Ppp1r12a基因在結(jié)直腸癌化療療效判斷和檢測試劑盒中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域，公開了一種結(jié)直腸癌相關(guān)的標(biāo)志物的應(yīng)用，該標(biāo)志物為PPP1R12A。具體地講，該標(biāo)志物的DNA相對拷貝數(shù)與結(jié)直腸癌患者化療之后的生存期呈負(fù)相關(guān)。本發(fā)明還涉及結(jié)直腸癌組織樣本中檢測PPP1R12A的試劑盒、方法和應(yīng)用。該試劑盒中含有檢測PPP1R12A和內(nèi)參基因GAPDH引物對，本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)了PPP1R12A與結(jié)直腸癌以及結(jié)直腸癌化療療效之間的關(guān)系，設(shè)計(jì)出檢測PPP1R12A的引物對，用該引物對設(shè)計(jì)出的試劑盒能夠用于檢測結(jié)直腸癌腫瘤，使通過PPP1R12A檢測結(jié)直腸癌成為可能。
【專利說明】PPP1R12A基因在結(jié)直腸癌化療療效判斷和檢測試劑盒中的應(yīng)用
[【技術(shù)領(lǐng)域】][0001]本發(fā)明屬于腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種結(jié)直腸癌基因標(biāo)志物及其應(yīng)用，具體涉及結(jié)直腸癌中檢測PPP1R12A基因相對拷貝數(shù)的試劑盒、方法和應(yīng)用。
[【背景技術(shù)】]
[0002]結(jié)直腸癌是最為常見的惡性腫瘤之一，中國地區(qū)的發(fā)病率上升趨勢十分明顯，位居全部惡性腫瘤第三位，嚴(yán)重威脅人類健康。
[0003]臨床上第三代鉬類藥物奧沙利鉬奧沙利鉬，聯(lián)合5氟尿嘧啶和四氫葉酸的FOLFOX方案是目前進(jìn)展期結(jié)直腸癌的一線化療方案，但是仍有50%的人對化療不敏感，其主要的原因是對于奧沙利鉬化療藥物原始的或獲得性的耐藥性。這種耐藥性的產(chǎn)生與化療藥物的運(yùn)輸、DNA修復(fù)、DNA損傷耐受和凋亡等多種相關(guān)基因的參與有關(guān)。因此，發(fā)現(xiàn)化療療效相關(guān)的基因診斷標(biāo)志物對患者選擇合適的化療藥物并從中獲得臨床受益具有重要的臨床意義。
[0004]PPP1R12A，稱為磷酸酶I調(diào)節(jié)亞基12A，又稱為肌球蛋白磷酸酶結(jié)合亞基(MYPT-1),能夠與肌球蛋白磷酸酶δ催化亞基結(jié)合，調(diào)控磷酸酶的特異性和活性(GrassieME, Moffat LD, Walsh MP, Macdonald JA (2011) The myosin phosphatase targetingprotein (MYPT) family: a regulated mechanism for achieving substrate specificityof the catalytic subunit of protein phosphatase typeldelta.Archives ofBiochemistry and Biophysics510:147 - 159)。PPP1R12A 在多種類型細(xì)胞中表達(dá)，并且在平滑肌細(xì)胞中達(dá)到高表達(dá)(Matsumura F, Hartshorne DJ (2008) Myosin phosphatasetarget subunit:many roles in cell function.Biochemical and Biophysical ResearchCommunications369:149 - 156)。PPP1R12A的一個(gè)生物學(xué)特點(diǎn)是與PPlc δ磷酸酶形成復(fù)合物，調(diào)控PPlc δ磷酸酶對其底物-磷酸化肌球蛋白的去磷酸化作用，從而調(diào)控肌肉的壓縮和細(xì)胞遷移。
