一株具有降解肌酐和尿素能力的乳酸菌及其篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一株篩選于內(nèi)蒙古地區(qū)酸奶中的乳酸菌菌株，該菌株具有較高的肌酐和尿素降解能力，鑒定為保加利亞乳桿菌（Lactobacillus?delbrueckii?subsp.bulgaricus）。本發(fā)明還公開了降解肌酐菌株的篩選方法。將該菌株用于保健食品領(lǐng)域，具有輔助治療腎衰竭、尿毒癥、提高機體免疫力等功效。
【專利說明】一株具有降解肌酐和尿素能力的乳酸菌及其篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株能夠降解肌酐和尿素能力的乳酸菌，并涉及該菌株的篩選方法。本發(fā)明通過對內(nèi)蒙古地區(qū)酸牛奶中的乳酸菌進行富集培養(yǎng)和分離純化，隨后對乳酸菌的馴化和富篩獲得該菌株。
【背景技術(shù)】
[0002]慢性腎衰竭，又稱慢性腎功能不全、尿毒癥，是各種原發(fā)性腎病或繼發(fā)性于其他疾病引起的腎臟進行性損傷和腎功能的逐漸惡化。臨床表現(xiàn)主要為代謝產(chǎn)物潴留、水和電解質(zhì)紊亂及酸堿平衡失調(diào)、腎功能嚴重損害。到目前為止，慢性腎衰竭還缺乏有效的治療手段，主要依靠血液透析、腎移植，所需費用昂貴，透析治療每年所需的費用巨大，而腎移植腎源供求問題嚴重，所需費用更加昂貴。這些治療方法給社會和家庭帶來巨大的經(jīng)濟壓力，也使病人承受著極大的痛苦。除了透析和腎移植的治療方法，目前已有谷氨酸棒狀桿菌經(jīng)體外誘導產(chǎn)生脲酶和肌酐酶，將其提取分離后制成微囊口服在腸道分解肌酐、尿酸等毒素，但此法因?qū)δ蚨舅責o作用而未在臨床廣泛使用。近年來，消化道細菌治療法成為了繼消化道酶療法的清除腸道毒素的小療法，其治療方法為:使用自然菌種，如低毒土壤菌，體外誘導產(chǎn)生尿素酶，口服進入腸道，分解腸道尿毒素；或?qū)⒏弋a(chǎn)酶基因?qū)肓硪环N細菌中，構(gòu)建工程菌，將該工程菌攝入腸道，降解尿毒素。但這類方法攝入的菌存在安全隱患，可能導致腸道菌群失調(diào)，并誘發(fā)感染。
[0003]益生菌是一種對宿主有益的活性微生物，可以定植于人體腸道內(nèi)，改善腸道菌群平衡，控制腸道感染。激活腸淋巴細胞能啟動全身免疫系統(tǒng)提高免疫力，還有降低患者血壓、血脂等作用 ο Suzuki (K.Suzuki, Y.Benno, T.Mitsuoka, S.Takebe, K.Kobashi, J.Hase.Urease-Producing Species of Intestinal Anaerobes and Their Activities.[J]Applied and Environmental Micro`biology, Mar.1979, 379 ~382.)從慢性腎衰患者的幾便中分離至Ij一株產(chǎn)服酶的雙歧桿菌，CHOW (Chow, Liu ZC, Prakash S，et al.Free andmicroencapsulated Lactobacillus and effects of metabolic induction on urearemoval.Artif Cells Blood Substit Tmmobi I Biotechnol2003Nov; 31 (4): 425-34.)等發(fā)現(xiàn)德式乳桿菌在高濃度尿素培養(yǎng)基中多次傳代后，表現(xiàn)出對尿素的降解能力。研究發(fā)現(xiàn)，口服嗜酸乳桿菌可以降低透析病人尿毒癥毒素水平。因此開發(fā)具有將肌酐和尿素功能的活性益生菌對于慢性腎衰竭患者的治療具有重大意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的是提供一株具有降解肌酐和尿素能力的乳酸菌及其篩選方法。
[0005]本發(fā)明所提供的菌株為乳桿菌屬，其保藏編號為CGMCC N0.7983，經(jīng)16S rDNA核苷酸序列結(jié)果以及生理生化結(jié)果分析，確定為保加利亞乳桿菌(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)。
