有機化合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于真核細(xì)胞培養(yǎng)方法和用于表達(dá)重組目的產(chǎn)物的新選擇系統(tǒng)。該選擇系統(tǒng)基于引入外源性功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體基因以及編碼目的產(chǎn)物的多核苷酸或基因到真核細(xì)胞中，并且該選擇系統(tǒng)可廣泛用于細(xì)胞生存力依賴于葉酸攝取的真核細(xì)胞。
【專利說明】有機化合物
[0001]本申請是申請日為2008年12月19日的、發(fā)明名稱為“有機化合物”的中國專利申請 200880122105.7 (PCT/EP2008/068046)的分案申請。
發(fā)明領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及用于真核細(xì)胞培養(yǎng)方法以及用于表達(dá)目的重組產(chǎn)物的新選擇系統(tǒng)。該選擇系統(tǒng)基于將外源性功能膜結(jié)合葉酸化合物(folate)受體基因以及編碼目的產(chǎn)物的多核苷酸或基因引入到真核細(xì)胞中，其可廣泛用于細(xì)胞生存力依賴于葉酸攝取的真核細(xì)胞。
[0003]發(fā)明背景
[0004]選擇標(biāo)記和選擇系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于基因工程、重組DNA技術(shù)以及重組產(chǎn)物例如抗體、激素和核酸在真核細(xì)胞培養(yǎng)物中的生產(chǎn)。此類顯性選擇標(biāo)記和選擇系統(tǒng)的首要目的是引入選擇基因，所述選擇基因在暴露于選擇性生長條件后提供能高水平產(chǎn)生重組目的產(chǎn)物的細(xì)胞。
[0005]迄今，有3種可用的主要選擇標(biāo)記系統(tǒng):
[0006](a)谷氨酰胺合成酶系統(tǒng):酶谷氨酰胺合成酶(GS)負(fù)責(zé)由谷氨酸和氨生物合成谷氨酰胺。該生物合成反應(yīng)提供了哺乳動物細(xì)胞中谷氨酰胺形成的唯一途徑。因此，在生長培養(yǎng)基中缺少谷氨酰胺時，酶GS對培養(yǎng)中哺乳動物細(xì)胞的存活是必不可少的。重要的是，包括小鼠骨髓瘤細(xì)胞在內(nèi)的某些哺乳動物細(xì)胞系缺乏足夠GS的表達(dá)，因此在沒有外源加入的谷氨酰胺時不能存活。因此，此類細(xì)胞系是適宜的轉(zhuǎn)染GS基因的受體，在該系統(tǒng)中轉(zhuǎn)染的GS基因可用作允許細(xì)胞在缺少谷氨酰胺的培養(yǎng)基中生長的選擇標(biāo)記。相比之下，細(xì)胞系如廣泛使用的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞表達(dá)足夠的GS以支持在不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基中的生長。因此，如果這些C`HO細(xì)胞被用作轉(zhuǎn)染GS基因的受體細(xì)胞，則為了抑制內(nèi)源性GS活性可以應(yīng)用特異且有效的GS抑制劑甲硫氨酸亞砜亞胺(sulfoximine) (MSX)，這樣只有表達(dá)高水平的轉(zhuǎn)染的GS基因的轉(zhuǎn)染子可以在不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基中存活。GS系統(tǒng)的主要缺點是為了建立穩(wěn)定過表達(dá)目的靶基因的細(xì)胞，選擇性生長的時間相對較長(即2-6個月)。另一個缺點是頻繁利用細(xì)胞毒素劑MSX來提升選擇壓力。這種細(xì)胞毒素劑與重組目的產(chǎn)物(例如多肽如抗體)的一起存在可能需要額外純化步驟來清除該細(xì)胞毒素劑。
[0007](b) 二氫葉酸還原酶/MTX選擇系統(tǒng):二氫葉酸還原酶(DHFR)催化二氫葉酸至四氫葉酸(THF)的NADP依賴性還原。然后THF與10-甲?；?THF和5，10-亞甲基-THF(它們分別用于嘌呤和胸苷酸的從頭生物合成)相與轉(zhuǎn)換。DHF是胸苷酸合酶(TS)的催化活性的副產(chǎn)物，該胸苷酸合酶在5，10-亞甲基-THF依賴性反應(yīng)中催化dUMP至dTMP的轉(zhuǎn)化。因此，DHFR對THF輔因子的再循環(huán)是至關(guān)重要的，而THF輔因子對DNA復(fù)制所必要的嘌呤和嘧啶核苷酸的生物合成是必不可少的。因此，缺少DHFR基因(即通過靶向的基因組缺失)的細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)可用作在不含核苷酸的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染DHFR基因的受體。轉(zhuǎn)染后，可使細(xì)胞接觸濃度逐步增長的抗葉酸劑MTX(—種最有效的DHFR抑制劑(Kd=IpM))，由此迫使細(xì)胞產(chǎn)生增加水平的DHFR。經(jīng)多輪選擇后，選擇標(biāo)記DHFR通常經(jīng)歷顯著的基因擴增。此外，對MTX具有較大耐藥性的突變型小鼠DHFR也已廣泛用作顯著增加轉(zhuǎn)染子細(xì)胞中高水平MTX-耐藥性的獲得的顯性選擇標(biāo)記。DHFR/MTX選擇系統(tǒng)的主要缺點是該技術(shù)利用了誘變性細(xì)胞毒素劑MTX，MTX可容易地改變受體細(xì)胞的基因型。此外，可能必須采取具體的安全措施來保護操作該活性劑的人員。這常常導(dǎo)致耐MTX的細(xì)胞群，在該細(xì)胞群中由于還原型葉酸化合物載體(RFC)的功能喪失性突變和/或RFC基因表達(dá)的喪失(兩者均可破壞MTX攝取)，而不存在目的靶基因的表達(dá)。另一個缺點是誘變性藥物MTX可容易地污染生長培養(yǎng)基中所含的分泌的過表達(dá)靶產(chǎn)物(例如多肽，如抗體)，因此需要費力、耗時且昂貴的色譜方法清除這種誘變性化合物MTX。此外，終產(chǎn)物中MTX的缺乏必須通過相應(yīng)試驗來證實。
[0008](c)還原型葉酸化合物載體選擇系統(tǒng):還原型葉酸化合物載體(RFC)是一種泛表達(dá)的膜糖蛋白，其是攝取還原型葉酸化合物如5-甲基-THF和5-甲?；?THF的主要轉(zhuǎn)運蛋白。然而，RFC對氧化型葉酸化合物，即葉酸(folic acid),具有很弱的親和力。因此,缺少RFC表達(dá)或基因組RFC座位已缺失的細(xì)胞可以用作在如下條件下轉(zhuǎn)染選擇標(biāo)記基因RFC的受體，在所述條件下逐漸從生長培養(yǎng)基中剝奪還原型葉酸化合物如5-甲?；?THF，從而迫使細(xì)胞表達(dá)增加水平的該葉酸化合物轉(zhuǎn)運蛋白。RFC選擇系統(tǒng)有幾個缺點:a)必須使用內(nèi)源性RFC基因座已經(jīng)被敲除或者已通過靶向敲除或功能喪失性突變而失活的RFC-無效受體細(xì)胞。b)RFC對氧化型葉酸化合物，即葉酸(folic acid)的轉(zhuǎn)運親和力極弱，因此這種氧化型葉酸化合物不能用于選擇。c)與現(xiàn)基于葉酸化合物受體的系統(tǒng)(其為單向葉酸化合物攝取系統(tǒng)并且在下文詳細(xì)地解釋)相反，RFC是表現(xiàn)出同等有力的葉酸化合物輸入和輸出的雙向葉酸化合物轉(zhuǎn)運蛋白。這提示，在葉酸化合物剝奪的情況下，RFC過表達(dá)可能對受體細(xì)胞是有害的，所述受體細(xì)胞會經(jīng)由過表達(dá)的RFC而進(jìn)一步輸出葉酸化合物。
