清液提取脂肪
[0074]按照以ml計(jì)發(fā)酵上清液與氯仿甲醇混合液之比為1:8.0~12.0，用按照體積比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并發(fā)酵上清液2~4次，提取液合并，用氮?dú)獯蹈?，再加入與氯仿甲醇混合液等體積的8~12%鹽酸-甲醇溶液在溫度45~65°C的條件下進(jìn)行甲酯化0.5~3小時(shí)，然后加入與鹽酸-甲醇溶液等體積的正己烷提取5~15分鐘，接著在3000~7000rpm的條件下離心分離2~5分鐘，在分離上清液后所得到的殘余物再重復(fù)上述提取操作I~2次，分離上清液合并，用氮?dú)獯蹈?，得到所述的含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯?br> [0075]采用上述常規(guī)氣相色譜定量分析方法分析，所述脂肪酸甲酯中共軛亞油酸t(yī)lO，cl2-CLA的含量分別是0.5g/L~6.8g/L。
[0076]在本發(fā)明中，共軛亞油酸t(yī)lO, C12-CLA得率是共軛亞油酸t(yī)lO, cl2_CLA的含量(g/L)與添加紅花籽油量(g/L)的比值。
[0077]通過前面描述與實(shí)施例可以清楚地知道，采用本發(fā)明方法制備的脂肪酸甲酯中共軛亞油酸t(yī)io，C12-CLA的含量遠(yuǎn)高于現(xiàn)有技術(shù)所達(dá)到的含量。 [0078][有益效果]
[0079]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明使用紅花籽油(SaO)時(shí)，tlO，cl2_CLA的產(chǎn)量最高達(dá)到2.44g/L，是不添加植物油時(shí)tlO，C12-CLA含量的55倍之多，比添加價(jià)格昂貴的游離LA的產(chǎn)量還要高約30%以上。添加紅花籽油的終濃度為30g/L、50g/L、70g/L時(shí)，在發(fā)酵84h時(shí)tlO，C12-CLA產(chǎn)量分別達(dá)到9.lg/L、9.7g/L及8.6g/L。使用較廉價(jià)的紅花籽油代替昂貴的游離LA作為發(fā)酵用底物，既能提高tlO，C12-CLA的產(chǎn)量，又能很大程度降低發(fā)酵成本，因此，本發(fā)明使用重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法具有非常好的應(yīng)用前景。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0080]圖1是重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9在發(fā)酵培養(yǎng)過程中的生長(zhǎng)曲線。
【【具體實(shí)施方式】】
[0081 ] 通過下述實(shí)施例將能夠更好地理解本發(fā)明。
[0082]實(shí)施例1:使用不同植物油制備含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯
[0083]該實(shí)施例的實(shí)施步驟如下:
[0084]A、平板活化培養(yǎng)
[0085]按照20g/L葡萄糖、1.7g/L無(wú)硫酸銨無(wú)氨基酸酵母氮源、5g/L硫酸銨和20g/L瓊脂粉，將葡萄糖、無(wú)硫酸銨無(wú)氨基酸酵母氮源與硫酸銨溶解于蒸餾水中，再使用2.0mol/L硫酸或氫氧化鈉水溶液將所得到溶液的pH調(diào)節(jié)至5.5，再加入瓊脂粉，然后在溫度115°C的條件下滅菌20min，得到平板固體培養(yǎng)基。
[0086]使用接菌環(huán)將重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接種于裝在平板中的平板固體培養(yǎng)基上，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中在溫度28°C的條件下平板活化培養(yǎng)4天，得到所述的平板培養(yǎng)物；
[0087]B、種子培養(yǎng)
[0088]按照20g/L葡萄糖、1.7g/L無(wú)硫酸銨無(wú)氨基酸酵母氮源與5g/L硫酸銨，將葡萄糖、無(wú)硫酸銨無(wú)氨基酸酵母氮源與硫酸銨溶解于蒸餾水中，再使用2.0mol/L硫酸或氫氧化鈉水溶液將所得到溶液的PH調(diào)節(jié)至5.5，然后在溫度115°C的條件下滅菌20min，得到種子培養(yǎng)基。[0089]使用接菌環(huán)挑取在步驟A平板活化培養(yǎng)的培養(yǎng)物接種到液體種子培養(yǎng)基中，然后置于試管中，在溫度28°C與200rpm的條件下培養(yǎng)46小時(shí)；
[0090]C、發(fā)酵培養(yǎng)
[0091]按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉與20g/L蛋白胨，將葡萄糖、酵母粉與蛋白胨溶解于蒸餾水中，再使用2.0mol/L硫酸或氫氧化鈉水溶液將所得到溶液的pH調(diào)節(jié)至6.5，然后在溫度115°C的條件下滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0092]把小麥胚芽油、大豆油、紅花籽油、亞麻油、菜籽油、葵花籽油或核桃仁油植物油分別添加到以重量計(jì)0.6%吐溫80水溶液中，直到所述植物油的濃度達(dá)到200g/L，接著使用超聲設(shè)備在功率200W的條件下進(jìn)行超聲處理5分鐘，再使用0.22 μ m無(wú)菌濾膜過濾除菌，得到相應(yīng)的乳化植物油。
