品系設(shè)計的制作方法

品系設(shè)計的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于遺傳修飾雜交植物的基因組的方法，其通過將它的染色體或染色體片段的一個或多個替換為一個或多個供體親本的相應(yīng)染色體或染色體片段而實施。本發(fā)明采用反向育種技術(shù)構(gòu)建一種新型的取代文庫和漸滲文庫，其可以用于加速的育種和雜交植物校正。這些文庫和它們的用途也是本發(fā)明的一部分。
【專利說明】品系設(shè)計發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種用于遺傳修飾雜交植物的基因組的方法。它還涉及染色體取代系(substitut1n line)和/或漸滲系(introgress1n line)的文庫，以及由此獲得的染色體和漸滲系的文庫用于加速的植物育種的用途。
[0002]發(fā)明背景
[0003]植物育種的目的在于將盡可能多的有利的和有吸引力的性狀組合在同一植物基因組中，其目標是獲得優(yōu)良植物品系或品種。由此，植物育種者可以利用在相關(guān)作物物種內(nèi)或在相同種或?qū)俚囊吧?未人工培育的和未馴化的)親緣內(nèi)的遺傳變異。
[0004]他還可以通過化學、物理或其它方式進行誘變而誘導感興趣的植物物種的基因組中的遺傳變異，并尋找由該誘導的遺傳變異所產(chǎn)生的表型變異。
[0005]如果他愿意并能夠應(yīng)用轉(zhuǎn)基因方法，他還可以選擇將一個或多個轉(zhuǎn)基因?qū)胱魑镏参锏幕蚪M。這些轉(zhuǎn)基因可以對應(yīng)于在同一植物物種中或者在能夠一起雜交以產(chǎn)生可育后代的植物物種中天然存在的基因、基因簇或基因間序列。這被稱為同源基因化(cisgenesis)?；蛘?，它們可以對應(yīng)于合成基因或來自不能與感興趣的植物物種天然雜交的有機體(organism)DNA片段,例如來自另一個家系的植物,或是來自不同分類(taxa)的有機體，例如動物、真菌、病毒或細菌。這被稱為轉(zhuǎn)基因(transgenesis)。這些DNA序列或者以未發(fā)生改變的方式被導入感興趣的植物物種的基因組，或者它們被以某種方式改變，例如通過誘變或者不誘變的重組技術(shù)。
[0006]轉(zhuǎn)基因技術(shù)允許研究者將多個DNA構(gòu)建體組合入同一植物的基因組，并因而堆疊(stack)或形成金字塔式的(pyramid)不同的性狀。該方法通過編碼這些性狀的轉(zhuǎn)基因的組合堆疊/金字塔結(jié)構(gòu)最終可以導致攜帶多個所選擇性狀的植物的建立。但是，這樣的轉(zhuǎn)基因方法具有若干缺點。
[0007]給定轉(zhuǎn)基因的效果和/或功能性往往強烈地依賴于它被插入在植物基因組中的確切位置。任何經(jīng)遺傳修飾的物質(zhì)要獲得批準用于商業(yè)用途和動物和/或人類消費，需要經(jīng)歷非常廣泛的監(jiān)管程序，其是極為昂貴的和耗時的。通常只會對給定基因組中特定轉(zhuǎn)基因插入事件進行授權(quán)。多個轉(zhuǎn)基因的堆疊只會使得這個過程更加昂貴、繁瑣和復(fù)雜。此外，在全球食品市場的重要區(qū)域中，轉(zhuǎn)基因食品不被允許用于人類消費。
[0008]不希望生產(chǎn)或銷售轉(zhuǎn)基因植物的植物育種者通常會依賴于傳統(tǒng)育種技術(shù)以便將多個感興趣的性狀組合在一個植物物種中。育種過程包括通過雜交的方式將兩個植物的基因組混合的第一步，其中每個植物包括有趣的遺傳性狀。隨后，需要跟蹤感興趣的性狀在這兩個植物的雜交后代中的存在，其通?；诒硇头治龊?或基因組測試(例如DNA標記分析、單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)檢測、DNA測序等)來完成。
[0009]因為原始植物的整個基因組已經(jīng)被混合在Fl產(chǎn)物中并在減數(shù)分裂過程中被重組，原始親本植物的各種性狀會被打亂，并且它們在雜交的F2后代中分離。然后，育種者希望在單個植物中固定盡可能多的商業(yè)上有吸引力的性狀，而同時消除盡可能多的不想要的性狀。他的目標是建立一個可市場化的、商業(yè)上有吸引力的產(chǎn)品，其由于例如各種有趣的表型性狀的新組合而在市場上是有競爭力的并且是成功的。
[0010]為了實現(xiàn)該目標，他需要將衍生自親本植物與供體植物雜交的Fl植物反復(fù)與親本植物回交，并且在每一個世代中針對攜帶所有或?qū)嶋H上盡可能多的期望性狀的個體再次選擇。這個過程是非常耗時的，因為通常需要四至六個回交世代和大量的后代群體來獲得主要是純合的并類似于親本植物的系，并且來自供體植物的一個或多個期望的性狀已經(jīng)漸滲并固定其中。
[0011]某些作物(例如萵苣)具有相對短的生命周期，而其它作物(例如胡蘿卜)需要兩年來產(chǎn)生種子。因此，在這樣的作物中，一個新的商業(yè)品種的產(chǎn)生很容易就需要大約8年至大約20年。另外，在選擇和隨后的回交過程中，幾乎所有的存在于供體植物或種質(zhì)(access1n)的基因組中的遺傳變異被丟失了，因為育種者在該供體種質(zhì)中特異性針對他最初鑒定(主要通過表型)的一個或幾個感興趣的性狀進行選擇。如果每個隨后回交世代的群體大小是有限的(例如由于用于植物的種植空間的有限可用性)，植物育種者將不可避免地無法注意并欣賞由供體種質(zhì)的基因組貢獻的其它潛在有趣的性狀。因此，傳統(tǒng)育種面對的是存在于例如野生型種質(zhì)和作物植物的未栽培親緣中的大量遺傳變異開發(fā)不足(under-exploitat1n)的問題。
[0012]本發(fā)明的一個目的是提供一種用于產(chǎn)生非轉(zhuǎn)基因植物的有效方法，其基因組已被導入選自其它基因組的基因組片段，尤其是完整染色體或其部分。本發(fā)明的另一個目的是給傳統(tǒng)育種提供一種快速、非轉(zhuǎn)基因替代方案，其中雜交可以帶有來自超過兩個親本的基因組貢獻被有效地構(gòu)建，并且其中所述育種過程可以通過代表所期望的來自給定植物物種的盡可能多的遺傳變異的工具箱的方式被延續(xù)下去。該工具箱包括植物系的集合，所述植物系的每個攜帶不同子集的染色體或染色體片段，其衍生自一個或多個供體植物。在本申請中，這樣的集合也被稱為文庫。
[0013]反向育種技術(shù)，如W003/017753中所描述并要求保護的，允許從雜合的起始植物有效生產(chǎn)純合植物。該技術(shù)依賴于減數(shù)分裂重組的部分或完全抑制以允許所述雜合起始植物產(chǎn)生孢子，其中雜合起始植物的親本染色體沒有被重組。因而親本染色體被全部傳遞給孢子以及下一代，而沒有與姐妹染色單體的交換(cross-over)。在存在和不存在減數(shù)分裂重組的減數(shù)分裂之間的區(qū)別示于圖1中。
[0014]從通過減數(shù)分裂重組的部分或完全抑制所獲得的孢子，可以通過例如孤雄生殖(androgenesis)或孤雌生殖(gynogenesis)操作方案，或通過采用單倍體誘導子系統(tǒng)而再生單倍體植物。這些單倍體植物的基因組隨后被加倍?；蚪M加倍可自發(fā)地發(fā)生，或通過加入阻斷有絲分裂的化學品例如秋水仙堿(colchicine)、黃草消(oryzalin)或氟樂靈(trifluralin)而發(fā)生，其導致雙單倍體植物(DH植物，DHs)的形成，其能夠產(chǎn)生種子。以這種方式，單倍體系被永生化。
[0015]由該方法得到的DHs具有完全純合的基因組，其由自雜合的起始植物的親本繼承的完整染色體組成，沒有發(fā)生重組。原始親本染色體有各種可能的組合，并且不同DH系的數(shù)量完全取決于所述植物物種的染色體數(shù)目。非整倍體可以在這個階段發(fā)生，因為在減數(shù)分裂結(jié)束期間的胞質(zhì)分裂過程中染色單體隨機遷移至兩個細胞極中的一個。當所得到的孢子或配子是整倍體，即含有該物種基因組典型的單倍體染色體(η)的全部互補體(fullcomplement)時,親本染色單體有2n個可能的組合。這示于圖2A中。
[0016]或者所述DHs恰好對應(yīng)于所述雜合起始植物的兩個親本之一，或者它們的基因組由第一親本的一條或多條染色體結(jié)合第二親本的剩余染色體集組成，以達到該種屬的完整單倍體染色體數(shù)目。這樣的DHs是染色體取代系，其中，當與所述雜合起始植物的原始親本之一比較時，至少一條染色體已被來自另一親本的完整的相應(yīng)染色體取代，而未發(fā)生交換。完整染色體取代的文庫包括能夠由給定的雜合起始植物獲得的所有染色體取代系，并因此包括來自該雜合植物的兩個親本系的所有可能的染色體組合。
[0017]完整的染色體取代文庫可以例如通過減數(shù)分裂重組的部分或完全抑制的方式由給定的雜合起始植物直接獲得(如在反向育種中)，或者，尤其是當該物種的染色體數(shù)目大時，想要獲得所有可能的染色體取代系可能需要兩輪或連續(xù)更多輪的部分或完全抑制減數(shù)分裂重組(類似于兩輪或連續(xù)更多輪的反向育種)。
[0018]在后者的情況下，可以將通過減數(shù)分裂重組的部分或完全抑制獲得的兩個不同的染色體取代系雜交，以產(chǎn)生雜交植物，其中一些染色體以純合狀態(tài)存在，而其它染色體以雜合狀態(tài)存在。在該新的雜交植物中應(yīng)用減數(shù)分裂重組的部分或完全抑制導致額外的染色體取代系的建立。這種在多個步驟中采用減數(shù)分裂重組抑制的方式減少了雜合染色體的數(shù)量并因此非常顯著地增加了獲得期望的獨特核型(親本染色體的特定組合)以及獲得完整的染色體取代文庫的可能性。
[0019]這個概念最好用一個理論例子進行說明，其中采用屬于具有10個染色體對的種屬的雜合起始植物(例如玉米)。當用減數(shù)分裂重組的部分或完全抑制從該起始Fl雜交子產(chǎn)生雙單倍體時，染色體向DH的傳遞通常根據(jù)二項式分布發(fā)生。獲得含有來自雜合起始植物的第一原始親本的5條非重組親本染色體和來自雜合起始植物的第二原始親本的5條非重組親本染色體的DH系的整體概率比獲得含有來自僅一個原始親本的10條非重組染色體的DH的概率高256倍。這是由以下事實造成的——對于具有10條染色體對的種屬——有256種不同的可能性(排列組合)來獲得含有來自第一原始親本的5條非重組親本染色體和來自第二原始親本的5條非重組親本染色體的DH系(例如來自第一親本的染色體1、
I1、II1、IV和V結(jié)合來自第二親本的染色體V1、VI1、VII1、IX和X是獲得包括來自Fl雜交子的每個原始親本的5條染色體的整倍單倍體基因組的一種可能性；第二種可能性是來自第一親本的染色體1、II1、IV、V和VI與來自第二親本的染色體I1、VI1、VII1、IX和X的組合；這樣，對于包括來自Fl雜交子的每個原始親本的5條染色體的整倍單倍體基因組有256種不同的組合是可能的)。
[0020]如果在第一輪反向育種之后還沒有獲得完整的染色體取代文庫，已經(jīng)獲得的染色體取代系的所選擇的成對組合可以在第二輪反向育種中用作起始材料以獲得剩下的染色體取代系。當將所選擇的雙單倍體染色體取代系對雜交時，這將導致對于一些染色體是純合的并對另一些染色體是雜合的后代植物。例如，可以將攜帶來自第一親本的染色體1、11、
II1、IV、V和VI和來自第二親本的染色體VI1、VII1、IX和X的第一DH植物與攜帶來自第一親本的染色體1、I1、II1、IV、V、IX和X和來自第二親本的染色體V1、VII和VIII的第二 DH植物進行雜交。從該雜交得到的后代對于染色體1、I1、II1、IV、V、VII和VIII是純合的，對于染色體V1、IX和X是雜合的。該方法因而降低了基因組的復(fù)雜性，因為所得到的后代(在這個例子中)不是10條雜合染色體，而是僅具有3條雜合染色體，并具有7條純合染色體。當對這樣的后代植物進行反向育種時，其表現(xiàn)就像是只有3個染色體對的植物，因為其它7個染色體對已經(jīng)以純合狀態(tài)被固定。