[0009]本發(fā)明的目的是提供比上述的現(xiàn)有技術(shù)選擇系統(tǒng)具有某些優(yōu)勢的新代謝選擇系統(tǒng)。該新選擇系統(tǒng)基于:在細(xì)胞培養(yǎng)基中使用葉酸化合物、以及存在經(jīng)由表達(dá)載體引入意欲產(chǎn)生目的產(chǎn)物的重組真核細(xì)胞中的葉酸化合物受體。該新方法不需要內(nèi)源性葉酸化合物受體(FR)基因的在先缺失。在引入包含F(xiàn)R選擇基因以及編碼目的產(chǎn)物(如多肽)的多核苷酸的載體后，使細(xì)胞在含有高度限制性濃度的葉酸化合物的選擇培養(yǎng)基中生長。這樣，只有顯著過表達(dá)FR的細(xì)胞可攝取`足夠的葉酸化合物以維持細(xì)胞生長、DNA復(fù)制和細(xì)胞增殖，從而允許過表達(dá)目的靶產(chǎn)物。
[0010]氧化型葉酸化合物(即葉酸)以及葉酸的還原型衍生物(稱為還原型葉酸化合物或四氫葉酸化合物(THF))是一組B-9維生素，其是真核細(xì)胞(特別是哺乳動物細(xì)胞)中生物合成嘌呤、胸苷酸和某些氨基酸所必不可少的輔因子和/或輔酶。THF輔因子對DNA復(fù)制并由此對細(xì)胞增殖尤其重要。具體來說，THF輔因子作為一碳單位的供體在一系列相互關(guān)聯(lián)的代謝途徑中起作用，所述代謝途徑包括嘌呤和胸苷酸的從頭生物合成、氨基酸以及甲基基團的代謝(包括DNA的CpG島甲基化)。具體來說，THF輔因子，包括10-甲酰基-THF(IO-CHO-THF)，在涉及嘌呤從頭生物合成的兩個關(guān)鍵性從頭甲酰基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)中貢獻(xiàn)一碳單位。第一個酶甘氨酰胺核苷酸轉(zhuǎn)甲酰酶(GARTF)參與嘌呤的咪唑環(huán)形成，而由5-氨基咪唑-4-羧酰胺核苷酸轉(zhuǎn)甲酰酶(AICARTF)介導(dǎo)的更下游反應(yīng)產(chǎn)生嘌呤中間體肌苷5’ -單磷酸(MP)。后者是受調(diào)節(jié)的AMP和GMP生物合成的關(guān)鍵前體。此外，5，10-亞甲基-THF (5，IO-CH2-THF)是另一個重要的THF輔酶，其作為酶胸苷酸合酶(TS)的關(guān)鍵輔因子起作用。TS催化由dUM P形成胸苷單磷酸(dTMP)。因此，這些葉酸化合物依賴性酶是DNA復(fù)制所必需的嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸的從頭生物合成的關(guān)鍵介質(zhì)。由此，這些葉酸化合物依賴性酶被確定為葉酸拮抗劑(稱為抗葉酸劑)活性的靶點。例如，4-氨基葉酸類似物氨基蝶呤及其同系物4-氨基-10-甲基葉酸氨甲蝶呤(MTX)是第一類抗代謝物，其被引入臨床用于化療治療兒童急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)。抗葉酸劑目前是當(dāng)前用于治療其它人類惡性腫瘤(包括骨肉瘤、乳腺癌、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、絨毛膜癌和妊娠滋養(yǎng)層細(xì)胞瘤形成)的不同化療方案的關(guān)鍵組分。
[0011]與合成其自身葉酸化合物的大多數(shù)原核生物、植物、真菌和某些protests相比，哺乳動物和其它真核生物物種缺少THF輔因子生物合成，因此必須從外源性來源獲得它們。目前已知三個獨立的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)介導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞中葉酸化合物和抗葉酸劑的攝取。
[0012]a)還原型葉酸化合物輔因子的主要細(xì)胞轉(zhuǎn)運系統(tǒng)是還原型葉酸化合物載體(RFC)。RFC (也稱為溶質(zhì)載體家族19成員1，SLC19A1)是廣泛表達(dá)的~85kDa膜糖蛋白，其是雙向易化載體，通過交換有機磷酸(如已知蓄積至非常高細(xì)胞內(nèi)水平的腺嘌呤核苷酸，以及硫胺素單磷酸和焦磷酸)介導(dǎo)還原型葉酸化合物的向上轉(zhuǎn)運。RFC對THF輔因子(包括甲酰四氫葉酸(5-甲?；?THF5Kt=I μ M))顯示高親和力，然而對葉酸，即氧化型葉酸化合物，僅具有很弱的轉(zhuǎn)運親和力(Kt=200-400 μ Μ)。
[0013]b)葉酸化合物攝取的另一路徑是最近已被克隆的質(zhì)子偶聯(lián)葉酸化合物轉(zhuǎn)運蛋白(PCFT，也稱為SLC46A)。PCFT似乎獨立于RFC表達(dá)，在酸性pH (5.5)具有最佳功能并且介導(dǎo)氧化型葉酸化合物(例如葉酸)和THF輔因子(即還原型葉酸化合物)以及各種親水性抗葉酸劑(包括MTX)的流入。PCFT在酸性pH(5.5)而非生理pH(7.4)顯示最佳的葉酸化合物和抗葉酸劑轉(zhuǎn)運，并在小腸上部的葉酸化合物和抗葉酸劑吸收中起關(guān)鍵作用。
[0014]c)第三轉(zhuǎn)運路徑，即本發(fā)明所基于的路徑，涉及葉酸化合物受體(FR)。FR是由三種不同基因，F(xiàn)Ra、FRii和FR Y，編碼的高親和力葉酸化合物結(jié)合糖蛋白。FRa (或FR alpha)也被稱為成人葉酸化合物結(jié)合蛋白或FDP、葉酸化合物受體I或FOLR(小鼠中folbpl)，以及卵巢癌相關(guān)抗原或MOvlSt5FRe (或FR beta)也被稱為F0LR2 (胎兒)和FBP/PL-1 (胎盤)。FR Y (或 FR gamma)也被稱為 F0LR3 和 FR-G (由 M.D.Salazar 和 M.Ratnam綜述，Cancer Metastasis Rev.200726 (I)，第141-52頁)。成熟FR獲得很好的表征，是具有~70-80%氨基酸同一性的同源蛋白，包含229至236個氨基酸以及兩個至三個N-糖基化位點。FRa和FRP是膜結(jié)合性的、特別地帶糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨的，細(xì)胞表面糖蛋白，而FR Y缺少GPI錨且是分泌蛋白。FRa和FRP對于葉酸(Kd=0.1-1nM)、5，10-二脫氮雜四氫葉酸(DDATHF ;洛美曲索(1metrexol) ；Ki=0.4-1.3nM，使用[3H]葉酸作為底物)和86〇945(其為僅通過？1^而不通過還原型葉酸化合物載體特異性轉(zhuǎn)運的基于環(huán)戊并[g]喹唑啉的胸苷酸合酶抑制劑)(Kd=InM)顯示高親和力，但對于MTX(Kd>100nM)則顯示低得多的親和力。葉酸化合物和抗葉酸劑的FR依賴性攝取通過經(jīng)典的受體介導(dǎo)的內(nèi)吞機制進(jìn)行。基因敲除研究已顯示，F(xiàn)Ra (小鼠中也稱為Folbpl)對早期胚胎發(fā)育以及母體葉酸化合物補充(挽救子宮內(nèi)胚胎致死以及允許正常發(fā)育)是必不可少的。