[0005]除此之外，有研究發(fā)現(xiàn)PPP1R12A還參與調(diào)控了腫瘤抑制基因Merlin的活性(Jin H, Sperka T, Herrlich P, Morrison H (2006) Tumorigenic transformation byCP1-17through inhibition of a merlin phosphatase.Nature442:576-579)。當(dāng)細(xì)胞密度過高時(shí)，Merlin發(fā)生去磷酸化，能夠與細(xì)胞表面的⑶44結(jié)合，抑制細(xì)胞增殖(Shaw RJ, PaezJG,Curto 等(2001) The Nf2tumor suppressor, merlin, functions in Rac-dependentsignaling.Dev Celll:63_72)。Merlin缺失雜合子小鼠在多種器官肺、肝臟和骨長出惡性腫瘤(McClatchey Al, Saotome I, Mercer K等(1998)Mice heterozygous for a mutationat the Nf2tumor suppressor locus develop a range of highly metastatic tumors.Genes Devl2:1121-1133)。Merlin去磷酸化對它維持抑癌基因的功能非常重要，而Merlin去磷酸化是通過PPP1R12A和PPl δ調(diào)控。其中，PPP1R12A蛋白C端有一個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，能夠與Merlin C端(第314-第595位氨基酸)結(jié)合，并且偏好結(jié)合磷酸化的Merlin,PPP1R12A同時(shí)也能與磷酸酶PPl δ結(jié)合，從而介導(dǎo)了磷酸酶PPl δ對Merlin的去磷酸化。一旦利用蛋白酶降解PPP1R12A之后，Merlin的去磷酸化水平降低。
[0006]磷酸酶與激酶是體內(nèi)兩類重要酶類，調(diào)控蛋白磷酸化水平，參與細(xì)胞內(nèi)諸多信號通路的調(diào)控，與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和耐藥有重要關(guān)系。其中磷酸酶被認(rèn)為是腫瘤抑制基因，負(fù)責(zé)蛋白去磷酸化，這類酶在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展過程中經(jīng)常發(fā)生突變和缺失，導(dǎo)致底物蛋白過度磷酸化，促進(jìn)了細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥相關(guān)信號通路的持續(xù)激活，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和惡化。重要的磷酸酶如PTEN就在結(jié)直腸癌以及其他多種腫瘤中發(fā)生缺失和突變。另外，6大類磷酸酶在結(jié)直腸癌中發(fā)生高頻突變，這6類磷酸酶包括PTPRF，PTPRG, PTPRT, PTPN3, PTPN13, PTPN14(ffang Z,Shen D, Parsons DW等(2004)Mutational analysis of the tyrosinephosphatome in colorectal cancers.Science304:1164-1166.X
[0007]這些提示PPP1R12A這個(gè)磷酸酶調(diào)控亞基也有可能存在結(jié)直腸癌發(fā)生過程中存在缺失的可能。目前檢測基因缺失的常用方法包括熒光原位雜交和熒光定量PCR，后者教前者簡單方便和靈敏。
[
【發(fā)明內(nèi)容】
]
[0008]腫瘤發(fā)生的實(shí)質(zhì)是基因組的不穩(wěn)定性造成的染色體DNA缺失、擴(kuò)增和突變。這些異常染色體區(qū)域的基因大多與腫瘤的發(fā)生、耐藥和轉(zhuǎn)移相關(guān)。本發(fā)明的首要目的是確認(rèn)PPP1R12A在結(jié)直腸癌發(fā)生過程中是否發(fā)生缺失或者擴(kuò)增。其次，確認(rèn)PPP1R12A相對拷貝數(shù)變化以及是否與結(jié)直腸癌F0LF0X化療療效相關(guān)。第三個(gè)目的是發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌發(fā)生和療效相關(guān)的生物標(biāo)志物。