[0021]當制得幾個這些靶向DH組合時，這種方法將大大增加鑒定由該第二輪反向育種得到的DH群體中親本染色體的所有可能的組合的可能性。因而采用兩輪或更多輪連續(xù)反向育種可以便利地針對具有大量染色體數(shù)量的種屬建立完整的染色體取代文庫，而無需篩選過大的DH群體。
[0022]本發(fā)明人現(xiàn)在設(shè)想，通過提供一種用于遺傳修飾雜交植物的基因組的方法(其通過將它的染色體或染色體片段中的一個或多個替換為一個或多個供體親本的相應(yīng)染色體或染色體片段)，反向育種技術(shù)可以用于將來自一個或多個供體植物的有趣的染色體或染色體片段導入優(yōu)良系或優(yōu)良雜交植物，該方法包括:
[0023]a)將所述雜交植物的親本之一與供體親本之一雜交，以獲得第一 Fl群體，允許所述Fl在抑制重組的同時產(chǎn)生孢子，產(chǎn)生所述孢子的雙單倍體，以獲得染色體取代系的第一群體，
[0024]b)任選地，將所述雜交植物的其它親本與同一個或另一個供體親本雜交，以獲得第二 Fl群體，允許所述Fl在抑制重組的同時產(chǎn)生孢子，產(chǎn)生所述孢子的雙單倍體，以獲得染色體取代系的第二群體，以及
[0025]或者:
[0026]Cl)通過選擇所述第一或所述第二群體的一個個體并將該個體與另一群體的個體或與所述雜交植物的一個親本雜交，產(chǎn)生已經(jīng)獲得供體親本(們)的一個或多個完整染色體的被修飾的雜交植物；
[0027]或者
[0028]c2)通過以下方式產(chǎn)生被修飾的雜交體的群體:
[0029]1.選擇所述第一或所述第二群體的一個個體并將該個體與所述雜交植物的相應(yīng)親本雜交，以及
[0030]i1.允許由該雜交得到的后代植物(們)產(chǎn)生孢子，同時允許重組發(fā)生，以獲得已經(jīng)得到供體親本的一個或多個染色體片段的孢子群體，并制造其雙單倍體，以及
[0031]ii1.將由此獲得的雙單倍體植物與任選地被修飾的雜交植物的另一親本雜交，或與另一個純合系雜交。
[0032]本發(fā)明本質(zhì)上允許針對每個個別染色體育種，同時該植物的基因組的其余部分可以保持未被修飾。以這種方式，通過將其完整的染色體或片段替換為衍生自一個或多個供體植物的相應(yīng)染色體或染色體片段，優(yōu)良雜交品種的親本系能夠以非常靶向的形式針對每個個別染色體進行校正。
[0033]如圖3中所示，本發(fā)明的方法涉及建立染色體取代系的集合和/或漸滲系的集合，本發(fā)明中也被稱為染色體取代文庫和漸滲文庫，其中一個或多個供體種質(zhì)的基因組的部分被固定于來自育種程序的優(yōu)良親本系的基因組中。當這些文庫足夠大時，它們本質(zhì)上可以攜帶所述一個或多個供體種質(zhì)的整個基因組，使得所述一個或多個供體種質(zhì)中存在的基本上所有的遺傳變異被固定于來自育種程序的優(yōu)良親本系的基因組中。
[0034]如例如圖4中所示，本發(fā)明的方法通常能夠構(gòu)建由所選擇的基因組片段組成的雜交體，所述基因組片段衍生自超過兩個親本系，即“多親本雜交體”。這樣的“更高級雜交體”(三元雜交體或三雜交體、多雜交體)給植物育種者提供了極大的靈活性和選擇性，并且該方法因此允許他通過采用大型漸滲文庫作為多功能工具箱并且作為在給定的種或?qū)僦羞z傳變異的幾乎取之不盡、用之不竭的源泉進行創(chuàng)作和設(shè)計植物基因組。
[0035]供體植物要么屬于與親本系相同的種，要么屬于能夠與親本系成功雜交以得到活的并可育的后代的種。如實施例中所示，所述供體植物可以或者是人工培育的品種或親本(自交)系，或野生型種質(zhì)，基因庫種質(zhì)，或轉(zhuǎn)基因植物。
[0036]在被子植物中，孢子可以或是小孢子或是大孢子。這兩種孢子類型均在花中產(chǎn)生，小孢子發(fā)育成雄性配子體(花粉粒)，而大孢子發(fā)育成雌性配子體(胚囊)。孢子通常是減數(shù)分裂的產(chǎn)物，并且它們通常是單倍體，除非例如在減數(shù)分裂過程中發(fā)生第一次分裂復(fù)原(first divis1n restitut1n)或第二次分裂復(fù)原(second divis1n restitut1n)，在這種情況下所述孢子是二倍體。
[0037]取代系(在本申請中也稱為“染色體取代系”)是在它的基因組中攜帶來自另一系或植物的至少一條染色體的系。原始染色體的一個或兩個拷貝已被來自另一系或植物的所述染色體的相應(yīng)的一個或兩個拷貝替換。包括其每個攜帶來自兩個親本源的染色體的不同組合的個別染色體取代系的染色體取代系群體被稱為染色體取代文庫。完整的染色體取代文庫包括親本染色體的所有可能的組合。
[0038]例如，可以建立來自兩個雜交植物的染色體取代系，所述雜交是通過將優(yōu)良雜交的兩個親本系的每一個與第三植物(“供體植物”)雜交獲得的，所述第三植物攜帶親本系及其雜交所缺乏的感興趣的性狀。如果已知感興趣的性狀位于供體植物的哪個染色體和/或性狀的存在可以通過例如分子標記或可檢測的表型的方式鑒定，那么針對兩個親本系的每一個建立特定的染色體取代系是可能的，其在它們的純合基因組中，除了包含供體植物的一條染色體以外，包含親本系的所有染色體。
[0039]然后，可以從每個染色體取代文庫選擇染色體取代系，其攜帶供體植物的攜帶所期望的性狀的染色體。除了由供體植物所貢獻的一條染色體外，這些染色體取代系與親本系是相同的。除了一個染色體對，這樣兩個染色體取代系的雜交將準確地重建所述優(yōu)良雜交植物。與原始優(yōu)良雜交植物相反，所重建的或校正的雜交植物對于所選擇的供體植物的染色體是純合的，而缺少來自它的兩個親本系的相應(yīng)染色體。這示于實施例1中。
[0040]或者，可以選擇將來自優(yōu)良雜交植物的僅一個親本系的染色體拷貝替換為供體植物的相應(yīng)拷貝。這個策略使得能夠通過將一條或更多條染色體取代為其改進的版本而靶向和受控地改進優(yōu)良雜交植物，而不會轉(zhuǎn)基因性引入外源基因。這示于實施例3中。
[0041]這種方法可以達到更高水平的復(fù)雜度，其中通過在優(yōu)良雜交植物的各親本和兩個不同供體系之間建立染色體取代系來實現(xiàn)。以這種方式，有可能用來自不同起源的染色體取代優(yōu)良雜交植物的多個染色體，并因此將從不會在自然界中發(fā)生的染色體組組合到一起。
[0042]通過應(yīng)用本發(fā)明，可以平行建立多個染色體取代文庫，并可以隨后將不同文庫的個別染色體取代系互相組合，以創(chuàng)作或設(shè)計新的遺傳組合。因此可以選擇來自不同遺傳背景的哪些染色體在染色體組中組合到一起，以組成構(gòu)成該物種的整個基因組的完整染色體組。
[0043]在后基因組時代，定位和正確地鑒定構(gòu)成農(nóng)學上重要性狀的基礎(chǔ)的基因組變異正在變得日益可行。數(shù)量性狀基因座(Quantitative Trait Loci, QTL)作圖、標記開發(fā)和基因座測序結(jié)合相關(guān)研究允許研究者確定導致特定表型性狀的基因組信息是由哪個染色體所編碼的，并將這種定位縮小至具體的染色體臂，至染色體區(qū)域，并且最終至單個基因座和/或在SNPs的情況下，定位至單獨核苷酸。
[0044]因此，還可以將上述概括的方法細化至亞染色體水平，并可以具體地建立在它們的基因組中含有來自一個或多個供體植物的一個或多個選定的漸滲片段的植物系和雜交植物，而沒有來自供體植物(們)的任何其它基因組貢獻。這種方法的優(yōu)點是巨大的，因為可以有效地將攜帶期望的遺傳材料的基因組片段導入優(yōu)良雜交植物，而無需早已存在于該優(yōu)良雜交植物中的性狀的復(fù)雜分離，這種復(fù)雜分離在通過傳統(tǒng)育種方式將所述雜交植物與供體植物雜交以導入來自供體植物的期望的遺傳材料時會不可避免地發(fā)生，在該過程中親本基因組通常完全混合并重新組合。
[0045]根據(jù)本發(fā)明，為了將來自供體植物的特定染色體的染色體片段導入兩個親本系的雜交植物，可以首先建立所述親本系之一的染色體取代系，其中所述染色體之一已被所述供體植物的染色體替換。當該純合(雙單倍體)染色體取代系隨后與它所衍生而來的親本系回交時，所得到的Fl植物對于所有染色體是純合的，除了已由供體植物所貢獻的那條染色體。對于后一染色體，所述Fl植物是雜合的，在它的基因組中攜帶衍生自親本系的一個拷貝和衍生自供體植物的一個拷貝。
[0046]然后，當該Fl植物被允許在減數(shù)分裂過程中不抑制染色體重組的情況下產(chǎn)生孢子并且從這些孢子建立DH群體時，該DH群體將會組成純合漸滲文庫。對于以雜合狀態(tài)存在的該條染色體將發(fā)生在非姐妹染色單體之間的隨機重組，而重組對于全部以純合狀態(tài)存在的其它染色體沒有可檢測的作用。這示于圖2B中。
[0047]因為在孢子形成過程中隨機發(fā)生減數(shù)分裂重組，并且一個或多個重組事件可以發(fā)生在每個孢子中，因此以這種方式可以產(chǎn)生幾乎無限多的不同的DHs。這些個別DHs將會彼此不同并且與原始親本系在來自供體植物的該條染色體漸滲親本系基因組的程度上存在不同。
[0048]該漸滲可以由供體植物的單個染色體片段組成，或由供體植物的多個染色體片段組成，取決于產(chǎn)生每個個別配子的減數(shù)分裂過程中已經(jīng)發(fā)生的交換事件的數(shù)目。漸滲片段的大小可能差別巨大，其范圍可能從當兩個交換事件發(fā)生在彼此緊密臨近時的非常小的片段，直至當沒有發(fā)生交換時的整個染色體。該方法還允許染色體內(nèi)的順式-上位相互作用(cis-epistatic interact1n)的作圖。
[0049]因此，漸滲系在另一植物的基因組背景中包括來自供體植物的一個或多個染色體片段。包括其每個攜帶來自供體植物的不同漸滲片段組的個體漸滲系的漸滲系群體被稱為漸滲文庫。群體大小越大，則漸滲文庫變得越完整，但理論上對于任何給定染色體可以有幾乎無限多的漸滲系。在本發(fā)明的上下文中，漸滲文庫是針對每條個體染色體制得的，并且不是隨機基因組范圍的。這是與在傳統(tǒng)植物育種中已知的漸滲文庫(例如RIL或NIL群體)的重要區(qū)別。因此，本發(fā)明的漸滲文庫優(yōu)選包括其中只有一條染色體已經(jīng)獲得供體的一個或多個漸滲片段的系。完整的漸滲文庫包括針對每條染色體的一大組的漸滲系。在每個組內(nèi)，所有其它染色體保持不變，而變異只發(fā)生在屬于該組的該一條染色體中。
[0050]該方法允許建立與親本系的基因組幾乎相同的植物基因組，但在該基因組中已經(jīng)以快速、有效并且非轉(zhuǎn)基因的方式導入了來自供體植物的特定染色體片段。通過采用分子標記、基因組測序和/或表型分析，可以在這樣的純合漸滲文庫中鑒定個體植物，其基因組包括來自攜帶感興趣的性狀的供體植物的染色體片段。因此，期望的性狀可以被特異性地導入親本系或優(yōu)良雜交植物的基因組，而無需轉(zhuǎn)基因方法或耗時和重復(fù)的回交。親本系或雜交植物的基因組通過將基因組的部分用來自另一植物的相應(yīng)部分替換、保持基因組的其余部分不變，從而在本質(zhì)上被“校正”。該方法示于實施例4、5和7中。
[0051]本發(fā)明提供一種用于遺傳修飾雜交植物的基因組的方法，其通過將它的染色體或染色體片段的一個或多個替換為一個或多個供體親本的相應(yīng)染色體或染色體片段來實施，所述方法包括:
[0052]a)將所述雜交植物的親本之一與供體親本之一雜交，以獲得第一 Fl群體，允許所述Fl在抑制重組的情況下產(chǎn)生孢子，產(chǎn)生所述孢子的雙單倍體，以獲得染色體取代系的第一群體，
[0053]b)任選地，將所述雜交植物的另一親本與同一個或另一個供體親本雜交，以獲得第二 Fl群體，允許所述Fl在抑制重組的情況下產(chǎn)生孢子，產(chǎn)生所述孢子的雙單倍體，以獲得染色體取代系的第二群體，以及