[0006]本發(fā)明還提供一種篩選具有降解肌酐和尿素能力的乳桿菌的篩選方法。首先是乳酸菌的富集培養(yǎng)，選擇內(nèi)蒙古地區(qū)富含乳酸菌的酸牛奶，加入到MRS液體培養(yǎng)基進行富集培養(yǎng)，40°C靜置培養(yǎng)24h，按5%的接種量加入含0.1%肌酐和0.05%尿素的MRS培養(yǎng)基中，富集培養(yǎng)24h ;隨后是乳酸菌的初步分離純化，取上述富集培養(yǎng)液進行梯度稀釋，取10_5、10_6、10_7的稀釋液，涂布于溴甲酚紫脫脂乳平板上，于40°C厭氧培養(yǎng)48h，挑取肉眼可見、產(chǎn)酸(培養(yǎng)基顏色變黃)的菌落分離純化，并編號保存；隨后是乳酸菌的馴化，將保存好的乳酸菌接種于含0.1%肌酐和0.05%尿素的MRS培養(yǎng)基中，40°C厭氧培養(yǎng)48h，取上述富集培養(yǎng)液進行梯度稀釋，取10' 10' 10_7的稀釋液，涂布于含0.1%肌酐0.05%尿素的MRS培養(yǎng)基中，于40°C厭氧培養(yǎng)48h，挑取生長狀況良好的菌株分離純化，并編號保存。將保存好的乳酸菌連續(xù)馴化20次，將最終篩選得到可以在0.1%肌酐/0.05%尿素的MRS培養(yǎng)基中穩(wěn)定存活的菌株，將菌株編號保藏；最后是乳酸菌的富篩，將保存好的菌株按前述方法活化并涂布于含0.1%肌酐/0.05%尿素的MRS培養(yǎng)基中，于40°C厭氧培養(yǎng)48h，挑取生長狀況良好的菌株接種于含0.1%肌酐0.05%尿素的MRS培養(yǎng)基中,堿性苦味酸法測定肌酐的降解率,二乙酰一肟顯色法測定尿素氮降解率，選取降解率高的一株菌株編號并保藏，其肌酐降解率達25%，尿素降解率達30%。
[0007]同時，對篩選得到的降解肌酐乳酸菌進行了生理生化鑒定和16S rDNA序列分析鑒定,其16S rDNA序列如序列表SEQ ID No:l所示。
[0008]根據(jù)該菌株16S rDNA序列的測序結(jié)果，其與已報道的德氏乳桿菌，保加利亞亞種(GenBank.N0.CP000156)序列同源性達98%,根據(jù)上述結(jié)果,確定該菌株屬于乳桿菌屬的德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus),該菌株具有降低肌酐和尿素的能力，于2013年8月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物生物中心，保藏編號為CGMCC N0.7983，保藏單位地址位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。
[0009]本發(fā)明的另一個目的是提供所述的菌株在制備保健食品或功能性食品中的應用。
[0010]本發(fā)明的另一個目的是提供所述的菌株在制備用于治療慢性腎衰竭的藥物中的應用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1基于保加利亞乳桿菌CGMCC N0.7983菌株的16S rDNA序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0012]圖2保加利亞乳桿菌CGMCC N0.7983菌株的菌落形態(tài)(圖A)和菌體形態(tài)(圖B)【具體實施方式】
[0013]實施例1.降解肌酐和尿素的乳酸菌的篩選
[0014]⑴乳酸菌的富集培養(yǎng)。選擇IOml內(nèi)蒙古地區(qū)富含乳酸菌的酸牛奶，加入到100mlMRS液體培養(yǎng)基進行富集培養(yǎng)，40°C靜置培養(yǎng)24h，取IOml加入200ml含0.1%肌酐和
0.05%尿素的MRS培養(yǎng)基中，40°C靜置培養(yǎng)24h，得富集培養(yǎng)液。
[0015]所述的MRS培養(yǎng)基:葡萄糖2%、蛋白胨1%、酵母粉1%、牛肉膏1%、乙酸鈉0.5%、檸檬酸三銨 0.2%、吐溫-800.1%, MgSO40.03%、MnSO40.002%、K2HPO40.2%, ρΗ6.8。
[0016]⑵乳酸菌的初步分離純化。取Iml上述富集培養(yǎng)液用PBS緩沖液進行梯度稀釋，取ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—7的稀釋液，涂布于溴甲酚紫脫脂乳平板上，于40°C厭氧培養(yǎng)48h，挑取肉眼可見、產(chǎn)酸(培養(yǎng)基顏色變黃)的菌落分離純化，編號接種于0.1%肌酐和0.05%尿素MRS固體培養(yǎng)基斜面保存。