[0009]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)PPP1R12A基因相對拷貝數(shù)在結(jié)直腸癌組織中比非腫瘤對照腸組織高，因此，腫瘤樣本中的PPP1R12A的相對拷貝數(shù)可以作為結(jié)直腸癌的一個(gè)標(biāo)志物。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)PPP1R12A的相對拷貝數(shù)降低程度與患者服用F0LF0X化療藥物之后的生存期相關(guān)。
`[0010]因?yàn)镕0LF0X化療方案中起主要抗腫瘤的活性物質(zhì)為5氟尿嘧啶(5FU)和奧沙利鉬，它們的作用方式為誘導(dǎo)DNA損傷從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，因此，本發(fā)明涉及PPP1R12A作為評價(jià)結(jié)直腸癌患者使用誘導(dǎo)DNA損傷的化療藥物之后生存期的指標(biāo)。
[0011]因?yàn)镈NA拷貝數(shù)降低直接導(dǎo)致基因表達(dá)降低，因此，本發(fā)明也涉及利用PPP1R12A表達(dá)(包括mRNA和蛋白水平)作為評價(jià)結(jié)直腸癌發(fā)生和結(jié)直腸癌患者服用化療藥物之后生存期的指標(biāo)。
[0012]另一方面，本發(fā)明涉及PPP1R12A的引物對SEQID N0.1 和 SEQID N0.2,SEQID N0.3和SEQID N0.4,SEQID N0.5和SEQID N0.6在制備PPP1R12A的檢測試劑盒中的用途。因?yàn)楸景l(fā)明選取了 PPP1R12A序列上不同位置的序列設(shè)計(jì)檢測引物，且熒光定量PCR反應(yīng)顯示皆有效，所以，本發(fā)明涉及來源于PPPIRl2A基因上任一位置的引物序列應(yīng)用于檢測PPP1R12A的用途。
[0013]為了使通過PPP1R12A相對拷貝數(shù)檢測結(jié)直腸癌成為可能，本發(fā)明的首要目的是發(fā)明一種檢測PPP1R12A的引物對和試劑盒，然后通過PPP1R12A做成檢測結(jié)直腸的試劑盒。
[0014]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，首先發(fā)明一種PPP1R12A基因在F0LF0X化療藥物療效判斷藥物中的應(yīng)用。
[0015]所述的化療藥物為誘導(dǎo)DNA損傷的化療藥物。
[0016]所述的誘導(dǎo)DNA損傷的化療藥物選自含鉬類和5氟尿嘧啶及其衍生物的化療藥物中的一種或多種。
[0017]PPP1R12A基因?yàn)榻Y(jié)直腸癌的生物標(biāo)志物，利用其DNA相對拷貝數(shù)增高與結(jié)直腸癌發(fā)生呈正相關(guān)；所述的標(biāo)志物的DNA相對拷貝數(shù)降低與結(jié)直腸癌患者進(jìn)行FOLFOX化療之后的生存期呈負(fù)相關(guān)，所述負(fù)相關(guān)為PPP1R12A相對拷貝數(shù)越低，生存期越長；相對拷貝數(shù)越高，生存期越短，利用所述的負(fù)相關(guān)制備所述判斷藥物或試劑盒。
[0018]所述的標(biāo)志物相對拷貝數(shù)降低還包括相對拷貝數(shù)降低引起的PPP1R12A的mRNA和蛋白水平的降低。
[0019]本發(fā)明的另一目的是發(fā)明一種檢測PPP1R12A的試劑盒，該試劑盒中含有檢測PPP1R12A和內(nèi)參基因GAPDH引物對。
[0020]所述檢測PPP1R12A的引物對選自下述引物對中的一對:
[0021]第一引物對，[0022]上游引物，如堿基序列SEQ ID NO:1所示；
[0023]下游引物，如堿基序列SEQ ID NO:2所示；
[0024]或第二引物對，
[0025]上游引物，如堿基序列SEQ ID NO:3所示；
[0026]下游引物，如堿基序列SEQ ID N0:4所示；
[0027]或第三引物對，
[0028]上游引物，如堿基序列SEQ ID NO:5所示；