[0054]c)通過選擇所述第一或所述第二群體的一個個體并將該個體與另一群體的個體或與所述雜交植物的親本雜交，產(chǎn)生已經(jīng)獲得供體親本(們)的一個或多個完整染色體的被修飾的雜交植物。
[0055]本發(fā)明還提供一種用于遺傳修飾雜交植物的基因組的方法，其通過將它的染色體或染色體片段的一個或多個替換為一個或多個供體親本的相應(yīng)染色體或染色體片段來實施，所述方法包括:
[0056]a)將所述雜交植物的親本之一與供體親本之一雜交，以獲得第一 Fl群體，允許所述Fl在抑制重組的同時產(chǎn)生孢子，產(chǎn)生所述孢子的雙單倍體，以獲得染色體取代系的第一群體，
[0057]b)將所述雜交植物的另一親本與同一個或另一個供體親本雜交，以獲得第二 Fl群體，允許所述Fl在抑制重組的同時產(chǎn)生孢子，產(chǎn)生所述孢子的雙單倍體，以獲得染色體取代系的第二群體，以及
[0058]c)通過選擇所述第一或所述第二群體的一個個體并將該個體與另一群體的個體或與所述雜交植物的一個親本雜交，產(chǎn)生已經(jīng)獲得供體親本(們)的一個或多個完整染色體的被修飾的雜交植物。
[0059]在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種用于遺傳修飾雜交植物的基因組的方法，其通過將它的染色體或染色體片段的一個或多個替換為一個或多個供體親本的相應(yīng)染色體或染色體片段來實施，所述方法包括:
[0060]a)將所述雜交植物的親本之一與供體親本之一雜交，以獲得第一 Fl群體，允許所述Fl在抑制重組的同時產(chǎn)生孢子，產(chǎn)生所述孢子的雙單倍體，以獲得染色體取代系的第一群體，
[0061]b)任選地，將所述雜交植物的另一親本與同一個或另一個供體親本雜交，以獲得第二 Fl群體，允許所述Fl在抑制重組的同時產(chǎn)生孢子，產(chǎn)生所述孢子的雙單倍體，以獲得染色體取代系的第二群體，以及
[0062]c)通過下述操作產(chǎn)生被修飾的雜交植物的群體:
[0063]1.選擇所述第一或所述第二群體的一個個體并將該個體與所述雜交植物的相應(yīng)親本雜交，以及
[0064]?.允許由該雜交得到的后代植物(們)產(chǎn)生孢子，同時允許重組發(fā)生，以獲得已經(jīng)得到供體親本的一個或多個染色體片段的孢子群體，并制造其雙單倍體，以及
[0065]ii1.將由此獲得的雙單倍體植物與雜交植物的另一親本雜交，或與另一個純合系雜父。
[0066]在又一個實施方案中，本發(fā)明提供一種用于遺傳修飾雜交植物的基因組的方法，其通過將它的染色體或染色體片段的一個或多個替換為一個或多個供體親本的相應(yīng)染色體或染色體片段來實施，所述方法包括:
[0067]a)將所述雜交植物的親本之一與供體親本之一雜交，以獲得第一 Fl群體，允許所述Fl在抑制重組的同時產(chǎn)生孢子，產(chǎn)生所述孢子的雙單倍體，以獲得染色體取代系的第一群體，
[0068]b)將所述雜交植物的另一親本與同一個或另一個供體親本雜交，以獲得第二 Fl群體，允許所述Fl在抑制重組的同時產(chǎn)生孢子，產(chǎn)生所述孢子的雙單倍體，以獲得染色體取代系的第二群體，以及
[0069]c)通過下述操作產(chǎn)生被修飾的雜交植物的群體:
[0070]1.選擇所述第一或所述第二群體的一個個體并將該個體與所述雜交植物的相應(yīng)親本雜交，以及
[0071]i1.允許由該雜交得到的后代植物(們)產(chǎn)生孢子，同時允許重組發(fā)生，以獲得已經(jīng)得到供體親本的一個或多個染色體片段的孢子的群體，并制造其雙單倍體，以及
[0072]ii1.將由此獲得的雙單倍體植物與雜交植物的另一親本雜交，或與另一個純合系雜父。
[0073]本發(fā)明還涉及一種用于遺傳修飾雜交植物的基因組的方法，其通過將它的染色體或染色體片段的一個或多個替換為一個或多個供體親本的相應(yīng)染色體或染色體片段來實施，所述方法包括:
[0074]a)將所述雜交植物的親本之一與供體親本之一雜交，以獲得第一 Fl群體，允許所述Fl在抑制重組的同時產(chǎn)生孢子，產(chǎn)生所述孢子的雙單倍體，以獲得染色體取代系的第一群體，
[0075]b)將所述雜交植物的另一親本與同一個或另一個供體親本雜交，以獲得第二 Fl群體，允許所述Fl在抑制重組的同時產(chǎn)生孢子，產(chǎn)生所述孢子的雙單倍體，以獲得染色體取代系的第二群體，以及
[0076]c)通過下述操作產(chǎn)生被修飾的雜交植物的群體:
[0077]1.選擇所述第一或所述第二群體的一個個體并將該個體與所述雜交植物的相應(yīng)親本雜交，以及
[0078]i1.允許由該雜交得到的后代植物(們)產(chǎn)生孢子，同時允許重組發(fā)生，以獲得已經(jīng)得到供體親本的一個或多個染色體片段的孢子的群體，并制造其雙單倍體，以及
[0079]ii1.將由此獲得的雙單倍體植物與根據(jù)步驟b)被修飾的雜交植物的另一親本雜交，或與另一個純合系雜交。
[0080]選擇所述第一或所述第二群體的一個個體可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方式完成。例如，可以基于表型特征和/或基于基因組測試(例如通過DNA標記分析、單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測、DNA測序等)選擇所述個體。
[0081]染色體重組的抑制可以通過干擾重組中涉及的一個或多個靶基因來實現(xiàn)。在一個實施方案中，所述一個或多個靶基因參與雙鏈斷裂，例如SP011、MER1、MER2、MRE2、MEI4、REC102、REC104、REC114、MEK1/MRE4、REDl、HOPl、RAD50、MREl1、XRS2 或它們的功能性同系物。
[0082]所述一個或多個靶基因還可以參與染色體配對和/或鏈交換，例如RHD54/TID1、DMCl、SAE3、REDl、H0P1、H0P2、REC8、MER1、MRE2、ZIPl、ZIP2、MEI5、RAD51、RAD52、RAD54、RAD55、RAD57、RPA、SMC3、SCCl、MSH2、MSH3、MSH6、PMS1、S0L0DANCERS、HIM6、CHK2 或它們的功能性同系物。
[0083]所述一個或多個靶基因還可以參與減數(shù)分裂重組過程，例如SGS1、MSH4、MSH5、ZIPl和ZIP2或它們的功能性同系物。
[0084]在另一個實施方案中，所述一個或多個靶基因選自由以下基因組成的組:PRD1、PRD2、PRD3、PHSl、NBSl、COMl、MNDl、MER3/RCK、ZIP3、ZIP4、PTD、SHOCl、ZYPl、MLHl、MLH3 或它們的功能性同系物。
[0085]對所述一個或多個靶基因的干擾可以由阻斷其轉(zhuǎn)錄組成。在一個優(yōu)選的實施方案中，通過針對靶基因啟動子的RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸或RNAi分子的方式阻斷轉(zhuǎn)錄。在另一個優(yōu)選的實施方案中，通過作用于靶基因啟動子的負作用轉(zhuǎn)錄因子的表達的方式阻斷轉(zhuǎn)錄。
[0086]對所述一個或多個靶基因的干擾可以由破壞靶基因mRNA或轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性組成，優(yōu)選通過與靶基因mRNA或轉(zhuǎn)錄物互補的核酸分子的方式，其選自以下組成的組:反義RNA、RNAi分子、病毒誘導的基因沉默(VIGS)分子、共抑制子分子、RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸或 sgRNA 分子(小向?qū)?RNA，如 Qi et al, 2013, Cell 152:1173-1183 所述的 CRISPRi系統(tǒng)的部分)。
[0087]在又一個實施方案中，對所述一個或多個靶基因的干擾由抑制靶基因表達產(chǎn)物組成，優(yōu)選通過一個或多個顯性失活核酸構(gòu)建體的表達產(chǎn)物的方式，或優(yōu)選通過一種或多種化學化合物的方式。
[0088]在另一個實施方案中，任何旨在通過干擾涉及重組的一個或多個靶基因而抑制染色體重組的轉(zhuǎn)基因方法可以涉及誘導型啟動子序列的使用。在該方法中，憑借外部因素或處理作用于與轉(zhuǎn)基因核酸序列可操作地連接的啟動子序列的活性，這些外部因素或處理可用于誘導和/或調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因的時間和/或空間表達模式。所述可誘導型啟動子可選自以下啟動子組成的組:熱誘導型啟動子、化學誘導型啟動子、類固醇誘導型啟動子、醇誘導型啟動子或其它啟動子。用誘導所述誘導型啟動子活性的試劑和/或條件對發(fā)生減數(shù)分裂性重組的階段或該階段不久之前的花序或花蕾進行處理(例如熱休克或熱處理、特異性化學品、特異性類固醇如地塞米松或醇)激活了所述誘導型啟動子，其導致轉(zhuǎn)基因的瞬時表達。
[0089]在另一個實施方案中，對所述一個或多個靶基因的干擾由將一個或多個突變導入所述靶基因組成，優(yōu)選顯性作用突變，導致其生物功能的擾動，并且所述一個或多個突變優(yōu)選通過以下方式隨機導入:一種或多種化學化合物，例如甲磺酸乙酯、亞硝基甲脲、羥胺、二氛基B丫卩定、N-甲基-N-亞硝基狐、N-乙基-N-亞硝基服、N-甲基-N-硝基_亞硝基狐、硫酸二乙酯、吖丙啶、疊氮化鈉、福爾馬林、烏拉坦、苯酚和環(huán)氧乙烷，和/或通過物理方式，例如UV輻射、快中子照射、X射線、Y輻射，和/或通過遺傳元件的插入，例如轉(zhuǎn)座子、T-DNA、逆轉(zhuǎn)錄病毒元件，和/或?qū)⑺鲆粋€或多個突變通過同源重組、基于寡核苷酸的誘變、鋅指核酸酶(ZFNs)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)子核酸酶(TALENs)或規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat,CRISPR)系統(tǒng)的方式特異性導入。
[0090]雙單倍體可以由孢子通過以下方式產(chǎn)生:首先通過孤雄生殖的方式，例如小孢子培養(yǎng)或花藥培養(yǎng)，通過孤雌生殖的方式，或通過誘導來自由受精事件得到的受精卵缺失母體染色體的方式建立所述孢子的單倍體植物，然后加倍由此獲得的單倍體植物的基因組。
[0091]基因組加倍可自發(fā)地發(fā)生，或其可以通過化學品(例如秋水仙堿、黃草消或氟樂靈)的應(yīng)用被誘導。這些化學品破壞有絲分裂過程中紡錘體的形成，并通常用于有絲分裂的阻斷。
[0092]來自由受精事件得到的合子的母體染色體的缺失可以通過在雜交中將單倍體誘導子系作為雌性來誘導。單倍體誘導子系統(tǒng)已經(jīng)在各種植物物種進行了描述。在一個實施方案中，所述雌性是不同種屬的植物。在種間雜交中，經(jīng)常觀察到親本之一的基因組的喪失，例如在小麥和珍珠粟之間、在大麥和球莖大麥(Hordeum bulbosum)之間以及在煙草(Nicotiana tabacum)和 Nicotiana africana 之間的雜交中。
[0093]所述雌性植物還可以是包括異源轉(zhuǎn)基因表達盒的轉(zhuǎn)基因植物，所述表達盒包括可操作地連接多核苷酸的啟動子，所述多核苷酸編碼重組性改變的CENH3、CENPC, MIS12、NDC80或NUF2多肽，并具有相應(yīng)失活的內(nèi)源性CENH3、CENPC, MIS12、NDC80或NUF2基因。這個實施方案首先描述于擬南芥(Arabidopsis thaliana) (Maruthachalam Ravi&Simonff.L.Chan ；Haploid plants produced by centromere-mediated genome eliminat1n ；Nature 464 (2010), 615-619 ；US-2011/0083202 ;W02011/044132)，并且其在植物中是可以廣泛應(yīng)用的。