[0015]持續(xù)需要安全、高效和成本有效的、能克服迄今已知的選擇系統(tǒng)的一個或多個缺點的選擇系統(tǒng)。
[0016]發(fā)明概沭
[0017]本發(fā)明涉及真核生物表達(dá)載體，其包括編碼功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體的第一多核苷酸和編碼目的產(chǎn)物的第二多核苷酸。[0018]本發(fā)明還涉及細(xì)胞生存力依賴于葉酸攝取的真核細(xì)胞，該真核細(xì)胞已穩(wěn)定地引入了所述表達(dá)載體，由此該細(xì)胞表達(dá)該載體所編碼的功能性葉酸化合物受體。
[0019]此外，本發(fā)明涉及選擇方法，該方法用于提供能高產(chǎn)率地穩(wěn)定表達(dá)目的產(chǎn)物的重組真核細(xì)胞。
[0020]本發(fā)明可有利地用于高產(chǎn)率地生產(chǎn)目的產(chǎn)物的方法。
[0021]發(fā)明詳沭
[0022]在本發(fā)明中，現(xiàn)已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，可基于在細(xì)胞培養(yǎng)基中葉酸化合物的限制可用量，建立用于提供能夠產(chǎn)生目的產(chǎn)物的重組真核細(xì)胞的選擇系統(tǒng)。該系統(tǒng)將是廣泛適用的，即，廣泛地適用于細(xì)胞生存力依賴于葉酸化合物攝取的真核細(xì)胞。
[0023]該新系統(tǒng)可用于加速選擇、篩選和建立在沒有細(xì)胞毒性藥物的情況下穩(wěn)定地過表達(dá)高水平重組產(chǎn)物的真核細(xì)胞(例如哺乳動物細(xì)胞)克隆。進(jìn)一步地，并且與其它已知的選擇系統(tǒng)不同地，對于，例如通過突變或敲除內(nèi)源性基因，提供修飾的細(xì)胞，并沒有必然的需要(盡管有時是可行的)。因為例如FRa對FA(KD=0.InM)的親和力比例如RFC對甲酰四氫葉酸(Kt=IyM)的親和力更高，且FRa通過單向途徑轉(zhuǎn)運葉酸到細(xì)胞中，因此本發(fā)明提供了 FRa和其它葉酸化合物受體用作顯著改良的顯性代謝選擇標(biāo)記的用途，特別是通過從生長培養(yǎng)基中逐步剝奪葉酸化合物(例如葉酸)的方式。該新的基于葉酸化合物的選擇是一個優(yōu)良的策略，十分適于在不存在細(xì)胞毒性藥物選擇(在多種過表達(dá)系統(tǒng)中常規(guī)使用)的情況下靶蛋白在培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中加速的、穩(wěn)定且高水平的過表達(dá)。
[0024]此新選擇系統(tǒng)比現(xiàn)有技術(shù)中可用的選擇系統(tǒng)具有幾個重要的優(yōu)勢。
[0025]1.根據(jù)本發(fā)明的選擇系統(tǒng)是非常快速的選擇系統(tǒng)。在葉酸剝奪的四個星期內(nèi)，可容易地分離出表達(dá)目的靶基`因的細(xì)胞群或克隆細(xì)胞衍生物。這明顯地有別于上述的GS系統(tǒng)，GS系統(tǒng)可能需要2-6個月的靶基因選擇和穩(wěn)定化。
[0026]2.根據(jù)本發(fā)明的選擇系統(tǒng)在轉(zhuǎn)染之前不需要內(nèi)源性FRa、β或Y基因的基因組缺失或衰減，因此可用于任何受體細(xì)胞，即使在存在一些內(nèi)源性FR基因表達(dá)時。這種關(guān)鍵的優(yōu)勢是基于以下事實:在FRa轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞可以暴露于生長培養(yǎng)基中突然且嚴(yán)重的葉酸化合物(例如葉酸)剝奪。由此，僅表達(dá)顯著量的選擇FR a標(biāo)記的轉(zhuǎn)染子細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)運足夠的葉酸化合物以維持DNA復(fù)制和細(xì)胞增殖。這發(fā)生在無內(nèi)源性FRa基因表達(dá)的任何顯著升高的情況下。這與上述的DHFR/MTX系統(tǒng)不同，DHFR/MTX系統(tǒng)中受體細(xì)胞往往是內(nèi)源性DHFR基因缺失的(例如CHO DG44細(xì)胞和CHO Dux細(xì)胞)。
[0027]c)根據(jù)本發(fā)明的選擇系統(tǒng)不會遭遇因葉酸化合物攝取替代路徑的增加表達(dá)(包括內(nèi)源性RFC的增加表達(dá))引起的選擇壓力緩解而導(dǎo)致的選擇嚴(yán)緊性的喪失。這種重要的優(yōu)勢是因為以下事實=FRa對于葉酸(Kd=0.1nM)具有突出的親和力，而RFC對于葉酸(Km=0.2-0.4mM)顯示極弱的親和力。相比之下，由于在MTX選擇后常常會導(dǎo)致沒有選擇標(biāo)記表達(dá)或具有弱選擇標(biāo)記表達(dá)的MTX耐受性細(xì)胞，包括DHFR/MTX系統(tǒng)的多種現(xiàn)有技術(shù)選擇系統(tǒng)可遭受選擇嚴(yán)緊性的嚴(yán)重喪失。而RFC(主要的MTX轉(zhuǎn)運蛋白)的功能喪失可能是MTX耐藥性的常見機制。已經(jīng)顯示，這可由頻繁出現(xiàn)的RFC基因中失活突變或RFC基因表達(dá)的嚴(yán)重喪失所致。
[0028]d)根據(jù)本發(fā)明的選擇系統(tǒng)不使用可以改變受體細(xì)胞的基因型和目的靶基因的細(xì)胞毒性藥物和/或誘變性化合物，如DHFR系統(tǒng)中的MTX或GS系統(tǒng)中的MSX。相反地，F(xiàn)R選擇所利用的原理是自生長培養(yǎng)基中剝奪維生素。
[0029]因此，在一個方面，本發(fā)明涉及真核生物表達(dá)載體，其包括編碼功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體(即選擇標(biāo)記基因)的第一多核苷酸和編碼目的產(chǎn)物的第二多核苷酸。
[0030]根據(jù)本發(fā)明的功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體特別地被定義為能單向輸入或攝取葉酸化合物到真核細(xì)胞中的功能性膜結(jié)合受體。
[0031]根據(jù)本發(fā)明的葉酸化合物可以是氧化型葉酸化合物(即葉酸)或還原型葉酸化合物。一般而言，任何葉酸化合物均可用于本發(fā)明中，只要該葉酸化合物能通過功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體攝取到真核細(xì)胞中。優(yōu)選的氧化型葉酸化合物的實例是葉酸。優(yōu)選的還原型葉酸化合物的實例是5-甲基-四氫葉酸、5-甲?；?四氫葉酸、10-甲?；?四氫葉酸和5，10-亞甲基-四氫葉酸。
