一種用于膀胱癌血清miRNA檢測(cè)的內(nèi)參及其檢測(cè)引物與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于膀胱癌血清miRNA檢測(cè)的內(nèi)參，該內(nèi)參為單獨(dú)的hsa-miR-193a-5p，或：hsa-miR-193a-5p與hsa-miR-16-5p。本發(fā)明還公開了檢測(cè)該內(nèi)參的引物，包括檢測(cè)hsa-miR-193a-5p（如SEQ?ID?NO：1～3所示）或/和hsa-miR-16-5p的引物（如SEQ?ID?NO：4～6所示），該內(nèi)參及其引物可用于制備檢測(cè)膀胱癌血清內(nèi)參的試劑盒，用于膀胱癌血清miRNA內(nèi)參的檢測(cè)。
【專利說明】—種用于膀胱癌血清m i RNA檢測(cè)的內(nèi)參及其檢測(cè)引物與應(yīng)
用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于膀胱癌血清miRNA檢測(cè)的內(nèi)參及其檢測(cè)引物與應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]膀胱癌是一類多發(fā)的泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤，其在我國(guó)男性中的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢(shì)。在膀胱癌初診患者中，約30%為易發(fā)生轉(zhuǎn)移的侵襲性膀胱癌(MIBC)，而非侵襲性膀胱癌(匪IBC)患者中仍有30%會(huì)復(fù)發(fā)為侵襲性膀胱癌。早期診斷和治療可提高膀胱癌病人的治療效果并改善預(yù)后，因此尋找具有較高特異性和敏感性的實(shí)用診斷方法是十分必要的。目前，臨床中用于診斷膀胱癌的方法主要包括膀胱鏡、尿脫落細(xì)胞學(xué)以及影像學(xué)方法等，其中，膀胱鏡為診斷膀胱癌的常用方法，但其侵入性易導(dǎo)致膀胱及尿道損傷或感染等；尿脫落細(xì)胞學(xué)特異性高但其敏感性低且易受主觀因素影響；影像學(xué)方法主要包括CT及超聲檢查，常用于膀胱癌診斷及術(shù)前分期，但其對(duì)膀胱內(nèi)較小病變不易發(fā)現(xiàn)，難以用于早期診斷。因此，尋找特異性和敏感性高的早期診斷標(biāo)志物，建立經(jīng)濟(jì)實(shí)用、安全可靠的血清學(xué)膀胱癌診斷方法成為目前的研究熱點(diǎn)。
[0003]MicroRNA (miRNA)是一類內(nèi)源性的單鏈非編碼小RNA，由18~25個(gè)堿基組成，其通過與目的mRNA分子3’端非翻譯區(qū)結(jié)合進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，由此影響細(xì)胞的增殖、分化及凋亡過程。有研究表明miRNA表達(dá)譜與腫瘤的起源和分期(stage)密切相關(guān)，提示其可作為腫瘤診斷標(biāo)志物。2008年，中美科學(xué)家同步發(fā)現(xiàn)血液循環(huán)中穩(wěn)定存在豐富的miRNA，且其性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)RNA酶、酸堿環(huán)境、長(zhǎng)時(shí)間室溫放置(> 24小時(shí))及反復(fù)凍融均不敏感。此外，循環(huán)miRNA還有其作為腫瘤標(biāo)志物的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，其檢測(cè)可精確定量且無(wú)需制備抗體，性價(jià)比高。不同的腫瘤具有各自特異的循環(huán)miRNA表達(dá)譜，而且其表達(dá)譜通常與腫瘤分期及分級(jí)密切相關(guān)。因此，檢測(cè)循環(huán)miRNA可為腫瘤的無(wú)創(chuàng)性診斷與監(jiān)測(cè)開辟新的途徑。
[0004]目前，檢測(cè)miRNA的技術(shù)已相當(dāng)成熟，主要包括高通量測(cè)序技術(shù)、基因芯片技術(shù)以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)技術(shù)，其中前兩者屬于高通量方法，主要用于miRNA篩選， 對(duì)于所篩選出的miRNA進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定則需要采用qRT-PCR技術(shù)。為得到準(zhǔn)確的qRT-PCR結(jié)果，還需要采取標(biāo)準(zhǔn)化方法以消除實(shí)驗(yàn)誤差并使不同實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果具有可比性。