[0094]允許重組發(fā)生可以通過不再干擾涉及重組的一個或多個靶基因來實現(xiàn)。當已經(jīng)通過轉(zhuǎn)基因的方式實現(xiàn)重組的抑制時，允許重組發(fā)生可通過從基因組去除由其抑制重組的該轉(zhuǎn)基因，或通過選擇在基因組中不存在該轉(zhuǎn)基因來實現(xiàn)。當已經(jīng)通過誘導型轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的方式實現(xiàn)重組的抑制時，允許重組發(fā)生可通過不再將所述植物暴露給激活驅(qū)動所述轉(zhuǎn)基因表達的所述誘導型啟動子的外部因素或處理來實現(xiàn)。當已經(jīng)通過一種或多種化學品的方式實現(xiàn)重組的抑制時，允許重組發(fā)生可通過不再應(yīng)用由其抑制重組的所述一種或多種化學品來實現(xiàn)。
[0095]在一個實施方案中，允許重組以高于平均水平的頻率發(fā)生。但是，在實踐中，彼此緊密臨近的多個交換事件的發(fā)生是被自然抑制的，使得漸滲片段通常不會非常小。這種現(xiàn)象被稱為染色體干擾或交換干擾。
[0096]在減數(shù)分裂重組過程中交換事件可以沿著染色體的長度隨機發(fā)生，在同一個減數(shù)分裂過程中多個交換事件可以在同一條染色體中發(fā)生。但是，已知在獨立交換事件之間發(fā)生干擾，使得兩個重組事件通常不彼此緊密臨近發(fā)生。在傳統(tǒng)植物育種過程中，這會導致潛在的大型基因組片段的延續(xù)(carry-over)，所述片段是不希望的并且可能包括具有負作用的基因，因為在將人工培育系與例如野生型物種雜交之后，它們在遺傳上以及在物理上與育種者所選擇的期望性狀相連鎖的。
[0097]通常，當希望保留感興趣的性狀時，這些基因組片段是很難去除的，因為其會要求期望性狀的附近發(fā)生兩個交換事件，而這極其罕見。這個問題被稱為“連鎖累贅(linkage-drag) ”。
[0098]但是，在減數(shù)分裂過程中通過提高重組頻率有可能進一步增加可能的交換事件的數(shù)目。例如，這可以通過在天然抑制染色體干擾的一個或多個基因中引入突變來實現(xiàn)(例如FANCM)，或通過抑制這些基因的表達來實現(xiàn)，如實施例8中所示。這會導致甚至更大可能數(shù)目的不同的純合漸滲系，因為它允許彼此緊密臨近的交換事件發(fā)生，并且它增加沿著染色體的交換事件的總數(shù)。這具有明顯的優(yōu)點:漸滲片段可以被限制為僅一個或少數(shù)基因，并因此可以有效防止連鎖累贅。這進一步提高了本發(fā)明的方法的效率。
[0099]在一個實施方案中，干擾天然抑制染色體干擾的所述一個或多個基因可以由阻斷其轉(zhuǎn)錄組成。在一個優(yōu)選的實施方案中，通過直接針對所述基因啟動子的RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸或RNAi分子的方式阻斷轉(zhuǎn)錄。在另一個優(yōu)選的實施方案中，通過表達作用于靶基因啟動子的負作用轉(zhuǎn)錄因子的方式阻斷轉(zhuǎn)錄。
[0100]在另一個實施方案中，干擾天然抑制染色體干擾的所述一個或多個基因可以由破壞靶基因mRNA或轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性組成，優(yōu)選通過與靶基因mRNA或轉(zhuǎn)錄物互補的核酸分子的方式，其選自以下分子組成的組:反義RNA、RNAi分子、病毒誘導的基因沉默(VIGS)分子、共抑制子分子、RNA寡核苷酸或DNA寡核苷酸。在又一個實施方案中，干擾天然抑制染色體干擾的所述一個或多個基因可以由抑制靶基因表達產(chǎn)物組成，優(yōu)選通過一個或多個顯性失活核酸構(gòu)建體的表達產(chǎn)物的方式，或優(yōu)選通過一種或多種化學化合物的方式。
[0101 ] 在另一個實施方案中，任何旨在干擾天然抑制染色體干擾的一個或多個基因的轉(zhuǎn)基因方法可以涉及誘導型啟動子序列的使用。在該方法中，憑借外部因素或處理作用于與轉(zhuǎn)基因核酸序列可操作地連接的啟動子序列的活性，這些外部因素或處理可用于誘導和/或調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因的時間和/或空間表達模式。所述可誘導型啟動子可選自以下啟動子組成的組:熱誘導型啟動子、化學誘導型啟動子、類固醇誘導型啟動子和醇誘導型啟動子。用誘導所述誘導型啟動子活性的試劑和/或條件在減數(shù)分裂重組發(fā)生的階段或該階段不久之前處理花序或花蕾(例如熱休克或熱處理、特異性化學品、特異性類固醇如地塞米松或醇)激活了所述誘導型啟動子，其導致轉(zhuǎn)基因的瞬時表達。
[0102]在另一個實施方案中，干擾天然抑制染色體干擾的一個或多個基因由將一個或多個突變導入所述基因組成，導致其生物功能的擾動，并且所述一個或多個突變優(yōu)選隨機導入，其通過一種或多種化學化合物的方式實現(xiàn)，例如甲磺酸乙酯、亞硝基甲脲、羥胺、二氨基口丫唳、N_甲基-N-亞硝基狐、N-乙基-N-亞硝基服、N-甲基-N-硝基_亞硝基狐、硫酸二乙酯、吖丙啶、疊氮化鈉、福爾馬林、烏拉坦、苯酚和環(huán)氧乙烷，和/或通過物理方式實現(xiàn)，例如UV輻射、快中子照射、X射線、Y輻射，和/或通過遺傳元件的插入實現(xiàn)，例如轉(zhuǎn)座子、T-DNA、逆轉(zhuǎn)錄病毒元件，和/或所述一個或多個突變通過以下方式特異性導入:同源重組、基于寡核苷酸的突變誘導、鋅指核酸酶(ZFNs)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)子核酸酶(TALENs)或規(guī)律成族的間隔短回文重復(fù)(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat,CRISPR)系統(tǒng)。
[0103]本發(fā)明還涉及取代系的文庫，其由本發(fā)明的方法可以獲得。優(yōu)選地，在這樣的文庫的每一個取代系中，一條染色體衍生自供體植物，并且其它染色體衍生自雜交植物的親本系O
[0104]此外，本發(fā)明涉及漸滲系的文庫，其由本發(fā)明的方法可以獲得。優(yōu)選地，這樣的文庫包括一組或多組漸滲系，其中在每組漸滲系中，一條染色體包括衍生自供體植物的一個或多個漸滲片段，并且其它染色體衍生自雜交植物的親本系。所述文庫優(yōu)選包括針對每條染色體的一組漸滲系。優(yōu)選地，每組僅在一條染色體方面有變化。這種改變可以是或者通過原始染色體的一個或兩個拷貝已被所述供體的染色體替換，或者已經(jīng)在原始染色體的一個或兩個拷貝上替換了一個或多個染色體片段。通過針對作物種屬的每條染色體組合這些組，可以構(gòu)建含有許多可能的變體的完整文庫。由于每個系優(yōu)選僅在一條染色體方面有不同，有效選擇僅那些攜帶期望的染色體或染色體片段的系用于雜交是可能的。因此，不再需要重復(fù)回交以去除不期望的供體染色體或染色體片段。文庫中的系優(yōu)選是純合的。
[0105]因此，本發(fā)明還涉及使用這樣的文庫進行加速的植物育種或雜交植物校正的用途。加速的植物育種包括從文庫選擇一個或多個系，所述系包括期望的供體染色體或攜帶期望的供體來源漸滲片段的染色體，并將所選擇的系與另一個植物雜交，例如雜交植物的親本系。雜交植物校正包括被修飾的親本系的選擇，所述被修飾的親本系包括期望的供體染色體或攜帶期望的供體來源漸滲片段的染色體，并將所選擇的系與雜交植物的另一親本雜交。在一個實施方案中，所述雜交植物的另一親本選自取代或漸滲文庫。
[0106]上面概述的方法使得研究者或植物育種者能夠以非常靶向和有效的方式“校正”親本系及其所衍生的雜交植物，而不必使得所得到的植物成為轉(zhuǎn)基因的，并且無需許多回交世代。其要求的是，優(yōu)選大型純合漸滲系，由其中每個植物包括不同大小的一個或多個隨機漸滲片段的植物組成，所述漸滲片段衍生自一個或多個供體植物，可逆地實現(xiàn)減數(shù)分裂重組的部分或完全抑制的方式，以及隨后允許減數(shù)分裂重組再次正常進行的方式。
[0107]采用本發(fā)明的方法，建立來自供體植物的染色體或染色體片段已經(jīng)特異性地漸滲其中的親本系是可能的，而沒有將親本系和供體植物的整個基因組混合并重組(reshuffling)。因此，可以針對每個個體染色體進行植物育種，而所述植物的其它染色體保持完整、純合并因而不變。染色體或染色體片段能夠以靶向的方式被特異性交換、校正和替換，并且不期望的遺傳特征能夠從植物基因組去除。
[0108]以本發(fā)明的方法平行產(chǎn)生的“校正”過的親本系可以隨后互相雜交，以產(chǎn)生雜交植物，其基因組包括它們的親本系已經(jīng)從一個或多個供體植物獲得的所述不同漸滲片段。
[0109]故此，有可能例如親本系之一在其染色體之一上已經(jīng)獲得供體植物的漸滲片段，同時另一親本系在另一染色體上已經(jīng)獲得同一或另一個供體植物的漸滲片段。然后，這兩個親本系的雜交會導致在兩個染色體上帶有“校正”的雜交后代植物(或者是全部染色體，或者是特定染色體片段)。這例如實施例4中所示。
[0110]或者，有可能在Fl雜交植物的孢子的形成過程中再次部分或完全抑制減數(shù)分裂重組，以建立所述漸滲片段純合的DHs。在這種情況下，所述漸滲片段在遺傳上是被固定的。
[0111]在甚至更高水平的復(fù)雜度上，還可以通過將來自同一供體植物和/或來自一個或多個不同的供體植物的額外的染色體片段漸滲至親本系來繼續(xù)該過程。以這種方式，通過將來自不同種質(zhì)(germplasm)的所選擇的染色體片段漸滲至優(yōu)良親本系，而不混合整個基因組并因而失去已經(jīng)存在于親本系中的所有其它期望的性狀和基因組特征的組合，可以有效“設(shè)計”植物基因組。這個方法允許在植物基因組中有效形成金字塔式性狀，而無需重復(fù)回交以固定性狀，如在傳統(tǒng)植物育種的情況下實施的，并且沒有使得終產(chǎn)物成為轉(zhuǎn)基因的，如當應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)時的情況下。
[0112]此外，當應(yīng)用本發(fā)明的方法時，衍生自所述一個或多個供體種質(zhì)的性狀以與它們在供體植物中相同的基因組背景和位置被精確地導入親本系基因組。這與轉(zhuǎn)基因技術(shù)相反，其中轉(zhuǎn)基因的整合位點通常是隨機的并且不能進行選擇。這樣的隨機插入可能導致例如親本系基因組中的內(nèi)源性基因的破壞，并因此導致額外的不期望的和不可預(yù)測的表型作用，并且通常轉(zhuǎn)基因插入的隨機性質(zhì)是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的嚴重缺陷。當應(yīng)用本發(fā)明的方法時，所述一個或多個供體植物的染色體片段本質(zhì)上替換親本系中的相應(yīng)染色體片段，從而保持了基因組背景。
[0113]在(純合)染色體取代文庫和(純合)漸滲文庫中，在已知適于生產(chǎn)優(yōu)良雜交植物的親本系的基因組背景中，來自任意數(shù)目的供體系的遺傳變異可以被固定并被充分保持以供將來使用。因此，這個方法解決了存在于傳統(tǒng)育種中的重要問題，即在育種過程中留在供體植物(例如野生型種質(zhì))的基因組中的大部分天然變異仍然開發(fā)不足、被忽視和不被重視的事實，因為育種者必須專注于感興趣的預(yù)先確定的性狀，并且在育種過程中，與那些預(yù)先確定的性狀不是緊密地在遺傳上或物理上連鎖的其它遺傳變異被丟失了。