[0032]在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的表達(dá)載體能在真核細(xì)胞中表達(dá)功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體和目的產(chǎn)物兩者。
[0033]由第二多核苷酸編碼的目的產(chǎn)物可以是能通過第二多核苷酸所編碼的遺傳信息的轉(zhuǎn)錄、翻譯、或任何其他表達(dá)事件產(chǎn)生的任何生物學(xué)產(chǎn)物。在這點上，該產(chǎn)物是表達(dá)產(chǎn)物。例如，在優(yōu)選的實施方案中，該產(chǎn)物選自多肽、RNA和DNA?！岸嚯摹笔侵赴ㄓ呻逆I連在一起的氨基酸聚合物的分子。術(shù)語“多肽”包括任何長度的多肽，在較大分子(包括例如約50個以上氨基酸)的情況下可稱為“蛋白質(zhì)”或者在較小分子(包括例如2-49個氨基酸)的情況下可稱為“肽”。產(chǎn)物可以是具有藥學(xué)活性或治療活性的化合物，或者可以是用于分析試驗等的研究工具。在特別優(yōu)選的實施方案中，該產(chǎn)物是多肽，優(yōu)選藥學(xué)上或治療上活性的多肽，或者是用于診斷或其它分析試驗等的研究工具。在最優(yōu)選的實施方案中，該多肽是免疫球蛋白分子或抗體，或其片段(特別是功能性片段)，例如嵌合體，或部分或完全人源化的抗體?？贵w可以是診斷抗體，或藥學(xué)上或治療上活性的抗體。通常，目的產(chǎn)物與用于表達(dá)的真核宿主細(xì)胞異源，這意味`著宿主細(xì)胞在轉(zhuǎn)染之前不會天然地或內(nèi)源地產(chǎn)生目的產(chǎn)物。相反地，為了實現(xiàn)目的產(chǎn)物的生產(chǎn)或表達(dá)，必須將編碼目的產(chǎn)物的多核苷酸，特別地通過用根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，引入到真核宿主細(xì)胞中。
[0034]根據(jù)本發(fā)明的載體可以以線性形式、或者優(yōu)選地以環(huán)狀形式例如質(zhì)粒存在。
[0035]用于表達(dá)目的多核苷酸的載體通常包含適于驅(qū)動轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄控制元件，例如啟動子、增強子、多腺苷酸化信號、轉(zhuǎn)錄停止信號或終止信號。如果所需產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，適宜的轉(zhuǎn)錄控制元件通常包括在載體中，例如5’非翻譯區(qū)(導(dǎo)致適于募集核糖體的5’帽結(jié)構(gòu))和終止密碼子(以終止翻譯進(jìn)程)。特別地，用作選擇標(biāo)記基因的多核苷酸以及編碼目的產(chǎn)物的多核苷酸在存在于適宜啟動子中的轉(zhuǎn)錄元件的控制下轉(zhuǎn)錄。所得的選擇標(biāo)記基因和目的產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄物包含利于實質(zhì)性水平的蛋白質(zhì)表達(dá)(即翻譯)的功能性翻譯元件。
[0036]因此,一個優(yōu)選的實施方案涉及根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體，其中第一多核苷酸和第二多核苷酸在分開的轉(zhuǎn)錄啟動子的控制下。一般地，能引起第一和/或第二多核苷酸在真核細(xì)胞中表達(dá)(尤其是轉(zhuǎn)錄)的啟動子是合適的。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述分開的轉(zhuǎn)錄啟動子是相同的。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述分開的轉(zhuǎn)錄啟動子是不同的。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄啟動子選自SV40啟動子、CMV啟動子、EFl α啟動子、RSV啟動子、BR0AD3啟動子、鼠rosa26啟動子、pCEFL啟動子和β-肌動蛋白啟動子。在其一個優(yōu)選的實施方案中，控制第一多核苷酸和/或第二多核苷酸轉(zhuǎn)錄的啟動子是CMV啟動子，或最優(yōu)選是SV40啟動子。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，控制第一多核苷酸轉(zhuǎn)錄的啟動子是SV40啟動子。
[0037]在本發(fā)明表達(dá)載體的另一個優(yōu)選的實施方案中,第一多核苷酸和第二多核苷酸在共同轉(zhuǎn)錄啟動子的控制下。優(yōu)選地，該轉(zhuǎn)錄啟動子選自SV40啟動子、CMV啟動子、RSV啟動子、BR0AD3啟動子、鼠iOSa26啟動子、pCEFL啟動子和β-肌動蛋白啟動子。在其更優(yōu)選的實施方案中，該共同轉(zhuǎn)錄啟動子是SV40啟動子。具有共同轉(zhuǎn)錄啟動子的表達(dá)載體的一個更優(yōu)選的實施方案包括功能性地位于第一多核苷酸和第二多核苷酸之間的IRES元件。
[0038]借助于本發(fā)明的表達(dá)載體引入到真核宿主細(xì)胞中的膜結(jié)合葉酸化合物受體可以來源于任何物種，只要它在本發(fā)明內(nèi)是功能性的，即與所用的真核細(xì)胞相容即可。優(yōu)選地，使用來源于哺乳動物物種的葉酸化合物受體，例如來源于嚙齒類動物的葉酸化合物受體，或最優(yōu)選地人葉酸化合物受體。一般地，引入到真核宿主細(xì)胞中且用作選擇標(biāo)記的該葉酸化合物受體可以與宿主細(xì)胞的內(nèi)源性葉酸化合物受體同源或異源。如果是同源的，它來源于與宿主細(xì)胞相同的物種，且可以例如與宿主細(xì)胞的內(nèi)源性葉酸化合物受體相同。如果是異源的，它來源于與宿主細(xì)胞不同的另一物種，因此可不同于宿主細(xì)胞的內(nèi)源性葉酸化合物受體。通常，用作選擇標(biāo)記的引入的葉酸化合物受體與宿主細(xì)胞異源。例如人源性葉酸化合物受體可作為選擇標(biāo)記用于嚙齒類動物宿主細(xì)胞如CHO細(xì)胞。
[0039]優(yōu)選地，由本發(fā)明表達(dá)載體的第一多核苷酸編碼的功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體選自葉酸化合物受體a (FRa )、葉酸化合物受體β (FR0 )及其功能突變體。功能突變體包括以生理學(xué)方式起作用的(即能被真核細(xì)胞攝取并通過細(xì)胞的葉酸化合物代謝對細(xì)胞存活作出貢獻(xiàn)的)葉酸化合物受體衍生物。例如，葉酸化合物受體的突變體形式可以包括一個或多個氨基酸突變，如置換、缺失和/或添加、以及化學(xué)衍生物，其中化學(xué)部分如聚合物(例如聚乙二醇結(jié)構(gòu)(PEG))連接于葉酸化合物受體。優(yōu)選地，由第一多核苷酸編碼的葉酸化合物受體是人葉酸化合物受體a (hFRa )、人葉酸化合物受體β (hFRa )或其功能突變體。最優(yōu)選的是人葉酸化合物受體a (hFRa )，優(yōu)選具有以下氨基酸序列(SEQ ID N01，l字母代碼，按N-端至C-端的方向顯示):