[0029]下游引物，如堿基序列SEQ ID N0:6所示。
[0030]所述的內(nèi)參基因GAPDH的引物對優(yōu)選為:
[0031]上游引物，如堿基序列SEQ ID NO:3所示；
[0032]下游引物，如堿基序列SEQ ID N0:4所示。
[0033]本發(fā)明還包括一種檢測PPP1R12A的方法，包括DNA的提取步驟；用所述的試劑盒對所述的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；最后得到擴(kuò)增產(chǎn)物，并檢測判斷。
[0034]本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)的PPP1R12A與結(jié)直腸癌之間的關(guān)系(參見實(shí)施例)，設(shè)計(jì)出檢測PPP1R12A的引物對，用該引物對設(shè)計(jì)出的試劑盒能夠用于檢測結(jié)直腸癌腫瘤，使通過PPP1R12A檢測結(jié)直腸癌成為可能。
[【專利附圖】
【附圖說明】]
[0035]圖1為PPP1R12A作為結(jié)直腸癌標(biāo)志物的ROC曲線
[0036]圖2為PPP1R12A相對拷貝數(shù)與結(jié)直腸癌患者經(jīng)FOLFOX化療后生存期的關(guān)系
[0037]圖3PPP1R12A作為判斷結(jié)直腸癌FOLFOX化療療效判斷標(biāo)志物的ROC曲線；
[0038]圖中:1.基因拷貝數(shù)低于平均值2.基因相對拷貝數(shù)高于平均值。
[【具體實(shí)施方式】]
[0039]實(shí)施案例1:樣本及其隨訪信息的收集
[0040]發(fā)明人從2006年開始從瑞金醫(yī)院收集了大腸癌患者樣本，經(jīng)過資料整理和隨訪，從中選取了 97份(37份五年以下生存期，60份五年以上生存期和至統(tǒng)計(jì)之日仍然存活患者)III期結(jié)直腸癌腫瘤和8例非腫瘤腸組織石蠟包埋組織樣本。[0041 ] 實(shí)施案例2:石蠟樣本DNA抽提
[0042]從石蠟包埋組織中切下5毫克樣本，放入2毫升離心管中，加入I毫升二甲苯，渦旋震蕩10秒。在14000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速下常溫離心2分鐘。棄上清。加入I毫升無水乙醇洗滌沉淀，渦旋震蕩，在14000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速下常溫離心2分鐘，棄上清。將離心管置于超凈臺中去除多余乙醇。加入180微升RTL緩沖液(Qiagen)，20微升蛋白酶K，混勻，56°C孵育I小時(shí)，90°C孵育I小時(shí)。加200微升AL緩沖液，混勻，然后加入200微升無水乙醇，混勻。將混合液加入QIAamp柱子(Qiagen)，8000轉(zhuǎn)/分鐘常溫離心I分鐘。打開柱子蓋子，加入500微升AWl緩沖液(Qiagen)，8000轉(zhuǎn)/分鐘常溫離心I分鐘。加入500微升AW2緩沖液(Qiagen)，8000轉(zhuǎn)/分鐘常溫離心I分鐘。在14000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速下常溫離心3分鐘干燥膜。加入50微升ATE緩沖液，在14000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速下常溫離心I分鐘收集DNA。
[0043]實(shí)施案例3:熒光定量PCR及分析 [0044]設(shè)計(jì)三對PCR引物用來擴(kuò)增PPP1R12A，序列見表1。使用2XSYBR Green熒光染料配制PCR反應(yīng)混合液，根據(jù)需要上機(jī)的樣品數(shù)和重復(fù)數(shù)，計(jì)算并配制PCR反應(yīng)混合液，體系如下:
[0045]
成分體積
2*SYBR Green10 μ I
引物 Mix4μ M (2.5μ I)~
模板20ng (2.5μ I)
超純水5 μ I
總體積20ul
[0046]
[0047]分裝至AXYGEN PCR8連管，微型離心機(jī)瞬時(shí)離心混勻PCR體系。GAPDH作為內(nèi)參基因。