[0017]所述的PBS 緩沖液:Na2HP040.12%,NaH2PO4.2Η200.03%、NaC10.9%、吐溫-800.05%。
[0018]所述的溴甲酚紫脫脂乳培養(yǎng)基平板:溴甲酚紫0.01%、脫脂乳10%。
[0019]0.1%肌酐和0.05%尿素MRS固體培養(yǎng)基平板:葡萄糖2%、蛋白胨1%、酵母粉1%、牛肉膏 1%、乙酸鈉 0.5%、檸檬酸三銨 0.2%、吐溫-800.1%、MgSO40.03%、MnSO40.002%、K2HPO40.2%、肌酐 0.1%、尿素 0.05%, ρΗ6.8。
[0020]⑶乳酸菌的馴化。取保存好的乳酸菌斜面，用接種環(huán)挑取I環(huán)，接種于50ml含0.1%肌酐和0.05%尿素的MRS培養(yǎng)基中，40°C厭氧培養(yǎng)24h，取Iml上述富集培養(yǎng)液進行梯度稀釋，取10' 10' 10〃的稀釋液，涂布于0.1%肌酐和0.05%尿素MRS固體培養(yǎng)基中，于40°C厭氧培養(yǎng)48h，挑取生長狀況良好的單克隆菌株接種于0.1%肌酐和0.05%尿素MRS固體培養(yǎng)基斜面，編號保存。將保存好的乳酸菌重復步驟3連續(xù)馴化20次，將最終篩選得到可以在
0.1%肌酐和0.05%尿素的MRS培養(yǎng)基中穩(wěn)定存活的菌株，將菌株接種于0.1%肌酐和0.05%尿素MRS固體斜面編號保藏。
[0021 ] ⑷乳酸菌的富篩，取保存好的乳酸菌斜面，用接種環(huán)挑取I環(huán)，接種于50ml含0.1%肌酐和0.05%尿素的MRS培養(yǎng)基中，40°C厭氧培養(yǎng)24h，取Iml上述富集培養(yǎng)液進行梯度稀釋，取10' 10' 10〃的稀釋液，涂布于0.1%肌酐和0.05%尿素MRS固體培養(yǎng)基中，于40°C厭氧培養(yǎng)48h，觀察生長狀況良好的菌株并編號，用接種環(huán)挑取編號菌株接種于50ml含
0.1%肌酐和0.05%尿素的MRS培養(yǎng)基中并編號，同時接種于0.1%肌酐和0.05%尿素MRS固體培養(yǎng)基斜面編號并保存，堿性苦味酸法測定肌酐的降解率，堿性苦味酸法使用德國羅氏診斷有限公司生產(chǎn)的肌酐檢測試劑盒(苦味酸法)，按試劑盒說明書所示方法進行操作。采用二乙酰一肟顯色法測定尿素氮降解率，具體方法如下:酸性試劑5ml加入0.5ml 二乙酰一肟為工作液，工作液加入0.02ml樣品測定樣品濃度，加入0.02ml水為空白，加入0.02ml尿素標準液為標準樣?；靹蚝?，沸水浴15min,取出放置冷水中冷卻5min,在540nm下測定吸光度。計算方法:尿素濃度=A|^/AX 5
[0022]檢測結(jié)果如表1所示:
[0023]表1.肌酐和尿素測定結(jié)果
[0024]
【權(quán)利要求】
1.一株嗜酸乳桿菌菌株,其特征在于:菌株屬于乳桿菌屬的德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus),該菌株具有降低肌酐的能力，于 2013年8月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物生物中心，保藏編號為CGMCCN0.7983。
2.權(quán)利要求1中所述的菌株在制備保健食品或功能性食品中的應用。
3.權(quán)利要求1中所述的菌株在制備用于治療慢性腎衰竭的藥物中的應用。
4.一種降解肌酐菌株的篩選方法，其特征在于:使用內(nèi)蒙古地區(qū)新鮮發(fā)酵的酸牛奶接種于含0.1%肌酐和0.05%尿素的MRS培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)，再將富集液稀釋涂平板，篩選乳酸菌，將篩選得到的單克隆菌株接種于肌酐/尿素MRS培養(yǎng)基中馴化20代，將馴化好的菌株富集再涂布于肌酐/尿素MRS平板上挑取單克隆菌株接入含0.1%肌酐和0.05%尿素的MRS液體培養(yǎng)基中，堿性苦味酸法測定肌酐的降解率，二乙酰一肟顯色法測定尿素氮降解率，選取降解率高的菌 株編號并保藏。
【文檔編號】C12R1/225GK103667124SQ201310625369
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】關(guān)海濱, 包小妹, 董至恒, 喬俊纏, 張英 申請人:內(nèi)蒙古醫(yī)科大學