一種紅細胞裂解液及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種紅細胞裂解液，所述裂解液包含以下組分：4.5～5.5mmol/L的氯化鈉、0.8～1.2%（v/v）的曲拉通100、300～340mmol/L的葡萄糖和0.008～0.012mol/L的三羥甲基氨基甲烷。使用本發(fā)明中提供的紅細胞裂解液，可有效裂解全血樣本中的紅細胞，分離并富集血液中的白細胞，有利于對白細胞的后續(xù)核酸提取操作，可以獲得全血中白細胞DNA和白細胞內(nèi)病毒的DNA。
【專利說明】一種紅細胞裂解液及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種紅細胞裂解液及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]紅細胞也稱紅血球，在常規(guī)化驗英文?？s寫成RBC，是血液中數(shù)量最多的一種血細胞，正常成人每微升血液中紅細胞數(shù)的平均值，男性約400萬~500萬個，女性約350萬~450萬個。同時紅細胞也是脊椎動物體內(nèi)通過血液運送氧氣的最主要的媒介，另外還具有免疫功能。哺乳動物成熟的紅細胞是無核的，這意味著它們失去了 DNA。但血液紅細胞中含量為男性約120~150g/L和女性約105~135g/L的血紅蛋白對PCR擴增有明顯的抑制作用。故在對血液樣本進行核酸提取時，首先需要去除血液樣本中的紅細胞。
[0003]目前，使用紅細胞裂解液是一種去除紅細胞最簡便易行的方法，即用紅細胞裂解液改變紅細胞的滲透壓，造成紅細胞脹大破裂，而白細胞因其細胞膜的離子轉(zhuǎn)運通道不同而不受影響，從而達到既不損傷白細胞又能充分的去除紅細胞，并能分離富集血液中的白細胞的作用。經(jīng)紅細胞裂解液裂解得到的白細胞中不含紅細胞，可進一步用于核酸的分離和提取等。
[0004]國內(nèi)已出現(xiàn)多種紅細胞裂解液，可以應(yīng)用于全血的核酸提取。例如，CNl 635134A公開的紅細胞裂解液由下列物質(zhì)組成:10mmol/L Tr1-HCl, 5mmol/L MgCl2, lOmmol/LNaCl和超純水I升。CN102676498A公開的紅細胞裂解液含有碳酸氫鉀12mmol/L，氯化銨155mmol/L，乙二胺四乙酸(EDT A)0.15mmol/L。CN102747035A公開的紅細胞裂解液由7.47g/L的氯化銨+2.6g/L的三羥甲基氨基甲烷組成。然而，現(xiàn)有的紅細胞裂解液從全血中分離純化白細胞的方法存在很多缺點，例如:1)樣本處理耗時長，紅細胞裂解效果不佳，裂解不完全；
2)試劑體系不穩(wěn)定，容易變質(zhì)失效；3)處理步驟多，需要多次開蓋換管、離心；4)白細胞獲得率低，純度低；上述缺點的存在勢必會因紅細胞裂解液的選擇而導(dǎo)致對后續(xù)的核酸提取效果造成影響。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有紅細胞裂解液的缺陷，提供一種操作快速簡單、提取效率高、使用安全、制造成本低的人類血液白細胞分離試劑(紅細胞裂解液)及其制備方法，應(yīng)用該試劑分離得到的白細胞可以進行后續(xù)的核酸提取。
[0006]因此，本發(fā)明提供一種紅細胞裂解液，所述裂解液包含以下組分:4.5~5.5mmol/L的氯化鈉、0.8~1.2% (v/v)的曲拉通100、300~340mmol/L的葡萄糖和0.008~
0.012mol/L的三羥甲基氨基甲烷。
[0007]優(yōu)選的，所述氯化鈉的濃度為5mmol/L，所述曲拉通100的濃度為1.0%(ν/ν)，所述葡萄糖的濃度為320mmol/L，所述三羥甲基氨基甲烷的濃度為0.01Omol/L，余量為無菌水。
[0008]本發(fā)明還提供一種如上所述紅細胞裂解液的制備方法，包括先在無菌水中加入上述四種組分，然后加無菌水定容至所需體積，充分混勻溶解；再使用氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)所得溶液的PH值至7.8~8.6，優(yōu)選8.0~8.4，更優(yōu)選8.2 ;最后滅菌2~30分鐘，優(yōu)選高壓滅菌5~15分鐘，即得到所述紅細胞裂解液。