常用的標(biāo)準(zhǔn)化方法主要有三種:一是在提取RNA時(shí)取等量的血清，二是在提取RNA之前向血清加入人工合成miRNA(如線蟲-39，cel-miR-39)，三是采用一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性分子作為檢測(cè)血清 miRNA表達(dá)的內(nèi)參。然而，取等量的血清很難保證在逆轉(zhuǎn)錄中加入的miRNA是等量的，而加入人工合成miRNA僅能控制在RNA提取以及cDNA合成過程中的實(shí)驗(yàn)誤差，由此可以看出這兩種方法都不能有效控制樣本本身的生物學(xué)差異。與前兩者不同的是，采用一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性分子作為檢測(cè)血清miRNA表達(dá)的內(nèi)參不僅可以控制實(shí)驗(yàn)操作中的誤差，還可以控制樣本本身的生物學(xué)差異，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，因而成為業(yè)界所公認(rèn)的最佳標(biāo)準(zhǔn)化方法。[0005]目前，在膀胱癌血清miRNA研究中，尚缺乏公認(rèn)的較為穩(wěn)定的內(nèi)參分子，以往的研究者主要根據(jù)自身經(jīng)驗(yàn)或者參考文獻(xiàn)來選擇內(nèi)參分子，在不同的實(shí)驗(yàn)中選取的內(nèi)參通常并不一致，因而制約了研究成果的轉(zhuǎn)化和不同實(shí)驗(yàn)室之間研究成果的比較。因此，如果能夠篩選出適用于膀胱癌血清miRNA檢測(cè)的內(nèi)參并研發(fā)出相應(yīng)的試劑盒使之能夠應(yīng)用于科研領(lǐng)域，將極大地促進(jìn)膀胱癌血清miRNA研究及科研成果的轉(zhuǎn)化，對(duì)于膀胱癌的診療必將起到巨大的推動(dòng)作用。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，為解決現(xiàn)有技術(shù)中尚無(wú)一種穩(wěn)定的膀胱癌血清miRNA內(nèi)參分子的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種用于膀胱癌血清miRNA檢測(cè)的內(nèi)參，并提供了檢測(cè)該內(nèi)參的引物、專用試劑盒、檢測(cè)方法，以及在診斷、檢測(cè)膀胱癌中的應(yīng)用，為膀胱癌血清miRNA 研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提供了實(shí)用可靠的標(biāo)準(zhǔn)化依據(jù)。 [0007]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0008]一種用于膀胱癌血清miRNA檢測(cè)的內(nèi)參，該內(nèi)參為單獨(dú)的hsa-miR-193a-5p，或: hsa-miR-193a_5p 與 hsa-miR-16_5p ；
[0009]所述hsa-miR-193a-5p 的序列為:5’ -UGGGUCUUUGCGGGCGAGAUGA-3’，如 SEQ ID NO:7所示；
[0010]所述hsa-miR-16-5p 的序列為:5’ -UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3’，如 SEQ ID NO: 8所示。
[0011]檢測(cè)上述用于膀胱癌血清miRNA檢測(cè)的內(nèi)參的特異性引物，包括檢測(cè) hsa-miR-193a_5p 或 / 和 hsa-miR-16_5p 的引物，具體如下:
[0012](I)檢測(cè)hsa-miR-193a_5p的引物，包括逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQ ID NO:1所示，檢測(cè)引物的序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示:
[0013]hsa-miR-193a_5p-RT:
[0014]5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCATCT-3’ ；
[0015]hsa-miR-193a-5p-F:5’ -GCTGGGTCTTTGCGGGCG-3’ ；
[0016]hsa-miR-193a-5p-R:5，-GTGCAGGGTCCGAGGT-3J ；
[0017](2)檢測(cè)hsa-miR-16_5p的引物，包括逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如SEQ ID NO:4所示，檢測(cè)引物的序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示:
[0018]hsa-miR-16_5p-RT:
[0019]5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3’ ；