[0040]MAQRMTTQLLLLLVWVAVVGEAQTRIA`WARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEAHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQffWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTULCNEIffTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQCNPNEEVARFYAAAMSGAGPffAAffPFLLSLALMLLffLLS
[0041]另一優(yōu)選的實施方案涉及具有以下氨基酸序列(SEQ ID N02，l_字母代碼，按N-端至C-端的方向顯示)的人葉酸化合物受體β (hFR^):
[0042]MVWKWMPLLLLLVCVATMCSAQDRTDLLNVCMDAKHHKTKPGPEDKLHDQCSPWKKNACCTASTSQELHKDTSRLYNFNWDHCGKMEPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVNQTWRKERFLDVPLCKEDCQRffWEDCHTSHTGKSNWHRGWDWTSGVNKCPAGALCRTFESYFPTPAALCEGLWSHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFOSAQGNPNEEVARFYAAAMHVNAGEMLHGTGGLLLSLALMLQLffLLG
[0043]在一個備選實施方案中，本發(fā)明涉及在其自然環(huán)境中不是膜結(jié)合的葉酸化合物受體。這種非膜結(jié)合受體可突變成為膜結(jié)合的，例如通過提供該非膜結(jié)合葉酸化合物受體與另一多肽的跨膜區(qū)之間的融合蛋白。同樣地，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說容易可得的其它突變形式也是可以的。在這點上，優(yōu)選的例子基于可溶性葉酸化合物受體Y (FRY)，優(yōu)選人可溶性葉酸化合物受體Y (FRY)。在其最優(yōu)選的實施方案中，人可溶性葉酸化合物受體Y (FRy)具有以下氨基酸序列(SEQ ID N03，1-字母代碼，按N-端至C-端的方向顯示):
[0044]MDMAWQMMQL LLLALVTAAG SAQPRSARAR TDLLNVCMNA KHHKTQPSPEDELYGQCSPffKKNACCTAST SQELHKDTSR LYNFNWDHCG KMEPTCKRHFIQDSCLYECS PNLGPffIRQV NQSffRKERILNVPLCKEDCE RffffEDCRTSYTCKSNffHKGff NffTSGINECP AGALCSTFES YFPTPAALCEGLWSHSFKVSNYSRGSGRCI QMWFDSAQGN PNEEVAKFYA AAMNAGAPSR GIIDS
[0045]然后其可以被突變或者被遺傳改變或衍生化以形成能在本發(fā)明中實現(xiàn)葉酸化合物攝取的功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體。
[0046]在另一個方面，根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體還可包括編碼一個或多個另外的選擇標(biāo)記的一個或多個其它的多核苷酸。因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，可以通過利用本發(fā)明的葉酸化合物系統(tǒng)以及一種或多種不同的選擇系統(tǒng)(例如neo/G418)的共選擇，提供最佳的性倉泛。
[0047]在另一個方面，本發(fā)明涉及細(xì)胞生存力依賴于葉酸化合物攝取的真核細(xì)胞，其中該真核細(xì)胞中已穩(wěn)定地引入了位于表達(dá)載體上且編碼功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體的第一多核苷酸和位于表達(dá)載體上且編碼目的產(chǎn)物的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸位于同一表達(dá)載體上或位于分開的表達(dá)載體上。在其優(yōu)選的實施方案中，所述功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體和所述目的產(chǎn)物被所述真核細(xì)胞表達(dá)。
[0048]除通過表達(dá)載體引入到細(xì)胞系中的功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體之外，根據(jù)本發(fā)明的真核細(xì)胞還可以包括至少一種內(nèi)源功能性單向葉酸化合物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，特別是一種或多種內(nèi)源功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體。本發(fā)明的一個優(yōu)勢在于，即使存在該內(nèi)源功能性單向葉酸化合物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(即在保持該內(nèi)源系統(tǒng)的情況下)，也可以利用下文所描述的選擇方法。因此，一個更優(yōu)選的實施 方案涉及本發(fā)明的真核細(xì)胞，其包括至少一種內(nèi)源性單向功能性葉酸化合物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，其中該內(nèi)源性單向功能性葉酸化合物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)優(yōu)選包括至少一種內(nèi)源性功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體。在其優(yōu)選的實施方案中，所述內(nèi)源性功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體選自葉酸化合物受體a (FRa)和葉酸化合物受體β (FR3)。