[0114]這對于僅以純合狀態(tài)存在時才導致可檢測表型(例如隱性突變)、并會因其它顯性等位基因變體的存在而被遮蔽的遺傳變異尤其是個問題。純合染色體取代文庫和/或純合漸滲文庫的建立帶來一個大型工具箱，其中這樣的隱性性狀可以在不受來自不同遺傳背景的顯性等位基因的影響而被評估。如果特定純合漸滲系表現(xiàn)出建立其的親本系中不存在的表型，該表型的遺傳基礎(chǔ)可以追溯至由供體植物已經(jīng)貢獻給植物基因組的漸滲片段之一。在此，沒有任何性狀會在下一代中丟失或被遮蔽的風險，因為所述漸滲系是完全純合的DH系，其能夠產(chǎn)生種子，并且其通過自交的后代本質(zhì)上會是克隆。因此，這個方法使得能夠以有效得多的方式開發(fā)植物物種的基因組，并能夠以最佳方式使用種屬內(nèi)或一組相關(guān)種屬內(nèi)存在的遺傳變異，能夠優(yōu)化屬于該種屬或相關(guān)種屬組的商業(yè)上感興趣的植物的遺傳特征，例如蔬菜、果樹、觀賞植物和大田作物。
[0115]當應(yīng)用本發(fā)明的方法時，能夠例如在給定的感興趣種屬的個體植物的基因組中鑒定突變或其它遺傳特征，例如親本系，或野生型人工培育的親緣，或誘變的植物，或轉(zhuǎn)基因植物，并將該突變或遺傳特征特異性并非常有效地導入該種屬的優(yōu)良系。
[0116]本發(fā)明可以被應(yīng)用與所有能夠被轉(zhuǎn)化的和從其可以制得雙單倍體的植物物種。可以對其實施本發(fā)明的作物種屬包括但不限于煙草、楊樹、玉米、小麥、大麥、水稻、高粱、糖用甜菜、油籽油菜、黑麥草、向日葵、大豆、番茄、黃瓜、小黃瓜、野苣、菠菜、胡椒、矮牽牛、土豆、茄子、甜瓜、西瓜、胡蘿卜、蘿卜、萵苣、蕓苔屬蔬菜(甘藍、花椰菜、西蘭花、球莖甘藍、抱子甘藍)、韭菜、蠶豆、豌豆、苦苣、菊苣、洋蔥、草莓、茴香、菜用甜菜、芹菜、塊根芹、蘆筍、向日葵、葡萄、木薯、樓桃、蘋果、梨、桃、香蕉、郁金香、矮牽牛、玫瑰和菊花(Chrysanthemum)。
[0117]染色體取代系(也稱為“取代系”)是在它們的基因組中攜帶來自另一個系或植物的至少一條染色體的系。來自第一系或植物的原始染色體或染色體們的一個或兩個拷貝已被來自另一個系或植物的該染色體或染色體們的相應(yīng)的一個或兩個拷貝替換(取代)。剩下的染色體與原始存在于所述第一系或植物的那些相同。
[0118]在本發(fā)明的上下文中，取代系的文庫(也稱為“染色體取代系的文庫”或“染色體取代文庫”)是指包括個體染色體取代系的染色體取代系群體，其中每個個體染色體取代系攜帶來自兩個不同親本來源的完整染色體的不同組合。
[0119]完整的染色體取代文庫包括來自兩個不同親本來源的親本染色體的所有可能的組合。例如，在帶有5個染色體對的二倍體種屬擬南芥中，染色體取代系的完整文庫包括2X=25 = 32個成員(系)。在起始Fl植物中所含有的所有遺傳變異存在于該32個植物的小文庫中。完整的取代文庫允許以前所未有的方式進行上位相互作用檢測。代表所有染色體部分的NIL文庫將要求幾乎無限多的雜交和回交，甚至還遠遠達不到這種情況。
[0120]漸滲系是在另一個系或植物的基因組背景中包括來自供體系或植物的一個或多個染色體片段的系或植物。第一系或植物在其基因組與供體系或植物的基因組混合，并且來自該供體系或植物的一個或多個染色體片段被漸滲至所述第一系或植物的基因組內(nèi)的可以變成漸滲系。
[0121]在本發(fā)明的上下文中，漸滲系的文庫(也稱為“漸滲文庫”)是指其每個攜帶來自供體系或植物的不同組漸滲片段的個體漸滲系或植物的群體。在本發(fā)明的上下文中，漸滲文庫是針對每條個體染色體制得的，并且不是隨機基因組范圍的。這是與在傳統(tǒng)植物育種中已知的漸滲文庫的一個重要區(qū)別。因此，本發(fā)明的漸滲文庫優(yōu)選包括其中只有一條染色體已經(jīng)獲得供體的一個或多個漸滲片段的系或植物。完整的漸滲文庫可以包括針對每條染色體的一組漸滲系或植物。在每個組內(nèi)，所有其它染色體保持不變，并且變異只發(fā)生在屬于該組的所述一條染色體中。
[0122]純合漸滲文庫由其中每個系含有不同大小的一個或多個隨機漸滲片段(優(yōu)選在一個染色體上)的系組成，其衍生自一個或多個供體系或植物，并且其中所有染色體以完全純合的狀態(tài)存在，使得所有遺傳信息被遺傳性固定。
[0123]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“雜交植物校正”是指雜交植物基因組中的至少一個染色體拷貝或染色體片段被來自一個或多個供體系或植物的相應(yīng)染色體拷貝或染色體片段替換，而不破壞或喪失在雜交植物基因組的剩余部分中存在的性狀的特定組合。以這種方式，早已組合在雜交基因組中(并且如果雜交植物被允許與自身或與供體植物進行有性雜交，將在下一代中互相分離)的所有期望的性狀保持不變，而雜交植物基因組中的特定缺陷或不期望的或商業(yè)上低劣的性狀可以通過用另一種(商業(yè)上優(yōu)良的)版本替換它們而被“校正”，而不必使得終產(chǎn)物成為轉(zhuǎn)基因性的?！半s交植物校正”可以例如導致野生型等位基因的導入以替換不想要的突變等位基因，導致優(yōu)良突變等位基因的導入以替換野生型等位基因，導致轉(zhuǎn)基因的位點特異性導入或消除等。因此，“雜交植物校正”可以例如帶來連鎖累贅的去除，帶來特定突變和/或轉(zhuǎn)基因?qū)腚s交植物基因組，并通常帶來雜交植物基因組的微調(diào)和進一步改善，而沒有丟失早已存在于該雜交植物基因組中的期望性狀組合的風險(由于分離)。實際基因組校正優(yōu)選在雜交有機體的親本系中進行，使得基因組校正的作用可以在純合有機體中延續(xù)，以方便地在未來研究和育種活動中使用和開發(fā)。在實踐中，“雜交植物校正”可以例如包括系的選擇，所述系包含來自已從雜交植物的第一親本制得的取代或漸滲文庫的期望的供體染色體或攜帶期望的供體來源漸滲片段的染色體，并將所選擇的系與雜交植物的第二親本雜交，或與從來自已從雜交植物的第二親本制得的取代或漸滲文庫所選擇的另一個系雜交。對于建立來自雜交植物的第一和/或第二親本的取代或漸滲文庫，可以采用或者同一供體系或植物或者遺傳上不同的供體系或植物。
[0124]盡管已經(jīng)詳細闡述了本發(fā)明及其優(yōu)點，應(yīng)當理解的是，在此可以進行各種變化、取代和變更而不偏離如所附權(quán)利要求中所定義的本發(fā)明的精神和范圍。
[0125]本發(fā)明以下面的實施例進一步闡述，并不以任何方式限定本發(fā)明。在這些實施例中，參考以下的圖:
[0126]圖1:在存在和不存在減數(shù)分裂重組的情況下減數(shù)分裂的比較，接著DH的生產(chǎn)。圖A示出了在存在減數(shù)分裂重組的情況下從Fl雜交植物形成DHs中的連續(xù)步驟。染色體復(fù)制(2η至4η)后，基因組范圍的交換事件隨機發(fā)生(減數(shù)分裂重組)，導致由雜交植物的兩個親本系貢獻給雜交植物基因組的染色體的重組(reshuffling)。在孢子形成過程中，形成單倍體染色體組(η)，當DHs由這些孢子形成時，它們的基因組隨后加倍。最終的結(jié)果是RIL樣DHs群體(其中這里只顯示了兩個例子)，其中重組的基因組被遺傳固定。另一方面，圖B顯示了在不存在減數(shù)分裂重組的情況下從Fl雜交植物形成DHs中的連續(xù)步驟。這兩個親本基因組沒有發(fā)生重組(reshuffling)，并且孢子含有完整親本染色體的隨機的并通常是新的組合。當DHs由這些孢子形成時，它們的基因組被加倍，并且最終的結(jié)果是純合染色體取代系群體(或純合染色體取代文庫)。該圖上只顯示了兩個例子。為了簡單起見，該圖只顯示了四條染色體，以說明其普遍原理。
[0127]圖2:取代和漸滲系的建立。圖A顯示了來自Fl雜交植物的四個不同染色體取代系的建立(沒有顯示圖1中的步驟；這里只顯示了單倍體染色體組，而實際上DHs由這些孢子制得，由此染色體組是加倍的)。當DHs與其所衍生自的雜交植物的親本系之一雜交時，這導致了染色體取代系，其針對一條染色體是雜合的，但對其它染色體是純合的。圖B示出了這樣的染色體取代系是如何用于產(chǎn)生針對一條染色體的漸滲文庫。重要的是，減數(shù)分裂重組被允許在這個階段正常進行。此圖最終的結(jié)果是一個孢子群體，其中每個個體孢子含有雜交植物的第一親本的基因組，在其染色體之一中帶有來自雜交植物的第二親本的一個或多個漸滲片段。為了簡單起見，該圖只顯示了四條染色體，以說明其普遍原理。
[0128]圖3:品系設(shè)計。圖A示出了本質(zhì)上用于本發(fā)明的方法的植物:雜交植物的兩個親本系，和在本申請中定義為供體植物的第三系(在框中描繪的)。圖B顯示了親本系之一是如何與供體植物雜交的，產(chǎn)生Fl雜交植物。在圖C中，該Fl雜交植物用于建立純合染色體取代系，通過在不存在減數(shù)分裂重組的情況下從由該Fl雜交植物形成的孢子建立DHs來實現(xiàn)，如圖1和2中詳細示出的。在圖D中，純合染色體取代系之一——其對應(yīng)于圖A的第一親本系的“被校正”版本——與圖A的第二親本系雜交。該雜交的Fl對應(yīng)于圖A的雜交植物的被校正版本。對于它的一條染色體，一個拷貝已由供體植物貢獻，而不是由第一親本系貢獻。圖E顯示了另一種方法，其中圖B和圖C中示出的步驟也對圖A的第二親本系(平行)進行。這樣得到了親本系和(在此情況下)同一供體植物兩者的染色體取代系。在圖E中，來自不同取代文庫的兩個純合染色體取代系互相雜交，以產(chǎn)生圖A的雜交植物的校正版本。對于它的染色體之一，兩個拷貝均由供體植物貢獻，而不是由第一和第二親本系貢獻?？梢杂性S多替代方法，例如其中采用超過一個供體植物，和/或其中圖A的兩個親本系在不同染色體中被“校正”(圖F)等。如果圖D的染色體取代系與圖A的第一親本系雜交(而不是與第二親本系)，可以實現(xiàn)圖2B的情況:第一親本系的“校正”版本，其中一條染色體的拷貝之一已被由供體植物貢獻的染色體拷貝替換。然后，圖2B的步驟還可以應(yīng)用于這種情況:當在這個階段減數(shù)分裂重組被允許以不受抑制的方式進行時，這會導致漸滲文庫的建立。然后，該文庫的個體DHs可以具有供體植物的對應(yīng)染色體的一個或多個片段。為了簡單起見，該圖只顯示了四條染色體，以說明其普遍原理。
[0129]圖4:在更高水平的復(fù)雜度上的品系設(shè)計。圖A顯示了(左側(cè))來自第一親本系的純合染色體取代系，其攜帶來自第一供體植物的一條染色體，以及(右側(cè))來自第二親本系的純合染色體取代系，其攜帶來自第二供體植物的一條染色體。當這兩個DHs互相雜交時，得到了對應(yīng)于原始Fl雜交植物的校正版本的F1，所述原始Fl雜交植物可由將第一親本系與第二親本系雜交得到。被校正的雜交植物對于它的染色體之一攜帶由第一供體植物貢獻的染色體拷貝，對于它的另外染色體攜帶由第二供體植物貢獻的染色體拷貝。圖B中第一和第二親本系均獲得(通過應(yīng)用本發(fā)明的方法)來自第二供體植物的染色體，并且這兩個被修飾的親本系雜交的結(jié)果是對于已經(jīng)由第二供體植物貢獻的染色體而言為純合的雜交植物。圖C示出了這個方法是如何用于甚至更高水平的復(fù)雜度的，其中雜交植物的每條染色體已由不同植物貢獻。圖C的雜交植物本質(zhì)上具有來自不少于六個親本的基因組貢獻(兩個親本系和四個不同的供體植物)，這在采用任何之前已知的方法是不可能以快速并且有效的方式進行的。也可以將該圖中所描繪的場景與圖2的教導結(jié)合起來，以建立帶有來自一個或多個供體植物的貢獻的漸滲文庫。為了簡單起見，該圖只顯示了四條染色體，以說明其普遍原理。
實施例
[0130]實施例1