[0020]hsa-miR-16-5p-F:5，-GCTAGCAGCACGTAAATA-3，；
[0021]hsa-miR-16-5p-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3?。
[0022]上述用于膀胱癌血清miRNA檢測(cè)的內(nèi)參在制備診斷膀胱癌的試劑盒中的應(yīng)用。
[0023]上述檢測(cè)用于膀胱癌血清miRNA檢測(cè)的內(nèi)參的引物在制備診斷膀胱癌的試劑盒中的應(yīng)用。
[0024]一種檢測(cè)膀胱癌血清miRNA內(nèi)參的試劑盒，該試劑盒含有用于檢測(cè) hsa-miR-193a-5p的引物(如SEQ ID NO:1~3所示)，或者含有用于檢測(cè)hsa-miR-193a_5p 與 hsa-miR-16-5p 的引物(如 SEQ ID NO:1 ~6 所示)。[0025]所述檢測(cè)膀胱癌血清miRNA內(nèi)參的試劑盒，還可以包含用于miRNA提取及qRT-PCR 反應(yīng)所需的RNA分離液、PCR反應(yīng)液。
[0026]進(jìn)一步地，所述RNA分離液由吐溫20、三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白和水組成，各組分的濃度如下:吐溫20:2.5% (體積百分?jǐn)?shù))，三羥甲基氨基甲烷: 50mmol/L,乙二胺四乙酸:lmmol/L,牛血清白蛋白:1% (質(zhì)量百分?jǐn)?shù)),余量為水。
[0027]進(jìn)一步地，所述PCR反應(yīng)液由IXSyberGreen I熒光染料、DNA聚合酶、dNTPs、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、氯化鉀、氯化鎂和水組成，其中，各物質(zhì)的濃度如下:DNA聚合酶: 100U/mL ；dNTPs:0.2mM ;氯化鎂:6mM ;三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽:16.5mM ;氯化鉀:89.3mM。
[0028]利用上述檢測(cè)膀胱癌血清miRNA內(nèi)參的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的方法，包括以下步驟:
[0029](I)分離得到樣本血清，與等體積的RNA分離液混合，1500g離心10分鐘，之后 15000g離心15分鐘,分離上清；
[0030](2)qRT-PCR反應(yīng):將上述分離的上清液進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，取cDNA為模板，加入引物和PCR反應(yīng)液，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，檢測(cè)樣本閾值Ct (Test sample)；
[0031](3)結(jié)果判斷:根據(jù)膀胱癌血清中miRNA內(nèi)參hsa-miR-193a_5p及hsa-miR-16_5p 的樣本閾值Ct _校正膀胱癌血清中目的miRNA樣本閾值Ct 以判斷目的miRNA表達(dá)水平是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0032]本發(fā)明可用于檢測(cè)膀胱癌血清miRNA內(nèi)參hsa-miR-193a_5p及hsa-miR-16_5p,并可檢測(cè)膀胱癌血清目的miRNA分子，其檢測(cè)效能穩(wěn)定可靠，可用于輔助膀胱癌血清miRNA的研究，以校正膀胱癌血清miRNA標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果，具有準(zhǔn)確、可靠的特點(diǎn)，擁有廣泛的應(yīng)用前景。
[0033]本發(fā)明的用于膀胱癌血清miRNA檢測(cè)的內(nèi)參，優(yōu)點(diǎn)如下:
[0034](I)膀胱癌血清內(nèi)參miRNA檢測(cè)試劑盒可用于檢測(cè)不同受試者血清中的內(nèi)參 miRNA，進(jìn)而確定不同受試者血清中的內(nèi)參miRNA基線水平，以消除由于個(gè)體生物學(xué)差異及實(shí)驗(yàn)操作所導(dǎo)致的miRNA表達(dá)水平差異，使得真正與膀胱癌相關(guān)的miRNA表達(dá)水平差異得到凸顯。
[0035](2)本發(fā)明采用了嚴(yán)密的設(shè)計(jì)和評(píng)價(jià)體系，首先通過Solexa測(cè)序得到血清miRNA 表達(dá)譜，從中挑選出表達(dá)穩(wěn)定的miRNA，然后經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)和軟件計(jì)算得到最穩(wěn)定的候選內(nèi)參，并再次進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。通過應(yīng)用上述研究方法，保證了膀胱癌血清miRNA內(nèi)參檢測(cè)試劑盒研發(fā)的嚴(yán)謹(jǐn)性和可靠性。