[0049]另一個優(yōu)選的實施方案涉及根據(jù)本發(fā)明的真核細(xì)胞，其中所述內(nèi)源性單向功能性葉酸化合物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(例如，包括至少例如一種內(nèi)源性功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體)缺乏完全活性，即是衰減的?？梢岳缤ㄟ^目的內(nèi)源性葉酸化合物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(例如內(nèi)源性功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體)的任何類型誘變，例如點突變、基因中斷等，提供這種衰減。衰減可以是部分的或完全的。在后一情況下，根據(jù)本發(fā)明的真核細(xì)胞不包括內(nèi)源性功能性單向葉酸化合物轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，例如內(nèi)源性功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體。因此，本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案涉及已穩(wěn)定地引入了本發(fā)明的表達(dá)載體的真核細(xì)胞，所述細(xì)胞缺乏至少一種內(nèi)源性功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體的完全活性。
[0050]就引入到所述宿主細(xì)胞中的表達(dá)載體而言，可以利用如本文所述的任何本發(fā)明表達(dá)載體(包括其優(yōu)選的實施方案)。在本發(fā)明真核細(xì)胞的一個優(yōu)選實施方案中，編碼功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體的第一多核苷酸和編碼目的產(chǎn)物的第二多核苷酸位于同一表達(dá)載體上。優(yōu)選地，該表達(dá)載體是根據(jù)本發(fā)明(即，如本文所述)的表達(dá)載體。
[0051]根據(jù)本發(fā)明的真核細(xì)胞優(yōu)選選自哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞和真菌細(xì)胞。就真菌細(xì)胞和植物細(xì)胞而言，其對于葉酸化合物通常是原養(yǎng)型的(即，這種細(xì)胞可自主地合成對其細(xì)胞生存力，即細(xì)胞生長和增殖，所必需的自身葉酸化合物)。本發(fā)明特別包括可以變成葉酸化合物營養(yǎng)缺陷型的此類真菌和植物細(xì)胞。這可以例如通過基因操作實現(xiàn)，即，細(xì)胞目前不能合成對其細(xì)胞生存所必需的足量葉酸化合物。例如，可以通過諸如適當(dāng)靶基因的基因破壞或基因沉默、或者關(guān)鍵酶的抑制等，失活該真菌或植物細(xì)胞(例如通過適當(dāng)?shù)拇x途徑)內(nèi)源性地生物合成葉酸化合物的能力。
[0052]在其優(yōu)選的實施方案中，該真核細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。優(yōu)選地，該哺乳動物細(xì)胞選自嚙齒類動物細(xì)胞、人細(xì)胞和猴細(xì)胞。特別優(yōu)選的是嚙齒類動物細(xì)胞，優(yōu)選選自CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、NSO細(xì)胞、小鼠3T3成纖維細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞。最特別優(yōu)選的嚙齒類動物細(xì)胞是CHO細(xì)胞。還優(yōu)選的是人細(xì)胞，優(yōu)選選自HEK293細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞、PerC6細(xì)胞和HeLa細(xì)胞。再優(yōu)選為猴細(xì)胞，優(yōu)選選自COS-1、C0S-7細(xì)胞和Vero細(xì)胞。
[0053]在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及制備根據(jù)本發(fā)明的真核細(xì)胞的方法，所述方法包括提供細(xì)胞生存力依賴于葉酸化合物攝取的真核細(xì)胞，和引入位于表達(dá)載體上且編碼功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體的第一多核苷酸和位于表達(dá)載體上且編碼目的產(chǎn)物的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸位于同一表達(dá)載體上或位于分開的表達(dá)載體上。在優(yōu)選的實施方案中，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸位于同一表達(dá)載體上，在最優(yōu)選的實施方案中，該表達(dá)載體是根據(jù)本發(fā)明(即，如本文所述)的表達(dá)載體。
[0054]本發(fā)明的再其它方面涉及用于選擇真核細(xì)胞的方法，其中該真核細(xì)胞能穩(wěn)定地表達(dá)由已引入到該細(xì)胞中的表達(dá)載體編碼的目的產(chǎn)物，所述方法包括
[0055](i)提供細(xì)胞生存力依賴于葉酸化合物攝取的多個真核細(xì)胞，其中在所述細(xì)胞中已經(jīng)引入了位于表達(dá)載體上且編碼功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體的第一多核苷酸和位于表達(dá)載體上且編碼目的產(chǎn)物的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸位于同一表達(dá)載體上或位于分開的表達(dá)載體上，
[0056](ii)在具有限制性濃度的葉酸化合物的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述多個真核細(xì)胞，由此獲得穩(wěn)定表達(dá)目的產(chǎn)物的真核細(xì)胞。原則上，該葉酸化合物可以是氧化型葉酸化合物或還原型葉酸化合物。優(yōu)選的是氧化型葉酸化合物，特別是葉酸。
`[0057]就限制量的葉酸化合物而言，培養(yǎng)基中的適宜濃度可依照宿主細(xì)胞的要求以及待用的選擇條件的嚴(yán)緊性，由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。在葉酸用作該葉酸化合物的情況下，例如對于CHO宿主細(xì)胞，用于嚴(yán)緊性選擇方法的細(xì)胞培養(yǎng)基中適宜的葉酸濃度約為IOOnM或更低，優(yōu)選約30nM或更低，或者約IOnM或更低。例如，適宜的葉酸濃度可以是在
0.0OlnM-1OOnM的范圍、優(yōu)選在0.01nM-1OOnM的范圍、更優(yōu)選在0.1nM-1OOnM的范圍或在InM-1OOnM的范圍內(nèi)的任何值。同樣地，優(yōu)選0.001nM_30nM的范圍、0.01nM_30nM的范圍、
0.1ηΜ-30ηΜ的范圍、1ηΜ-30ηΜ的范圍或3nM-10nM的范圍。例如，適于選擇的細(xì)胞培養(yǎng)基中的葉酸濃度可以是1ηΜ、3ηΜ、10ηΜ或30nM。
[0058]在還原型葉酸化合物如甲酰四氫葉酸用于選擇方法時，其濃度也可依照宿主細(xì)胞的要求以及待用的選擇條件的嚴(yán)緊性，由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。對于嚴(yán)緊性選擇方法，細(xì)胞培養(yǎng)基中的甲酰四氫葉酸濃度可以為例如0.2nM-2nM。