[0131]擬南芥雜交植物中的染色體替換
[0132]通過將Col-O種質(zhì)的第一植物(純合的)與Ler種質(zhì)的第二植物(純合的)雜交建立雜交擬南芥植物。對于五條染色體的每一條，使用兩個區(qū)分性SNP標記物確定該Col-OxLer雜交植物的基因型，以確認其基因組組成。對于五條染色體的每一條，可以檢測到兩個親本種質(zhì)的貢獻。
[0133]為了重建該雜交植物并且在其中將該雜交背景中的一個特定染色體的兩個拷貝替換為來自第三種質(zhì)(Cvi)(純合的)的拷貝，如下應(yīng)用所要求保護的發(fā)明。在該應(yīng)用的術(shù)語中，Col-O和Ler植物是親本系，Cvi植物是供體親本，參見例如圖3A。
[0134]在第一步中，采用農(nóng)桿菌介導(Agrobacterium-mediated)的轉(zhuǎn)化(Clough&Bent, 1998 ；Plant J 16:735-743)，將靶向擬南芥的 DMCl 基因(Wijnker etal, 2012 ；Nature Genetics 44:467-470)的 RNAi 構(gòu)建體導入 Col-O 和 Ler 植物的基因組。從每個種質(zhì)選擇以雜合單拷貝狀態(tài)(半合子)攜帶該轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的TO植物。分子生物學分析和DNA測序顯示出該轉(zhuǎn)基因被插入在所選擇的Col-O植物中的染色體II內(nèi)，以及所選擇的Ler植物中的染色體IV內(nèi)。該轉(zhuǎn)基因以顯性方式在孢子體水平起作用，使得減數(shù)分裂重組在孢子形成過程中在攜帶該轉(zhuǎn)基因的至少一個拷貝的植物中受到抑制。
[0135]隨后，分別對Col-O和Ler種質(zhì)建立兩個染色體取代文庫:在Col-O和Ler植物的基因組中，一條或多條染色體用來自Cvi供體種質(zhì)的基因組的相應(yīng)染色體或多條染色體替換。這是通過首先(平行)將轉(zhuǎn)基因的Col-OTO植物與Cvi植物雜交以及將轉(zhuǎn)基因的LerTO植物與Cvi植物雜交，并在不存在減數(shù)分裂重組的情況下使所得到的雜交植物形成孢子而實現(xiàn)的。為了這個目的，選擇在它們的基因組中攜帶針對DMCl的RNAi構(gòu)建體的后代植物，即已經(jīng)繼承了攜帶該轉(zhuǎn)基因的Col-O或Ler染色體拷貝的植物。因為原始的轉(zhuǎn)基因性Col-O和Ler植物對于該轉(zhuǎn)基因是半合子，獲得的Col-Ox Cvi和Ler x Cvi后代也缺乏該轉(zhuǎn)基因，但是在該實施例中只選擇具有該轉(zhuǎn)基因的后代植物，以抑制在孢子形成過程中的減數(shù)分裂重組。
[0136]轉(zhuǎn)基因的存在抑制了減數(shù)分裂重組，使得所選擇的Col-Ox Cvi和Ler x Cvi雜交植物產(chǎn)生，其中親本染色體并未重組的小孢子。相反，兩個親本系的染色體已經(jīng)全部以隨機組合的方式被傳遞給小孢子。
[0137]通過著絲粒介導的基因組消除(Ravi and Chan, 2010 ；Nature 464，615-619 ;美國專利申請?zhí)?0110083202 ;W02011044132)、隨后基因組加倍的方式產(chǎn)生來自每個選擇的雜交植物的單倍體?；蛘?，也可以采用從孢子再生單倍體植物的其它方法，例如孤雌生殖、或小孢子或花藥培養(yǎng)操作。
[0138]因此，通過在雜交植物的小孢子形成過程中抑制重組，建立了兩個DH植物群體。這些群體的個別DH植物的基因組在一種情況下由完整的、未重組的Col-O和Cvi染色體的組合組成，在另一種情況下由完整的、未重組的Ler和Cvi染色體的組合組成。只選擇帶有正確單倍體染色體數(shù)量(對于擬南芥η = 5)的孢子，而非整倍體孢子被排除在該實驗的進一步步驟之外。可以例如通過流式細胞術(shù)的方式，或通過肉眼選擇具有與該種屬的正常孢子大小相應(yīng)大小的孢子而從形態(tài)學上鑒定均衡的孢子，其意味著在孢子形成過程中所有染色體的平等分配。
[0139]通過能夠在構(gòu)成每個DH的不同種質(zhì)之間進行區(qū)分的分子標記的方式，檢查每個DH的基因組組成，以在每個個體DH植物中鑒定五條染色體中每一條的起源。以該方式選擇兩個DH植物:
[0140]一攜帶Cvi的染色體I結(jié)合剩下的來自Col-O的4條染色體的第一植物；
[0141]一攜帶Cvi的染色體I結(jié)合剩下的來自Ler的4條染色體的第二植物。
[0142]隨后，將所選擇的這兩個植物互相雜交，得到雜交后代植物，其對于染色體I1、II1、IV和V是雜合的(即對于這四條，染色體中的每一條攜帶來自Col-O的一個拷貝和來自Ler的一個拷貝)，但對于染色體I是純合的。后一染色體起源于Cvi種質(zhì),如可以通過分子標記的方式確認的。這些雜交后代植物還攜帶兩個拷貝的RNAi轉(zhuǎn)基因(一個在Col-O的染色體II上，另一個在來自Ler的染色體IV上；這兩個轉(zhuǎn)基因在雜交植物中以雜合子的狀態(tài)存在)。本實施例的結(jié)果對應(yīng)于圖3的小圖E。
[0143]實施例2
[0144]擬南芥雜交植物中的染色體替換，得到非轉(zhuǎn)基因終產(chǎn)物
[0145]在實施例1中，所得到的雜交后代在本質(zhì)上是轉(zhuǎn)基因的(導致被監(jiān)管的GMO狀態(tài)以及由靶向DMCl的RNAi構(gòu)建體存在帶來的額外的表型困難，其例如由于非整倍體的出現(xiàn)導致部分不育，這種非整倍體由在孢子形成過程中減數(shù)分裂重組的抑制造成的)。
[0146]在本實施例中，通過在選擇以下兩個DH植物之后，在該操作中包括額外的實驗步驟，該問題得到克服:
[0147]一攜帶Cvi的染色體I結(jié)合剩下的來自Col-O的4條染色體的第一植物；
[0148]一攜帶Cvi的染色體I結(jié)合剩下的來自Ler的4條染色體的第二植物。
[0149]將所述第一植物與野生型的非轉(zhuǎn)基因Col-O植物(回)交一次，所述第二植物與野生型的非轉(zhuǎn)基因Ler植物(回)交一次。由于DMClRNAi構(gòu)建體的顯性性質(zhì)，在由這些回交所得到的雜交植物產(chǎn)生的孢子中發(fā)生減數(shù)分裂重組的抑制。由Fl植物產(chǎn)生的整倍體(均衡)小孢子產(chǎn)生DHs，并且用分子標記篩選DHs，以鑒定它們的五個純合子染色體對中每一個的起源，如實施例1中所述。
[0150]在這個階段，不僅排除非整倍體個體，而且排除攜帶靶向DMCl的RNAi構(gòu)建體的個體。在由Col-Ox Cvi雜交植物得到的DH植物中，只選擇那些攜帶Col-O染色體II的野生型拷貝(沒有轉(zhuǎn)基因)、并且存在來自Cvi的染色體I的個體，在由Ler x Cvi雜交植物得到的DH植物中應(yīng)用類似的選擇策略。這種選擇確保所選擇的DH植物是非轉(zhuǎn)基因的，并且在這些所選擇的植物中減數(shù)分裂期間減數(shù)分裂重組不被打斷地進行。
[0151]該選擇的結(jié)果是攜帶Cvi的染色體I結(jié)合剩下的來自Col-O的4條染色體的非轉(zhuǎn)基因DH植物，和攜帶Cvi的染色體I結(jié)合剩下的來自Ler的4條染色體的非轉(zhuǎn)基因DH植物。
[0152]隨后，將所選擇的這兩個植物互相雜交，得到雜交后代植物，其對于染色體I1、
II1、IV和V是雜合的(即對于這四條染色體中的每一條攜帶來自Col-O的一個拷貝和來自Ler的一個拷貝)，但對于染色體I是純合的。后一條染色體起源于Cvi種質(zhì)，如可以通過分子標記的方式確認的。
[0153]因此，這個步驟允許快速并有效替換雜交植物背景中的染色體I，而不影響其它染色體的完整性，并且并不使得所得到的雜交植物是轉(zhuǎn)基因的。它不要求多輪回交，每條染色體是完整傳遞的，不發(fā)生重組。該方法例如在以下情況中是有用的，其中在原本合適的雜交植物的一條染色體上存在一個或多個不想要的性狀，并且已經(jīng)在另一植物、種質(zhì)或野生近緣中鑒定到優(yōu)異的染色體。然后，這個優(yōu)異的染色體可以用于替換所述雜交植物背景中該染色體的兩個拷貝，而不改變其遺傳組成的其余部分。
[0154]實施例3
[0155]擬南芥雜交植物中一個染色體拷貝的替換
[0156]在同一實驗中，建立在其基因組內(nèi)僅含有來自Cvi的一個拷貝的染色體I的Col-Ox Ler雜交植物。這是通過選擇起源于Col-O的染色體取代文庫的DH植物實現(xiàn)的(如實施例1中所述)，其基因組包括來自Cvi的染色體I和來自Col-O的所有其它染色體，并且其(與實施例1和2中所選擇的植物相反)在染色體II上缺乏DMCl轉(zhuǎn)基因。
[0157]隨后，將該植物與野生型Ler植物雜交，以產(chǎn)生雜交后代。這些后代植物對于染色體I1、II1、IV和V是完全雜交的(即除了這些染色體的每一條的一個Ler拷貝外，它們的基因組還包括這些染色體的每一條的一個Col-O拷貝)，但是其含有染色體I的一個Ler拷貝和染色體I的一個Cvi拷貝，但沒有該染色體的Col-O拷貝。因此，以這種方式，該Col-OxLer雜交植物已經(jīng)被“校正”了，使得染色體I的Col-O拷貝已經(jīng)特異性地被該染色體的Cvi版本替換了，而不影響該雜交植物的基因組的其余部分。本實施例對應(yīng)于圖3的小圖D。
[0158]可以想象許多情況，其中這將是有吸引力的策略，例如當雜交背景中的一個拷貝的特定染色體包括顯性突變時，所述突變在原本完美的雜交植物中造成不想要的表型。它還可以通過將攜帶轉(zhuǎn)基因的染色體替換為另一(非轉(zhuǎn)基因)拷貝而用于從雜交植物中去除轉(zhuǎn)基因。
[0159]實施例4
[0160]染色體片段向擬南芥雜交植物中的漸滲
[0161]在同一實驗中，進行第四種方法:建立在Col-O背景中針對來自Cvi的染色體I和在Ler背景針對來自Cvi的染色體II的漸滲文庫。第一步是建立針對Col-Ox Cvi和針對Ler X Cvi的染色體取代文庫,如實施例1中所述。
[0162]從Col-Ox Cvi染色體取代文庫中選擇非轉(zhuǎn)基因的DH植物(缺乏RNAi轉(zhuǎn)基因)，其基因組由來自Cvi的染色體I和來自Col-O的其它四條染色體組成(該DH植物早已在實施例3中被選擇到)。從Ler x Cvi染色體取代文庫中選擇非轉(zhuǎn)基因的DH植物(缺乏RNAi轉(zhuǎn)基因)，其基因組由來自Cvi的染色體II和來自Ler的其它四條染色體組成。
[0163]隨后，將所選擇的植物與它們的親本種質(zhì)之一回交(即前者是與野生型Col-Ο，后者是與野生型Ler)，與圖2的示意圖類似。由這些回交得到的非轉(zhuǎn)基因Fl植物是:
[0164]— Col-Ox Cvi的情況下:對于染色體I是雜合的(來自Col-O的一個拷貝和來自Cvi的一個拷貝)，對于染色體I1、II1、IV和V是純合的(Col-0)。
[0165]— Ler x Cvi的情況下:對于染色體II是雜合的(來自Ler的一個拷貝和來自Cvi的一個拷貝)，對于染色體I1、II1、IV和V是純合的(Ler)。
[0166]使這些Fl植物形成孢子，而不干擾減數(shù)分裂重組，因為靶向DMCl的RNAi構(gòu)建體沒有存在于它們的基因組中。在孢子形成過程中，在整個基因組發(fā)生交換事件，但由于五條染色體中的四條是以純合子狀態(tài)存在的，僅在以雜合子狀態(tài)存在的該一條染色體上有可檢測到的重組作用:在Col-Ox Cvi的情況下是染色體I,在Ler x Cvi的情況下是染色體II。
[0167]對于所述一條雜合子染色體，在孢子的每一個中隨機發(fā)生重組，使得由Fl植物產(chǎn)生的孢子群體中的個體孢子們互相之間僅在該一條染色體的組成中存在區(qū)別。在某些情況下沒有發(fā)生重組，而在其它情況下在該染色體中發(fā)生一個或多個交換事件。