[0036]本發(fā)明通過篩選血清中穩(wěn)定表達(dá)的miRNA，尋找并驗(yàn)證了可用作膀胱癌血清 miRNA研究的內(nèi)參。通過膀胱癌血清miRNA內(nèi)參檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，可促進(jìn)膀胱癌血清 miRNA研究的成果轉(zhuǎn)化及不同實(shí)驗(yàn)室之間學(xué)術(shù)的交流，為臨床醫(yī)師迅速診斷病情，準(zhǔn)確評(píng)估治療效果和預(yù)后奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也推動(dòng)了小分子靶向藥物治療的研發(fā)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0037]圖1候選內(nèi)參mi RNA在對(duì)照組(Control )、非侵襲性膀胱癌組(匪IBC)和侵襲性膀胱癌組(MIBC)血清中的表達(dá)水平比較。
[0038]圖2hsa-miR-193a_5p、hsa-miR-16_5p 及二者組合在對(duì)照組(Control )、非侵襲性膀胱癌組(匪IBC)和侵襲性膀胱癌組(MIBC)血清中的表達(dá)水平比較。[0039]圖3 利用 hsa-miR-193a_5p 及 hsa-miR-16_5p 校正后 hsa-miR-148b_3p 在膀胱;癌組(BC)及對(duì)照組(Controls)中的表達(dá)水平比較。
【具體實(shí)施方式】
[0040]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。
[0041]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)研究包括以下步驟:(1)以標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)采集血液標(biāo)本并分離血清。(2)血清miRNA表達(dá)譜分析:選擇侵襲性膀胱癌、非侵襲性膀胱癌病人和對(duì)照者(Control)血清，分別混合后檢測(cè)各組血清miRNA表達(dá)譜及含量，篩選出穩(wěn)定表達(dá)的候選內(nèi)參miRNA用以進(jìn)一步驗(yàn)證。(3)對(duì)候選內(nèi)參分子在新的侵襲性膀胱癌組、非侵襲性膀胱癌組及對(duì)照組中進(jìn)行定量檢測(cè)，排除部分不符合要求的分子，對(duì)剩余分子采用軟件分析，以確定各候選miRNA的穩(wěn)定性。(4)血清miRNA內(nèi)參檢測(cè)試劑盒的研發(fā):根據(jù)所選定的miRNA,研發(fā)內(nèi)參檢測(cè)試劑盒，以推動(dòng)血清miRNA研究成果的轉(zhuǎn)化和不同實(shí)驗(yàn)室之間研究成果的比較。(5)血清miRNA內(nèi)參檢測(cè)試劑盒實(shí)用性評(píng)價(jià):選取在膀胱癌患者血清中高表達(dá)的hsa-miR-148b_3p作為目的分子，檢測(cè)其表達(dá)水平，并以hsa-miR-193a_5p和 hsa-miR-16-5p作為內(nèi)參，以評(píng)價(jià)血清miRNA內(nèi)參檢測(cè)試劑盒的實(shí)用性。 [0042]具體介紹如下:
[0043]實(shí)施例1標(biāo)本的收集和資料整理
[0044]本發(fā)明的發(fā)明人收集了山東大學(xué)齊魯醫(yī)院2011至2013年之間250例膀胱癌患者血清樣本，并同期收集了 158例對(duì)照者血清，用作Solexa測(cè)序及后續(xù)qRT-PCR篩選及驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)樣品。
[0045](I)經(jīng)病理學(xué)確診的膀胱癌病人250例，其采血前均未經(jīng)過手術(shù)及放化療。
[0046](2 )健康男性、女性對(duì)照共158例。
[0047]系統(tǒng)采集了以上受試者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)資料、臨床病理資料等情況。
[0048]實(shí)施例2血清miRNA的Solexa測(cè)序
[0049]測(cè)序階段選取的樣本包括10例侵襲性膀胱癌、10例非侵襲性膀胱癌和10例對(duì)照， 三組樣本經(jīng)Solexa測(cè)序獲得相關(guān)結(jié)果(試劑盒購(gòu)自ABI公司)。具體步驟為:
[0050](I)每組樣本取血清15ml,加入等體積Trizol試劑并充分混勻；
[0051](2)室溫放置30min，然后按每ImlTrizol試劑加入0.2ml氯仿的體積比加入氯仿， 劇烈震蕩 IOs,室溫 20min, 12，OOOg, 4°C，離心 15min ；