[0059]在其進(jìn)一步的實施方案中，選擇方法還包括鑒定和分離實現(xiàn)了目的產(chǎn)物的穩(wěn)定表達(dá)的真核細(xì)胞。
[0060]在選擇方法的一個最優(yōu)選的實施方案中，該多個真核細(xì)胞由根據(jù)本發(fā)明(即，如本文所公開)的真核細(xì)胞組成。[0061]本發(fā)明此方面的其它優(yōu)選實施方案如本文所述，特別是就真核細(xì)胞和表達(dá)載體所描述的。
[0062]本發(fā)明的另一個實施方案涉及生產(chǎn)目的產(chǎn)物的方法，其包括
[0063](i)實施根據(jù)本發(fā)明(即，如本文所公開)的選擇方法，
[0064](ii)從所述細(xì)胞培養(yǎng)基或所述細(xì)胞分離目的產(chǎn)物。
[0065]本發(fā)明此方面的優(yōu)選實施方案也如本文所述，特別是就真核細(xì)胞和表達(dá)載體所描述的。
[0066]依照本發(fā)明產(chǎn)生的目的產(chǎn)物例如多肽可以通過本領(lǐng)域已知方法回收、進(jìn)一步純化和分離。例如，多肽可通過常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離心。過濾、超濾、提取或沉淀。純化可通過多種本領(lǐng)域已知的方法來進(jìn)行，所述方法包括但不限于色譜法(例如離子交換色譜法、親和色譜法、疏水色譜法、色譜聚焦和大小排阻色譜法)、電泳方法(例如制備型等電聚焦)、差異溶解度(例如硫酸銨沉淀)或提取。
[0067]本發(fā)明的其它方面涉及功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體作為選擇標(biāo)記用于選擇真核細(xì)胞的用途，其中該真核細(xì)胞的細(xì)胞生存力依賴于葉酸化合物攝取且該真核細(xì)胞能穩(wěn)定地表達(dá)目的產(chǎn)物。在該用途的一個優(yōu)選的實施方案中，所述葉酸化合物受體選自葉酸化合物受體a (FRa )、葉酸化合物受體β (FR^)及其功能突變體。優(yōu)選地，在本發(fā)明的這個方面中利用的葉酸化合物受體是相應(yīng)的人葉酸化合物受體，優(yōu)選人葉酸化合物受體a (FRa)0本發(fā)明的這個方面的其它優(yōu)選的實施方案如本文所述，特別是就真核細(xì)胞和表達(dá)載體所描述的。
[0068]本文所提及的科教書和文件的全部內(nèi)容通過引用并入本文。
`[0069]下述實施例用來舉例說明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。具體來說，這些實施例涉及本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。
實施例
[0070]一般地，此處提及的材料如試劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，市售可得，并且可依照制造商的說明書來使用。
[0071]實施例1:利用基于葉酸化合物-受體的選擇系統(tǒng)來高水平表達(dá)重組抗體
[0072]實施例1.1:表汰載體
[0073]適于在真核細(xì)胞(特別是CHO細(xì)胞)中表達(dá)的質(zhì)粒載體(即試驗載體)包含(i)包括編碼IgGl型分泌重組人抗體的重鏈和輕鏈的多核苷酸的表達(dá)盒；和(ii)包括作為選擇標(biāo)記基因的編碼人葉酸受體a (hFRa)的多核苷酸的不同表達(dá)盒，所述質(zhì)粒載體被構(gòu)建以研究在培養(yǎng)基中限制性濃度的葉酸化合物(即葉酸)下選擇hFR a-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的效率。人葉酸受體a (hFRa)的表達(dá)在SV40啟動子和標(biāo)準(zhǔn)(SV40)多腺苷酸化信號的控制下。重組抗體的表達(dá)在CMV啟動子和標(biāo)準(zhǔn)(SV40)多腺苷酸化信號的控制下。作為對照(即對照載體)，使用類似的表達(dá)載體，其編碼相同的抗體，缺乏hFRa表達(dá)盒，但含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因作為選擇標(biāo)記。
[0074]實施例1.2:細(xì)朐和牛長備件
[0075]在含有2.3yM(microM)葉酸的適宜的化學(xué)成分確知生長培養(yǎng)基中、在懸浮培養(yǎng)條件下維持源自菌株CHO-Kl的中國倉鼠卵巢細(xì)胞。[0076]為了分析細(xì)胞存活對葉酸的依賴性，使用2300nM至0.1nM的葉酸濃度進(jìn)行葉酸饑餓實驗。在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，分析細(xì)胞生存力以定量存活細(xì)胞的百分比。表1總結(jié)了用上述的CHO-Kl細(xì)胞系所獲得的結(jié)果。
[0077]表1:在不同葉酸濃度下CHO細(xì)胞的存活
[0078]
【權(quán)利要求】
1.一種真核生物表達(dá)載體，其包括編碼功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體的第一多核苷酸和編碼目的產(chǎn)物的第二多核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的真核生物表達(dá)載體,其中所述目的產(chǎn)物選自多肽、RNA和DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的真核生物表達(dá)載體，其中所述目的產(chǎn)物是多肽。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的表達(dá)載體，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸是在分開的轉(zhuǎn)錄啟動子的控制下。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的表達(dá)載體，其中所述轉(zhuǎn)錄啟動子是相同的。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的表達(dá)載體，其中所述轉(zhuǎn)錄啟動子是不同的。