[0093]按照以發(fā)酵培養(yǎng)基體積計(jì)1.0%接種量，將步驟B得到的種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于發(fā)酵錐形瓶中在溫度28°C與200rpm的條件下震蕩培養(yǎng)，在發(fā)酵0_45小時(shí)期間添加終濃度為10g/L的乳化植物油，震蕩培養(yǎng)72小時(shí)，得到一種發(fā)酵培養(yǎng)物，它在8000rpm的條件下離心分離15分鐘,得到菌體與發(fā)酵上清液。
[0094]所述的菌體使用以重量計(jì)0.85%NaCl水溶液洗滌2次，得到的洗滌液與所述的發(fā)酵上清液合并，合并的發(fā)酵上清液用于后續(xù)處理；洗滌的菌體接著在溫度_20°C與真空度
5.0Pa的條件下進(jìn)行凍干。
[0095]D、 由菌體提取脂肪
[0096]按照以mg計(jì)凍干菌體與以ml計(jì)10%鹽酸-甲醇溶液之比為35:1.0,讓步驟C所得到的凍干菌體與10%鹽酸-甲醇溶液在溫度50°C的條件下進(jìn)行甲酯化3.0小時(shí)，然后加入與鹽酸-甲醇溶液等體積的正己烷提取10分鐘，接著在6000rpm的條件下離心分離3分鐘，在分離上清液后所得到的殘余物再重復(fù)上述提取操作I次，分離上清液合并，用氮?dú)獯蹈?，得到所述的含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯，采用常?guī)氣相色譜定量分析脂肪酸甲酯，確定產(chǎn)物10t, 12c -CLA的含量；
[0097]E、由發(fā)酵上清液提取脂肪
[0098]按照以ml計(jì)發(fā)酵上清液與氯仿甲醇混合液之比為1:10.0，用按照體積比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并發(fā)酵上清液3次，提取液合并，用氮?dú)獯蹈桑偌尤肱c氯仿甲醇混合液等體積的10%鹽酸-甲醇溶液在溫度50°C的條件下進(jìn)行甲酯化I小時(shí)，然后加入與鹽酸-甲醇溶液等體積的正己烷提取10分鐘，接著在6000rpm的條件下離心分離3分鐘，在分離上清液后所得到的殘余物再重復(fù)上述提取操作I次，分離上清液合并，用氮?dú)獯蹈?，得到所述的含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯?br> [0099]采用本說明書描述的氣相色譜定量分析方法測(cè)定了，本實(shí)施例制備所使用的植物油的主要脂肪酸組成，其結(jié)果列于表1中，本實(shí)施例制備所得到的脂肪酸甲酯中的lot，12c - CLA含量，其結(jié)果列于表2中。
[0100]表1:不同植物油的主要脂肪酸組成(重量％)
[0101]
【權(quán)利要求】
1.一種使用重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法，其特征在于該方法的步驟如下: A、平板活化培養(yǎng) 使用接菌環(huán)將重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接種于裝在平板中的固體培養(yǎng)基上，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中在溫度20~32°C的條件下平板活化培養(yǎng)2~6天，得到平板培養(yǎng)物； B、種子培養(yǎng) 使用接菌環(huán)挑取在步驟A平板活化培養(yǎng)的培養(yǎng)物接種到液體種子培養(yǎng)基中，然后置于試管中，在溫度20~32°C與150~250rpm的條件下培養(yǎng)40~52小時(shí)； C、發(fā)酵培養(yǎng) 按照以發(fā)酵培養(yǎng)基體積計(jì)0.5%~2.0%接種量，將步驟B得到的種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于發(fā)酵錐形瓶中在溫度20~32°C與150~250rpm的條件下震蕩培養(yǎng)，在發(fā)酵0-45小時(shí)期間 添加終濃度為10~70g/L的乳化植物油，震蕩培養(yǎng)48~100小時(shí)，得到一種發(fā)酵培養(yǎng)物，它在7500~8500rpm的條件下離心分離10~18分鐘，得到菌體與發(fā)酵上清液； 所述的菌體使用以重量計(jì)0.70~1.00%NaCl水溶液洗滌2~3次，得到的洗滌液與所述的發(fā)酵上清液合并，合并的發(fā)酵上清液用于后續(xù)處理；洗滌的菌體接著進(jìn)行凍干； D、由菌體提取脂肪 按照以mg計(jì)凍干菌體與以ml計(jì)8~12%鹽酸-甲醇溶液之比為20~50:0.5~1.5,讓步驟C所得到的凍干菌體與8~12%鹽酸-甲醇溶液在溫度45~-65°C的條件下進(jìn)行甲酯化2.5~3.5小時(shí)，然后加入與鹽酸-甲醇溶液等體積的正己烷提取5~15分鐘，接著在5000~7000rpm的條件下離心分離2~5分鐘，在分離上清液后所得到的殘余物再重復(fù)上述提取操作I~2次，分離上清液合并，用氮?dú)獯蹈?