[0009]本發(fā)明還提供一種如上所述的紅細胞裂解液或如上所述方法制備得到的紅細胞裂解液在裂解全血樣本中的紅細胞并分離得到白細胞中的應(yīng)用。
[0010]優(yōu)選地，所述應(yīng)用包括以下步驟:1)向全血中加入紅細胞裂解液，充分震蕩混勻，得到紅色混合物；2)對上述混合物進行離心分離，去上清，留下的白色沉淀物即為白細胞。優(yōu)選步驟I)中全血與紅細胞裂解液的體積比為1:1~5。優(yōu)選步驟2)中離心分離的轉(zhuǎn)速為10000~13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心分離的時間為I~3分鐘。
[0011]使用本發(fā)明中提供的紅細胞裂解液，可有效裂解全血樣本中的紅細胞，分離并富集血液中的白細胞，有利于對白細胞的后續(xù)核酸提取操作，可以獲得全血中白細胞DNA和白細胞內(nèi)病毒的DNA。本發(fā)明裂解紅細胞的操作簡單快速，且裂解完全；獲得的白細胞純度高，利于核酸提取和PCR擴增等下游實驗；另外，本發(fā)明提供的紅細胞裂解液制造成本低廉，無需使用特殊物料或儀器，僅需離心機和移液器，且使用安全。
【具體實施方式】
[0012]實施例1 [0013]1、紅細胞裂解液及其配制方法:
[0014]稱取氯化鈉0.1461g，加入體積為5ml的曲拉通溶液，加入葡萄糖28.8256g，加入三羥甲基氨基甲烷0.6075g，加入無菌水定容至500ml，充分混勻溶解，使用氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH值至8.2。高壓滅菌10分鐘。
[0015]2、紅細胞裂解液的應(yīng)用:
[0016]紅細胞裂解液的應(yīng)用對象為100例全血樣本。應(yīng)用的具體操作步驟為:向每例200微升全血中加入800微升紅細胞裂解液，充分震蕩混勻10秒，得到紅色透明清亮混合物；對上述混合物進行離心分離，離心轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心分離時間為I分鐘，去上清，留白色沉淀物。所得白色沉淀物即為白細胞，可用于核酸提取。
[0017]3、對紅細胞裂解液應(yīng)用的效果檢測和評價:
[0018]使用β -Actin管家基因檢測試劑對上述白細胞進行核酸提取和檢測。結(jié)果是，采用本發(fā)明中的紅細胞裂解液提取100例全血樣本DNA后檢測其中的β-Actin管家基因，100例均有擴增曲線，說明本發(fā)明提供的紅細胞裂解液能有效富集全血樣本中的有核白細胞。
[0019]實施例2
[0020]1、本實施例中的紅細胞裂解液及其配制方法同實施例1。
[0021]2、紅細胞裂解液的應(yīng)用:
[0022]紅細胞裂解液的應(yīng)用對象為含EB病毒DNA濃度為I X IO4IU的全血樣本。應(yīng)用的具體操作步驟為:向200微升全血中加入800微升紅細胞裂解液，充分震蕩混勻10秒，得到紅色透明清亮混合物；對上述混合物進行離心分離，離心轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心分離時間為I分鐘，去上清，留白色沉淀物。所得白色沉淀物即為白細胞，可用于核酸提取。
[0023]3、對紅細胞裂解液應(yīng)用的效果檢測和評價:
[0024]使用商售的EB病毒核酸定量檢測試劑盒對上述白細胞進行核酸提取和檢測。結(jié)果是，采用本發(fā)明中的紅細胞裂解液6次重復(fù)提取全血樣本DNA后檢測其中的濃度為IXlO4IU的EB病毒DNA，從擴增曲線看，基線平整，指數(shù)區(qū)明顯，同一樣本6次檢測的Ct值的變異系數(shù)〈2%，濃度變異系數(shù)〈50%，重復(fù)性好。說明本發(fā)明提供的紅細胞裂解液能夠有效收集到白細胞中的病毒DNA。
[0025]對比例
[0026]使用CN102747036A中公開的紅細胞裂解液處理全血樣本。
[0027]1、紅細胞裂解液及其配制方法:
[0028]原液一號:10g/L的葡萄糖、0.6g/L 的磷酸二氫鈉、3.58g/L 的 Na2HPO4.7H20、0.1g/L酚紅溶液；原液二號:1.86g/L的CaCl2.H20,4.0g/L氯化鉀、80g/L氯化鈉、1.04g/L氯化鎂和2.0g/LMgS04.7H20。紅細胞裂解液的應(yīng)用液1# =IOml原液一號、IOml原液二號，加雙蒸水定容至100ml。應(yīng)用液2#:20ml原液一號、20ml原液二號，加雙蒸水定容至100ml。應(yīng)用液3#:lml原液一號、Iml原液二號，加雙蒸水定容至100ml。
[0029]2、紅細胞裂解液的應(yīng)用:
[0030]紅細胞裂解液的應(yīng)用對象為與實施例1中相同的100例全血樣本。應(yīng)用的具體操作步驟為:向每例100微升全血樣本中加入2ml應(yīng)用液3#’混勻15~20秒；加入2ml應(yīng)用液2#，混勻15~20秒；加4ml應(yīng)用液1#，混勻15~20秒；300 X g離心2分鐘，棄上清，收集沉淀。所得沉淀物用于核酸提取。
[0031]3、對紅細胞裂解液應(yīng)用的效果檢測和評價:
[0032]使用β -Actin管家基因檢測試劑對上述沉淀物進行核酸提取和檢測。結(jié)果是，采用對比例中的紅細胞裂解液提取100例全血樣本DNA后檢測其中的β-Actin管家基因，100例均有擴增曲線。
[0033]但對比例與實施例1中的檢測數(shù)據(jù)對比時發(fā)現(xiàn)，對于每一例不同的全血樣本，對比例中檢測得到β -Actin管家基因的目標曲線Ct值較實施例1中的檢測Ct值均靠后，對比例中的Ct值數(shù)據(jù)一般要比實施例1中的Ct值數(shù)據(jù)大1-4，且對比例較實施例1樣本處理時間長了近I個小時。說明本發(fā)明提供的紅細胞裂解液富集全血樣本中的有核白細胞的能力優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)中公開的紅細胞裂解液。另外，本發(fā)明操作簡單快速，大大節(jié)約樣本處理時間，且本發(fā)明所用試劑的配制更簡單。
【權(quán)利要求】
1.一種紅細胞裂解液，其特征在于，所述裂解液包含以下組分:4.5~5.5mmol/L的氯化鈉、0.8 ~1.2% (v/v)的曲拉通 100,300 ~340mmol/L 的葡萄糖和 0.008 ~0.012mol/L的三羥甲基氨基甲烷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅細胞裂解液，其特征在于，所述氯化鈉的濃度為5mmol/L，所述曲拉通100的濃度為1.0%(ν/ν)，所述葡萄糖的濃度為320mmol/L，所述三羥甲基氨基甲烷的濃度為0.01mol/L，余量為無菌水。
3.—種如權(quán)利要求1或2所述紅細胞裂解液的制備方法，其特征在于，在無菌水中加入上述四種組分，然后加無菌水定容至所需體積，充分混勻溶解；再使用氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)所得溶液的pH值至7.8~8.6，優(yōu)選8.0~8.4，更優(yōu)選8.2 ;最后滅菌2~30分鐘，優(yōu)選高壓滅菌5~15分鐘，即得到所述紅細胞裂解液。
4.如權(quán)利要求1或2所述的紅細胞裂解液或如權(quán)利要求3所述方法制備得到的紅細胞裂解液在裂解全血樣本中的紅細胞并分離得到白細胞中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括以下步驟: 1)向全血中加入紅細胞裂解液，充分震蕩混勻，得到紅色混合物； 2)對上述混合物進行離心分離，去上清，留下的白色沉淀物即為白細胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟I)中全血與紅細胞裂解液的體積比為1:1~5。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟2)中離心分離的轉(zhuǎn)速為10000~13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心分離的時間`為I~3分鐘。
【文檔編號】C12N15/10GK103789298SQ201310746148
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
【發(fā)明者】戴立忠, 唐瑤, 吳康 申請人:湖南圣湘生物科技有限公司