7.根據(jù)權(quán)利要求4至6中任一項的表達(dá)載體,其中控制第一多核苷酸轉(zhuǎn)錄的啟動子是SV40啟動子。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項的表達(dá)載體,其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸是在共同的轉(zhuǎn)錄啟動子的控制下。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的表達(dá)載體，其中所述共同轉(zhuǎn)錄啟動子是SV40啟動子。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9中任一項的表達(dá)載體，其中所述載體包括功能性地位于所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸之間的IRES元件。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的表達(dá)載體，其中所述由第一多核苷酸編碼的功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體選自葉酸化合物受體a (FRa )、葉酸化合物受體β (FR0)及其功能突變體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的表達(dá)載體，其中所述由第一多核苷酸編碼的功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體是人葉酸化合物受體a (hFRa)。
13.細(xì)胞生存力依賴于葉酸化合物攝取的真核細(xì)胞，其中該真核細(xì)胞中已經(jīng)穩(wěn)定地引入了位于表達(dá)載體上且編碼功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體的第一多核苷酸和位于表達(dá)載體上且編碼目的產(chǎn)物的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸位于同一表達(dá)載體上或位于分開的表達(dá)載體上。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的真核細(xì)胞，其中所述細(xì)胞缺乏至少一種內(nèi)源性功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體的完全活性。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的真核細(xì)胞，其中所述編碼功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體的第一多核苷酸和所述編碼目的產(chǎn)物的第二多核苷酸位于同一表達(dá)載體上。
16.根據(jù)權(quán)利要求13至15中任一項的真核細(xì)胞，其中所述表達(dá)載體如權(quán)利要求1至12中任一項所定義。
17.根據(jù)權(quán)利要求13至16中任一項的真核細(xì)胞，其中所述真核細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的真核細(xì)胞，其中所述哺乳動物細(xì)胞是嚙齒類動物細(xì)胞。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的真核細(xì)胞，其中所述嚙齒類動物細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
20.制備根據(jù)權(quán)利要求13至19中任一項的真核細(xì)胞的方法，所述方法包括提供細(xì)胞生存力依賴于葉酸化合物攝取的真核細(xì)胞，和引入位于表達(dá)載體上且編碼功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體的第一多核 苷酸和位于表達(dá)載體上且編碼目的產(chǎn)物的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸位于同一表達(dá)載體上或位于分開的表達(dá)載體上。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法,其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸位于同一表達(dá)載體上。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述表達(dá)載體如權(quán)利要求1至12中任一項所定義。
23.用于選擇真核細(xì)胞的方法，其中所述真核細(xì)胞能夠穩(wěn)定地表達(dá)由已經(jīng)引入到該細(xì)胞中的表達(dá)載體編碼的目的產(chǎn)物，所述方法包括 (i)提供細(xì)胞生存力依賴于葉酸化合物攝取的多個真核細(xì)胞，其中所述細(xì)胞中已經(jīng)引入了位于表達(dá)載體上且編碼功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體的第一多核苷酸和位于表達(dá)載體上且編碼目的產(chǎn)物的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸位于同一表達(dá)載體上或位于分開的表達(dá)載體上， (?)在具有限制性濃度的葉酸化合物的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述多個真核細(xì)胞，由此獲得實現(xiàn)所述目的產(chǎn)物的穩(wěn)定表達(dá)的真核細(xì)胞。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，還包括鑒定和分離實現(xiàn)所述目的產(chǎn)物的穩(wěn)定表達(dá)的真核細(xì)胞。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24的方法，其中所述多個真核細(xì)胞由如權(quán)利要求13至19中任一項所定義的真核細(xì)胞組成。
26.生產(chǎn)目的產(chǎn)物的方法，其包括 (i)實施根據(jù)權(quán)利要求23至25中任一項的選擇方法， (ii)從所述細(xì)胞培養(yǎng)基或從所述細(xì)胞分離所述目的產(chǎn)物。
27.功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體作為選擇標(biāo)記用于選擇真核細(xì)胞的用途，其中所述真核細(xì)胞的細(xì)胞生存力依賴于葉酸化合物攝取且該真核細(xì)胞能穩(wěn)定地表達(dá)目的產(chǎn)物。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的用途，其中所述葉酸化合物受體選自葉酸化合物受體a (FRa )、葉酸化合物受體β (FR0)及其功能突變體。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的用途，其中所述葉酸化合物受體是人葉酸化合物受體a (hFR a )。
【文檔編號】C12Q1/04GK103805633SQ201310751256
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2008年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2007年12月21日
【發(fā)明者】Y·G·阿薩拉弗, T·約斯多克, H-P·科諾普夫 申請人:諾華股份有限公司