[0168]隨后，這些孢子用于DH生產(chǎn)，如實施例1中所述。如同通常對于所有DHs的情況一樣，所得到的DHs是完全純合的，并且它們的基因組是固定的。對于它們五條染色體中的四條，這些DHs是彼此相同的，但不同在于Cvi片段漸滲至剩下一條染色體的程度。由該實驗得到的DHs群體代表了一條染色體的漸滲文庫。
[0169]該群體越大，可用于育種中的研究和應(yīng)用的漸滲區(qū)段的變異越大。采用能夠區(qū)分這三個親本擬南芥種質(zhì)的分子標記來詳細檢查來自該漸滲文庫的個體DHs。該分析確認了可以鑒定到在來自Col-O和Cvi的染色體I之間已經(jīng)發(fā)生了重組(而染色體I1、II1、IV和V完全衍生自Col-Ο)的個體植物，并且可以鑒定到在來自Ler和Cvi的染色體I之間已經(jīng)發(fā)生了重組(而染色體1、II1、IV和V完全衍生自Ler)的個體植物。
[0170]因此，該分析證實了染色體I (在前者的情況下)和染色體II (在后者的情況下)攜帶衍生自來自Cvi的相應(yīng)染色體的一個或多個片段，而在該操作過程中其它染色體仍然保持不變。
[0171]隨后，將以這種方式獲得的選中的DHs相互雜交，得到了帶有“校正過”的染色體I和II的Col-Ox Ler雜交植物的建立。除了染色體I和II上特異性染色體片段的替換外，它們與原始Col-Ox Ler雜交植物是相同的。這些區(qū)域分別起源自Col-O和Cvi以及起源自Ler和Cvi,而雜交植物基因組的其余部分由來自Col-O和Ler的同等貢獻組成。
[0172]在實踐中，該方法可以用于例如替換原本合適的雜交植物的親本系中的“次優(yōu)的”染色體片段，或引入能夠進一步改善雜交植物的染色體片段(含有特定等位基因變異或轉(zhuǎn)基因的片段)。
[0173]該方法的一大優(yōu)點是其實施的速度，例如當與傳統(tǒng)育種相比時。重要的是，當試圖采用本領(lǐng)域已知的傳統(tǒng)育種方法建立漸滲系時，這將首先導致對所有五條染色體的漸滲事件。這樣將需要與原始親本系回交至少六代以從基因組中“純化掉”盡可能多的不期望的漸滲片段，而每次選擇期望的漸滲片段的存在。
[0174]因此，在本實施例中，可以從將Col-O植物與Cvi植物雜交開始，并允許該雜交的Fl后代在存在重組的情況下產(chǎn)生孢子，并自體受精(self-fertilise)。隨后，在該雜交的F2代中，可以篩選在它們的基因組中攜帶期望的、衍生自Cvi基因組的漸滲片段的個體，并將這些個體與Col-O回交。該常規(guī)操作可以至少再重復(fù)五次，或直到基因組范圍內(nèi)的標記分析顯示所選擇的植物的基因組主要衍生自Col-Ο，而僅所期望的來自Cvi的漸滲片段存在于它們的基因組中。同樣的常規(guī)操作可能需要平行地對Ler X Cvi組合完成。最終可以例如獲得在一條染色體上帶有衍生自Cvi的一個或多個特定漸滲片段的Col-O植物，以及帶有衍生自Cvi的一個或多個特定漸滲片段(在這種情況下在另一條染色體上)的Ler植物。最后，可以將所選擇的這兩個植物互相雜交，以獲得在其基因組中帶有來自Cvi的特定貢獻的Col X Ler Fl雜交植物。
[0175]當將這種傳統(tǒng)方法所需的時間與采用本發(fā)明的方法獲得該結(jié)果所需的時間相比較時，很明顯，后者更為高效和快捷。上述(實施例4)概括的實驗要求以下步驟:
[0176]一平行生產(chǎn)兩個染色體取代文庫，其通過用合適的用于抑制減數(shù)分裂重組的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，雜交(一代)，以及DH步驟來進行；
[0177]一從所述取代文庫中選擇合適的個體，
[0178]一一個回交世代，接著進行DH步驟，以及
[0179]一選擇，以及將所選擇的系雜交。
[0180]因此，該處理比在傳統(tǒng)育種方法中所需要的初始雜交再接著六個或更多的回交世代、合適系的選擇以及另一個雜交以獲得雜交植物(從種子到種子總共至少八個世代)要快得多。
[0181]取決于在給定種屬中轉(zhuǎn)化和DH生產(chǎn)可供利用的操作步驟的速度和效率，本發(fā)明的方法可以非常迅速，因為不必總是在雜交之后等待種子產(chǎn)生，而是僅僅等待要用于DH生產(chǎn)的孢子產(chǎn)生即可。尤其是當有非常有效的DH操作步驟可供利用時(例如單倍體誘導子系統(tǒng))，本發(fā)明的方法可以非常迅速。
[0182]除了速度外，本發(fā)明的方法的另一個明顯的優(yōu)點是供體植物的基因組貢獻可以被固定并在染色體取代和/或漸滲文庫中以純合的形式長期存在這一事實，這使得它們在親本系的基因組背景中以穩(wěn)定的方式保持可用，其中它們可以被用于育種中的未來篩選和開發(fā)。它還是現(xiàn)有技術(shù)的顯著改善，漸滲文庫可以基于每個個體染色體進行制備，而這是采用傳統(tǒng)育種方法不可能完成的。
[0183]實施例5
[0184]在玉米中轉(zhuǎn)基因的特定傳遞，同時保持該轉(zhuǎn)基因的確切插入位置
[0185]在本實施例中，轉(zhuǎn)基因被引入優(yōu)良玉米系，而不直接將其轉(zhuǎn)化入該系。首先，該轉(zhuǎn)基因被引入可容易轉(zhuǎn)化的玉米系，并且可以選擇許多獨立轉(zhuǎn)基因事件中最好的事件用于傳遞入優(yōu)良玉米系。在此保持該轉(zhuǎn)基因的確切的基因組插入位置。
[0186]通過農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化、米用Ishida et al (Nature Protocols 2,1614-1621;2007)所述的操作步驟獲得A188基因型的經(jīng)遺傳修飾的玉米植物。該實驗中所使用的轉(zhuǎn)基因是帶有核定位信號的、可操作連接至強泛素啟動子的GFP標記(綠色熒光蛋白)。該構(gòu)建體能夠在整個轉(zhuǎn)化的玉米植物中高水平表達GFP，其由于熒光GFP蛋白在細胞核內(nèi)的積累而易于檢測到。
[0187]從在該實驗中所獲得的轉(zhuǎn)化的A188玉米植物中選擇一個個體，其在其基因組中染色體VIII上含有該轉(zhuǎn)基因的單一拷貝。在第一步中，將該選中的轉(zhuǎn)基因系與優(yōu)良系B73雜交，其在其基因組中含有靶向DMCl基因的RNAi構(gòu)建體(也在染色體VIII上，單拷貝插入，半合子)。后者的轉(zhuǎn)基因以顯性形式起作用，使得在孢子形成過程中的減數(shù)分裂重組在所得到的雜交后代中被抑制。
[0188]從該雜交的Fl后代植物收集小孢子，并且采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法將它們用于DH生產(chǎn)。
[0189]從所得到的相應(yīng)于染色體取代系的DH植物中選擇這樣一個個體，其具有來自B73的所有染色體，但染色體VIII除外，后者衍生自A188。將該植物與缺乏靶向DMCl的RNAi構(gòu)建體的野生型B73植物回交，以產(chǎn)生對于染色體VIII為雜合(一個拷貝衍生自B73，另一個拷貝衍生自A188，攜帶GFP轉(zhuǎn)基因)、但其它九條染色體則完全對應(yīng)于野生型B73的后代植物(玉米的η = 10)。
[0190]在不存在靶向DMCl的RNAi構(gòu)建體的情況下，允許在這些后代植物中的孢子形成過程中發(fā)生減數(shù)分裂重組。它們的孢子被用于產(chǎn)生DH植物(如上所述)，并且在這些DHs中，除了染色體VI11外所有染色體完全衍生自Β73背景，而染色體VI11本質(zhì)上衍生自Β73，具有來自Α188系的隨機漸滲片段。
[0191]可以從這個DH群體中選擇純合的個體，其只在染色體VIII上含有相對小片段的A188DNA，并且仍然具有GFP轉(zhuǎn)基因(其在分子標記的幫助下可以很容易地被檢測)。以這種方式，該轉(zhuǎn)基因被有效地從Α188玉米植物傳遞給Β73優(yōu)良系，而不必用該構(gòu)建體直接轉(zhuǎn)化Β73，并且不必將Β73的基因組與Α188的基因組混合。這將不可避免地需要與Β73的多輪回交以獲得再次非常類似Β73的后代植物。
[0192]該方法允許在可容易地轉(zhuǎn)化的Α188背景中大規(guī)模生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因系，以及選擇最好的轉(zhuǎn)基因插入事件，其隨后在與Α188中確切相同的基因組位置被傳遞入Β73，而所述Β73是非常不容易轉(zhuǎn)化的。
[0193]很明顯的是，該方法還可以用于其它轉(zhuǎn)基因，例如賦予對除草劑或食草動物抗性、賦予疾病抗性或?qū)Σ涣紬l件的更高耐受性、提供更高產(chǎn)率等的轉(zhuǎn)基因。
[0194]相似地，采用該方法，還可以從轉(zhuǎn)基因植物的基因組去除轉(zhuǎn)基因，而不影響其基因組其余部分的組成。含有轉(zhuǎn)基因的染色體區(qū)域或整個染色體因而被來自另一個系的相應(yīng)野生型片段替換。非常特異性地，一條染色體可以獨立于基因組的其余部分而被“校正”，并且該校正通常需要完整染色體或染色體片段的替換。
[0195]實施例6
[0196]玉米中雜種優(yōu)勢的高效育種
[0197]雜種優(yōu)勢效應(yīng)可以顯著提高雜交植物的產(chǎn)率。它們通過由親本系雜交得到的Fl雜交植物而具有兩個親本系的表型優(yōu)異表現(xiàn)。盡管雜種優(yōu)勢的分子或遺傳本質(zhì)仍然未知，實證研究已經(jīng)在作物中提供了寶貴信息。例如在玉米中，基于譜系信息或分子標記分析，例如 SSR(Simple Sequence Repeat,簡單序列重復(fù))或 SNP(Single NucleotidePolymorphism,單核苷酸多態(tài)性)標記，已經(jīng)鑒定了各種雜交優(yōu)勢組。這樣的雜種優(yōu)勢群組的例子是 Flint、Lancaster> Stiff Stalk 以及 1dent (Van Inghelandt et al, 2010 ；Theor.Appl.Genet.120:1289-1299) > 或 Dent (Zea mays indentata)、Flint (Zea maysindurata)和 Sweet (Zea mays rugosa or Zea mays saccharata)。每個雜種優(yōu)勢組包括互相之間具有一定程度的遺傳相似性的若干近交系。為了在下一代中得到雜種優(yōu)勢效應(yīng)，通常需要將來自不同雜交優(yōu)勢組的近交系互相雜交。
[0198]通常而言，表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢的新的玉米雜交植物的建立包括兩個不同雜種優(yōu)勢組的親本系的改進，以及那些親本系的隨后雜交以獲得Fl雜交種子。親本系的改進涵蓋傳統(tǒng)植物育種和/或轉(zhuǎn)基因或同源基因化(cisgenesis)，并且在每個雜交植物中，來自僅兩個雜種優(yōu)勢組的基因組貢獻可以匯聚在一起。
[0199]但是，當應(yīng)用本發(fā)明的方法時，可以將兩個以上的雜種優(yōu)勢群組匯聚在單個雜交植物中。所需要的是給群組的雜種優(yōu)勢本質(zhì)作出貢獻的染色體區(qū)域上的信息，以使得來自一個雜種優(yōu)勢群組的近交系的這些區(qū)域可以被特異性地傳遞入來自另一個雜種優(yōu)勢群組的近交系的基因組。這與實施例5中所述的方法相似，其中采用的是染色體取代和/或漸滲文庫。