，得到所述的含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯? E、由發(fā)酵上清液提取脂肪 按照以ml計(jì)發(fā)酵上清液與氯仿甲醇混合液之比為1:8.0~12.0，用按照體積比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并發(fā)酵上清液2~4次，提取液合并，用氮?dú)獯蹈桑偌尤肱c氯仿甲醇混合液等體積的8~12%鹽酸-甲醇溶液在溫度45~65°C的條件下進(jìn)行甲酯化0.5~3小時(shí)，然后加入與鹽酸-甲醇溶液等體積的正己烷提取5~15分鐘，接著在3000~7000rpm的條件下離心分離2~5分鐘，在分離上清液后所得到的殘余物再重復(fù)上述提取操作I~2次，分離上清液合并，用氮?dú)獯蹈桑玫剿龅暮泄曹梺営退岬闹舅峒柞ァ?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的平板固體培養(yǎng)基制備方法如下: 按照20g/L葡萄糖、1.7g/L無(wú)硫酸銨無(wú)氨基酸酵母氮源、5g/L硫酸銨和20g/L瓊脂粉，將葡萄糖、無(wú)硫酸銨無(wú)氨基酸酵母氮源與硫酸銨溶解于蒸餾水中，再使用無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿水溶液將所得到溶液的PH調(diào)節(jié)至5.5，再加入瓊脂粉，然后在溫度115°C的條件下滅菌20mino
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的種子培養(yǎng)基制備方法如下: 按照20g/L葡萄糖、1.7g/L無(wú)硫酸銨無(wú)氨基酸酵母氮源與5g/L硫酸銨，將葡萄糖、無(wú)硫酸銨無(wú)氨基酸酵母氮源與硫酸銨溶解于蒸餾水中，再使用無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿水溶液將所得到溶液的pH調(diào)節(jié)至5.5，然后在溫度115°C的條件下滅菌20min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基制備方法如下: 按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉與20g/L蛋白胨，將葡萄糖、酵母粉與蛋白胨溶解于蒸餾水中，再使用無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿水溶液將所得到溶液的PH調(diào)節(jié)至6.5，然后在溫度115°C的條件下滅菌20min。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其特征在于所述的無(wú)機(jī)酸選自硫酸或鹽酸；所述的無(wú)機(jī)堿選自氫氧化鈉或氫氧化鉀；所述無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿水溶液的濃度是 2.0 ~4.0mol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的乳化植物油制備方法如下: 把植物油添加到以重量計(jì)0.6%吐溫80水溶液中，直到植物油的濃度達(dá)到150~250g/L,接著使用超聲設(shè)備在功率200W的條件下進(jìn)行超聲處理4~6分鐘，再使用0.22 μ m無(wú)菌濾膜過濾除菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的所述的添加的植物油為紅花籽油。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的乳化植物油是在重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期時(shí)添加的。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的洗滌菌體在溫度-10°C~_30°C與真空度1.0~10.0Pa的條件下進(jìn)行凍干。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在步驟D中，所述共軛亞油酸的tlO，C12-CLA含量分別是1.3g/L~3.5g/L ;在步驟E中，所述共軛亞油酸的tlO，cl2_CLA含量分別是 0.5g/L ~6.8g/L。
【文檔編號(hào)】C12P7/64GK103725723SQ201410020846
【公開日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2014年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月17日
【發(fā)明者】陳衛(wèi), 張白曦, 陳海琴, 李敏, 顧震南, 趙建新, 張秋香, 劉小鳴, 趙國(guó)忠, 張灝, 陳永泉 申請(qǐng)人:江南大學(xué)