[0052](3)小心將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，采用3步苯酚/氯仿法去除蛋白；
[0053](4)將水相轉(zhuǎn)移到新的離心管中，然后按每ImlTrizol試劑加入0.5ml異丙醇的體積比加入異丙醇，-20°C靜置120min，12，000g，4°C，離心60min ；
[0054](5)用Iml Trizol試劑重懸沉淀,將懸液轉(zhuǎn)移至新的離心管中；
[0055](6)重復(fù)(2)、(4)步【(4)步離心改為15min)】；
[0056](7)棄上清,加入 100% 乙醇,12, 000g, 4°C，離心 15min ；
[0057](8 )采用分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度；
[0058](9)利用PAGE電泳回收17_27ntRNA分子，即miRNA分子；
[0059](10)將鏈接引物(adaptor prime)分別酶聯(lián)在miRNA分子的3'與5'端；
[0060](11)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后測(cè)序；[0061](12)利用生物信息學(xué)方法，對(duì)所得膀胱癌血清miRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析。
[0062]實(shí)施例3血清miRNA的qRT-PCR篩選及驗(yàn)證
[0063]根據(jù)Solexa測(cè)序結(jié)果，選擇符合下列標(biāo)準(zhǔn)的miRNA分子利用qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步篩選:a)在侵襲性膀胱癌、非侵襲性膀胱癌和對(duì)照組中表達(dá)拷貝數(shù)均大于50 ；b)在三組均穩(wěn)定表達(dá)，且三組之間無(wú)明顯差異(P ^ 0.05)。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)，共選出10個(gè)符合要求的 miRNA 分子(包括 hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-10a-5p、 hsa-miR-345_5p、hsa-miR-143_3p、hsa-miR-140_3p、hsa-miR-502_3p、let-7d_3p、 hsa-miR-141-3p)。此外，由于U6常被作為組織miRNA檢測(cè)的內(nèi)參分子，為驗(yàn)證其在血清中可否作為內(nèi)參，U6也作為候選分子被納入篩選。通過對(duì)上述10個(gè)miRNA及U6采用qRT-PCR 技術(shù)在一組受試者(包括30例侵襲性膀胱癌、30例非侵襲性膀胱癌和35例對(duì)照)中進(jìn)行驗(yàn)證(見圖1)，有6個(gè)候選分子因表達(dá)水平較低而被排除(hsa-miR-10a-5p、hsa-miR-345_5p、 hsa-miR-143-3p、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-502-3p 及 hsa-miR-141_3p)。對(duì)剩余 5 個(gè)分子 (hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-16_5p、let-7d_3p 及 U6),米用 Normfinder、 geNorm軟件進(jìn)行表達(dá)穩(wěn)定性分析。整個(gè)研究過程均實(shí)施嚴(yán)格質(zhì)控,每個(gè)樣本連續(xù)檢測(cè)三次且所有檢測(cè)均采用盲法。
[0064](I)通過對(duì)血清miRNA直接逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。逆轉(zhuǎn)錄體系包括10 yl2 XmiRNA Reaction Buffer Mix (Takara 公司)，2 u I miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix (Takara 公司)，2 ill 0.l%BSA(Takara 公司)，IRNA 分離液(buffer)，I 血清。反應(yīng)條件為 37°C 60min, 85°C 5s, 4°C 60min。
[0065](2) qRT-PCR反應(yīng)。將cDNA用雙蒸水按1:5比例進(jìn)行稀釋，取2 yl稀釋后的 cDNA,分別加入 12.5 U I SYBR Premix Ex Taq II (Takara 公司)，0.5 U I ROX Reference Dye II (Takara 公司)，I u I Un1-miR qPCR Primer (Takara 公司)，2 u I 正向引物，2 u I ddH20進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。所使用儀器為ABI Prism7500熒光定量PCR儀，反應(yīng)條件為: 950C 30s — I 個(gè)循環(huán)；(95°C 5s,60°C 34s) — 45 個(gè)循環(huán)。