[0200]以這種方式，來自第一雜種優(yōu)勢群組的近交系專門被改進以便也含有來自第二雜種優(yōu)勢群組的雜種優(yōu)勢基因組區(qū)域。在下一步中，該改進的近交系可以與來自第三個雜種優(yōu)勢群組的近交系雜交，其可能本身也已經(jīng)采用本發(fā)明的方法被改進了，以含有來自超過一個雜種優(yōu)勢群組的基因組材料。因而雜種優(yōu)勢的遺傳基礎(chǔ)以順勢和/或反式的形式被匯聚在同一染色體組中。該方法的結(jié)果是一次建立攜帶不是兩個、而是三個或甚至更多個雜交優(yōu)勢群組的遺傳材料的雜交玉米植物。這給在玉米中提高例如雜交植物產(chǎn)率提供了強大的、新的可能性。
[0201]實施例7
[0202]將病毒抗性特異性傳遞入雜交甜瓜
[0203]瓜類黃矮失調(diào)病毒(CucurbitYellow Stunting Disorder Virus,CYSDV)是一種由粉風(whitefly, Bemisia tabaci)傳播的紡錘病毒(closterovirus),其影響瓜類作物如甜瓜(Cucumis melo)。已經(jīng)在來自津巴布韋的甜瓜種質(zhì)TGR-1551中鑒定到賦予對該病毒的抗性的遺傳性狀(Lopez-Sese and Gomez-Guillamon, 2000 ；Hort.Sc1.35:110-113)。該實施例解釋了——通過本發(fā)明的方式——這種顯性單基因抗性性狀是如何被有效傳遞給優(yōu)良甜瓜雜交品種，而無需許多次回交世代。
[0204]在第一步中，采用由Guis等,2000 (Sc1.Hort.8:91-99)開發(fā)的用于哈密瓜(Cantaloupe melons)的改良轉(zhuǎn)化操作步驟，將靶向甜瓜的DMCl基因的RNAi構(gòu)建體導入優(yōu)良雜交甜瓜的父本系的基因組。選擇以雜合單拷貝狀態(tài)(半合子)攜帶該轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的TO甜瓜植物。優(yōu)良雜交甜瓜的父本系和母本系的互補對可以例如由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過應(yīng)用反向育種(Reverse Breeding),采用優(yōu)良甜瓜雜交植物作物雜合起始有機體而獲得,如W003/017753中所述和要求保護的。
[0205]將轉(zhuǎn)基因父本系與在其基因組中攜帶賦予對CYSDV抗性的遺傳性狀的甜瓜種質(zhì)TGR-1551 一起生長。隨后，將轉(zhuǎn)基因甜瓜植物與種質(zhì)TGR-1551雜交，并且使所得到的雜交后代植物——選擇為在它們的基因組中攜帶針對DMCl的RNAi構(gòu)建體——在不存在減數(shù)分裂重組的情況下形成孢子。由這些Fl植物形成的孢子包括兩個親本系的完整染色體的隨機組合，因為在它們的形成過程中沒有發(fā)生減數(shù)分裂重組。
[0206]通過孤雌生殖的方式，如例如Malik等，2011年所述(Hort.Sc1.38:27-34)，以及隨后的染色體加倍(Lim&Earle, 2009 ;Plant Cell, Tissue&Organ Culture 98:351-356),由Fl植物產(chǎn)生的大孢子再生成為雙單倍體(DH)小植株。
[0207]以這種方式獲得的DH群體的個體DH植物的基因組由完整的、未重組的來自兩個親本系的染色體的組合組成。只選擇帶有正確單倍體染色體數(shù)量(η = 12)的小植株，并且在該實驗的進一步步驟中排除非整倍體個體。在這個階段還將攜帶具有RNAi構(gòu)建體的染色體拷貝的DHs排除掉。
[0208]通過能夠在兩個親本系的每一條染色體(每個DH的基因組由其組成)之間進行區(qū)分的分子標記的方式，檢查每個DH的基因組組成，以鑒定每個個體DH植物中12條染色體中的每一條的來源。選擇在它們的基因組中攜帶來自TGR-1551、其上具有CYSDV抗性性狀的染色體的DH植物，其可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的抗性分析的方式憑經(jīng)驗檢測，并且其余十一條染色體表現(xiàn)出與優(yōu)良雜交甜瓜的父本系相同的分子標記模式，并缺乏靶向DMCl的RNAi構(gòu)建體。這樣的植物是完全純合的染色體取代系，其中攜帶CYSDV抗性性狀的來自TGR-1551的一條染色體與來自優(yōu)良雜交甜瓜的父本系的11條染色體組合，形成完整的基因組互補體(genomic complement)。
[0209]原則上，這些選中的系(其顯示對CYSDV的抗性，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的抗性測試進行實驗性確認)已經(jīng)可以通過將其與合適的母本系雜交而用于構(gòu)建CYSDV抗性雜交植物。但是，因為“被校正”的父本系的一條染色體完全衍生自TGR-1551，這只會導致優(yōu)良甜瓜雜交品種的不完全重建。為了克服該問題并且為了能夠完成幾乎完美的雜交重建，在該實驗的下一步中產(chǎn)生漸滲文庫，以限制TGR-1551系的基因組對于包含該抗性性狀的染色體片段的貢獻。
[0210]為此目的，隨后將所選擇的DH植物與優(yōu)良雜交甜瓜的父本系回交。因為所述父本系是幾乎完全純合的(為純系)，從該雜交得到的Fl后代中12條染色體有11條事實上以純合的狀態(tài)存在，因為所述DH植物是完全純合的，并具有來自所述父本系的12條染色體中的11條。對于剩下的一條染色體，在該雜交的Fl后代中存在衍生自TGR-1551系、攜帶CYSDV抗性性狀的一個拷貝，以及衍生自所述父本系的一個拷貝。
[0211]在這些Fl植物的孢子形成過程中的減數(shù)分裂重組特異性地導致該條染色體的兩個拷貝之間的隨機交換事件。所述Fl植物被允許形成孢子，并通過孤雌生殖的方式，從由這些后代植物產(chǎn)生的大孢子建立另一個DH群體。在優(yōu)良雜交甜瓜的父本系的遺傳背景中，針對攜帶來自TGR-1551系的CYSDV抗性性狀的染色體，這些DH植物有效地構(gòu)成了非轉(zhuǎn)基因的漸滲文庫。剩下的11條染色體大致保持不變，這樣在該漸滲文庫中的個體DHs之間的唯一主要區(qū)別在于衍生自TGR-1551的染色體拷貝的漸滲片段進入到衍生自優(yōu)良雜交甜瓜的父本系的染色體拷貝中的數(shù)目、大小和位置。
[0212]通過病毒抗性測試和分子標記的方式，鑒定在其基因組中攜帶來自TGR-1551、包括CYSDV抗性性狀的相對小的漸滲片段的DH植物。隨后，該DH植物被確認為CYSDV抗性。
[0213]所選擇的DH系實質(zhì)上相應(yīng)于優(yōu)良雜交甜瓜的父本系的被校正的版本，因為其一條染色體的片段被來自另一甜瓜種質(zhì)的相應(yīng)片段所特異性替換，并且在該處理中，顯性抗性性狀被導入其基因組。
[0214]隨后將該“被校正”的系與優(yōu)良雜交甜瓜的母本系雜交，該雜交的(非轉(zhuǎn)基因)Fl后代除了 CYSDV抗性之外，還具有優(yōu)良甜瓜雜交品種的所有的特色特征。
[0215]實施例8
[0216]重組頻率增加的擬南芥中性狀的有效金字塔化
[0217]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了負責“交換干擾”現(xiàn)象(構(gòu)成例如連鎖累贅的基礎(chǔ))的遺傳決定因子。一個這樣的因子是FANCM基因，其已被顯示在擬南芥的減數(shù)分裂交換形成的控制中發(fā)揮關(guān)鍵作用(Knoll et al, 2012 ；Plant Cell 24:1448-1464 ;Crismani et al, 2012 ；Science336:1588-1590)。
[0218]抑制植物中FANCM的表達和/或活性消除了個體交換事件之間的干擾，使得在單個減數(shù)分裂中每個染色體或染色體區(qū)域有更多的重組事件能夠發(fā)生。因此，可以通過抑制FANCM的表達或通過干擾FANCM的活性大大增加植物物種的遺傳圖大小，并且因而可以方便地去除連鎖累贅。
【權(quán)利要求】
1.一種用于遺傳修飾雜交植物的基因組的方法，其通過將它的染色體或染色體片段的一個或多個替換為一個或多個供體親本的相應(yīng)染色體或染色體片段來實施，所述方法包括: a)將所述雜交植物的親本之一與供體親本之一雜交，以獲得第一Fl群體，允許所述Fl在抑制重組的同時產(chǎn)生孢子，產(chǎn)生所述孢子的雙單倍體，以獲得染色體取代系的第一群體， b)任選地，將所述雜交植物的另一親本與同一個或另一個供體親本雜交，以獲得第二Fl群體，允許所述Fl在抑制重組的同時產(chǎn)生孢子，產(chǎn)生所述孢子的雙單倍體，以獲得染色體取代系的第二群體，以及 或者: Cl)通過選擇所述第一或所述第二群體的一個個體并將該個體與另一群體的個體或與所述雜交植物的親本雜交，產(chǎn)生已經(jīng)獲得供體親本(們)的一個或多個完整染色體的被修飾的雜交植物； 或者 c2)通過如下操作產(chǎn)生被修飾的雜交植物的群體: . 1.選擇所述第一或所述第二群體的一個個體并將該個體與所述雜交植物的相應(yīng)親本雜交，以及 ?.允許由該雜交得到的后代植物(們)產(chǎn)生孢子，同時允許重組發(fā)生，以獲得已經(jīng)獲得供體親本的一個或多個染色體片段的孢子群，并制造其雙單倍體，以及 ii1.將由此獲得的雙單倍體植物與任選地被修飾的雜交植物的另一親本雜交，或與另一個純合系雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中允許重組發(fā)生是通過從基因組去除能夠抑制重組的轉(zhuǎn)基因來實現(xiàn)的，或通過不施用能夠抑制重組的一種或多種化學品實現(xiàn)的。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中使重組以高于平均值的頻率發(fā)生。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中重組的高于平均值的頻率是通過干擾涉及重組抑制的一個或多個靶基因如FANCM實現(xiàn)的。
5.取代系的文庫，其由權(quán)利要求1所述的方法可獲得。
6.如權(quán)利要求5所述的文庫，其中在每個取代系中，一條染色體是源自供體植物，并且其它染色體是源自雜交植物的親本系。
7.由權(quán)利要求1所述的方法可獲得的漸滲系的文庫。
8.如權(quán)利要求7所述的文庫，包括一組或多組漸滲系，其中在每組漸滲系中，一條染色體包括源自供體植物的一個或多個漸滲片段，并且其它染色體是源自雜交植物的親本系。
9.如權(quán)利要求7或8所述的文庫，其中對于每條染色體包括一組漸滲系。
10.權(quán)利要求5-9中任一項的文庫用于加速的植物育種或雜交植物校正的用途。
11.如權(quán)利要求10所述的用途，其中加速的植物育種包括從所述文庫選擇一個或多個系，所述系包含所述期望的供體染色體或攜帶所述期望的供體來源漸滲片段的染色體，并將所選擇的系與另一個植物雜交。
12.如權(quán)利要求11所述的用途，其中所述另一個植物是雜交植物的親本系。
13.如權(quán)利要求10所述的用途，其中雜交植物校正包括系的選擇，所述系包含所述期望的供體染色體或攜帶所述期望的供體來源漸滲片段的染色體，并將所選擇的系與雜交植物的另一親本雜交。
14.如權(quán)利要求13所述的用途，其中雜交植物的另一親本也選自所述取代或漸滲文庫。
【文檔編號】C12N15/82GK104411158SQ201380034112
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2013年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月29日
【發(fā)明者】R·H·G·德爾克斯 申請人:瑞克斯旺種苗集團公司