[0048]將上述樣品放入IQ5 (BioRad)熒光定量PCR儀，SYBR Green法熒光定量PCR以分析各基因的表達(dá)，PCR程序設(shè)置如下:
[0049]預(yù)變性Cyclel: (IX)
[0050]Stepl:95.0°Cfor02:00[0051 ] PCR 循環(huán) CycIe2: (40X)
[0052]Stepl:95.0°Cfor00:15
[0053]Step2:60.0°Cfor00:20
[0054]Step3:72.0°Cfor00:20
[0055]溶解曲線60°C -95.(TC每秒增加0.5度，采集熒光，收集數(shù)據(jù)。
[0056]對于每個(gè)樣本，按照Λ Ct (相對拷貝數(shù))=Ct (PPP1R12A平均值)一Ct (GAPDH平均值)計(jì)算PPP1R12A相對拷貝數(shù)(見表2)[0057]表1兩對qPCR檢測弓|物
[0058]
【權(quán)利要求】
1.PPP1R12A基因在FOLFOX化療藥物療效判斷藥物或試劑盒中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的化療藥物為誘導(dǎo)DNA損傷的化療藥物。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的誘導(dǎo)DNA損傷的化療藥物選自含鉬類和5氟尿嘧啶及其衍生物的化療藥物中的一種或多種。
4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于PPP1R12A基因?yàn)榻Y(jié)直腸癌的生物標(biāo)志物，利用其DNA相對拷貝數(shù)增高與結(jié)直腸癌發(fā)生呈正相關(guān)，即所述DNA標(biāo)志物相對拷貝數(shù)越高，結(jié)直腸癌發(fā)生的可能性越高；所述的標(biāo)志物的DNA相對拷貝數(shù)降低與結(jié)直腸癌患者進(jìn)行FOLFOX化療之后的生存期呈負(fù)相關(guān)，所述負(fù)相關(guān)為PPP1R12A相對拷貝數(shù)越低，生存期越長；相對拷貝數(shù)越高，生存期越短，利用所述的負(fù)相關(guān)制備所述判斷藥物或試劑盒。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的標(biāo)志物相對拷貝數(shù)降低包括相對拷貝數(shù)降低引起的PPP1R12A的mRNA和蛋白水平的降低。
6.一種檢測PPP1R12A的試劑盒，其特征在于，含有檢測PPP1R12A和內(nèi)參基因GAPDH引物對。
7.如權(quán)利要求6所述的檢測結(jié)直腸癌的試劑盒，其特征在于所述檢測PPP1R12A的引物對選自下述引物對中的一對: 第一引物對， 上游引物，如堿基序列SEQ ID NO:1所示； 下游引物，如堿基序列SEQ ID N0:2所示； 或第二引物對， 上游引物，如堿基序列SEQ ID NO:3所示； 下游引物，如堿基序列SEQ ID N0:4所示； 或第三引物對， 上游引物，如堿基序列SEQ ID NO:5所示； 下游引物，如堿基序列SEQ ID N0:6所示。
8.如權(quán)利要求6所述的檢測結(jié)直腸癌的試劑盒，其特征在于所述的內(nèi)參基因GAPDH的引物對為: 上游引物，如堿基序列SEQ ID NO:7所示； 下游引物，如堿基序列SEQ ID N0:8所示。
9.一種檢測PPP1R12A的方法， 包括DNA的提取步驟； 其特征在于，還包括: 用權(quán)利要求6所述的試劑盒對所述的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 得到擴(kuò)增產(chǎn)物，并檢測判斷。
【文檔編號】C12Q1/68GK103695560SQ201410009149
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2014年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月9日
【發(fā)明者】林謀斌, 尹路, 張亞杰, 李阿建, 李華光 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院