[0066](3)數(shù)據(jù)處理與分析。對(duì)每個(gè)樣本血清各個(gè)miRNA分子三次檢測(cè)結(jié)果(Ct值) 取平均值，排除表達(dá)水平較低(Ct值中位數(shù)大于35)的miRNA分子，對(duì)剩余分子采 用 One-wayANOVA方法分析各個(gè)miRNA在不同樣本組之間是否有表達(dá)差異，運(yùn)用Normf inder及 geNorm計(jì)算各個(gè)miRNA的穩(wěn)定性(見表1)。由 表1可知,若采用單個(gè)miRNA作為血清內(nèi)參， hsa-miR-193a-5p為穩(wěn)定性最高的內(nèi)參，而hsa-miR-193a_5p及hsa-miR-16_5p的組合穩(wěn)定性更佳。
[0067]表1
[0068]
【權(quán)利要求】
1.一種用于膀胱癌血清miRNA檢測(cè)的內(nèi)參，其特征在于:該內(nèi)參為單獨(dú)的 hsa-miR-193a_5p,或:hsa-miR-193a_5p 與 hsa-miR-16_5p0
2.檢測(cè)權(quán)利要求1所述的用于膀胱癌血清miRNA檢測(cè)的內(nèi)參的引物，其特征在于:包括檢測(cè) hsa-miR-193a_5p 或 / 和 hsa-miR-16_5p 的引物，如下:(1)檢測(cè)hsa-miR-193a-5p的引物，包括逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如 SEQ ID NO:1所示，檢測(cè)引物的序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示:hsa-miR-193a_5p-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCATCT-3’ ； hsa-miR-193a-5p-F:5’ -GCTGGGTCTTTGCGGGCG-3’ ； hsa-miR-193a-5p-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3’ ；(2)檢測(cè)hsa-miR-16-5p的引物，包括逆轉(zhuǎn)錄引物和檢測(cè)引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的序列如 SEQ ID NO:4所示，檢測(cè)引物的序列如SEQ ID N0:5、SEQ ID NO:6所示:hsa-miR-16_5p-RT:5’ -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3’ ； hsa-miR-16-5p-F:5’ -GCTAGCAGCACGTAAATA-3’ ； hsa-miR-16-5p-R:5’ -GTGCAGGGTCCGAGGT-3J。
3.權(quán)利要求1所述的用于膀胱癌血清miRNA檢測(cè)的內(nèi)參在制備診斷膀胱癌的試劑盒中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述的檢測(cè)用于膀胱癌血清miRNA檢測(cè)的內(nèi)參的引物在制備診斷膀胱癌的試劑盒中的應(yīng)用。
5.—種診斷膀胱癌的試劑盒,其特征在于:該試劑盒含有用于檢測(cè)hsa-miR-193a-5p 的引物，如SEQ ID NO:1~3所示，或者含有用于檢測(cè)hsa-miR-193a-5p與hsa-miR-16_5p 的引物，如SEQ ID NO:1~6所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的診斷膀胱癌的試劑盒，其特征在于:所述診斷膀胱癌的試劑盒，還可以包含用于miRNA提取及qRT-PCR反應(yīng)所需的RNA分離液、試劑和酶，以及標(biāo)準(zhǔn)品或/和對(duì)照品。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的診斷膀胱癌的試劑盒，其特征在于:所述RNA分離液由吐溫 20、三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白和水組成，各組分的濃度如下:吐溫 20:2.5%，三羥甲基氨基甲烷:50mmol/L，乙二胺四乙酸:lmmol/L，牛血清白蛋白:1%，余量為水。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103602747SQ201310624442
【公開日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月28日
【發(fā)明者】王傳新, 杜魯濤, 劉益民, 張欣, 楊詠梅 申請(qǐng)人:山東大學(xué)齊魯醫(yī)院