一種表皮細胞富集儀及其動態(tài)富集方法

一種表皮細胞富集儀及其動態(tài)富集方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種表皮細胞富集儀及其動態(tài)富集方法，屬于醫(yī)療領(lǐng)域。所述表皮細胞富集儀，包括底座，以及設(shè)置在底座上的控制面板、消化容器、過濾容器、混合容器、控制單元、加熱器、振動器、傳感器和電源等，通過動態(tài)富集消化方法，一方面可以快速離散表皮，得到高密度的表皮細胞懸液，另一方面，可以使消化酶的使用濃度和使用量大幅度降低，同時可縮短消化時間，有利于細胞活性的保持，減少細胞損耗，最終配液所得的已經(jīng)分化的表皮細胞噴涂在創(chuàng)面上，表皮細胞在創(chuàng)面通過逆分化形成表皮干細胞，促進傷口愈合，皮源得到充分合理的利用，擴增倍數(shù)達到100-120倍。
【專利說明】一種表皮細胞富集儀及其動態(tài)富集方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種細胞富集儀及其富集方法，特別是涉及一種表皮細胞富集儀及其動態(tài)富集方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，我國燒傷的發(fā)病率為總?cè)丝诘?%。~10%。，每年發(fā)生燒傷者近千萬人，需要住院治療的達數(shù)十萬人之多，燒傷治愈后常遺留大量疤痕，對患者的外貌、體型，以及功能、心理方面造成負面影響。
[0003]目前，利用有限的皮源對較大面積的燒傷創(chuàng)面進行治療，主要有兩種:
1、微粒皮技術(shù):將有限的自體皮源使用物理方法進行分散成盡量小的微粒，然后回植到病人的創(chuàng)面上，這種技術(shù)可將皮片擴大10~20倍，但使用該物理方法一方面很難將皮片進一步擴大，另一方面表皮貼附率低，難以保證療效；
2> RECELL技術(shù):因為創(chuàng)面的關(guān)閉是通過表皮干細胞的增殖完成，RECELL技術(shù)是將基底層表皮細胞進行靜態(tài)消化，然后利用噴霧法將表皮細胞噴灑于創(chuàng)面，使用該技術(shù)理論上可將皮片擴大40~80倍，表皮干細胞主要存在于基底層中，因此，這種技術(shù)主要是利用表皮干細胞來修復創(chuàng)面。采用靜態(tài)消化主要存在如下缺陷:消化酶與底物之間混合欠佳，消化時間長，且消化不均勻。
[0004]有鑒于此，本發(fā)明人對此進行研究，專門開發(fā)出一種表皮細胞富集儀及其動態(tài)富集方法，本案由此產(chǎn)生。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一`種表皮細胞富集儀及其動態(tài)富集方法，采用動態(tài)消化方式取得高密度、有活力的表皮細胞，且整個過程消化時間短，消化均勻。
[0006]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的解決方案是:
一種表皮細胞富集儀，包括底座，以及設(shè)置在底座上的控制面板、消化容器、過濾容器、混合容器、控制單元、加熱器、振動器、傳感器和電源等，其中，控制面板包括顯示屏和按鍵，振動器安裝在消化容器的底部，使消化容器產(chǎn)生一定頻率的振動；加熱器安裝在消化容器的外表面上，用于加熱消化容器內(nèi)的液體，溫度傳感器安裝在消化容器上，用于監(jiān)測消化容器的加熱溫度，上述加熱器、振動器分別與控制單元的輸出端相連，控制面板和傳感器器分別與控制單元的輸入端相連，電源分別為控制面板、控制單元、加熱器和振動器供電。
[0007]上述消化容器的側(cè)壁上設(shè)有一通孔，用于安裝溫度傳感器。
[0008]上述過濾容器的上端設(shè)有濾網(wǎng)，用于過濾動態(tài)消化后的溶液，濾網(wǎng)的目數(shù)為20-60。
[0009]上述消化容器、過濾容器和混合容器的入口部以及控制面板分別安裝在底座的上表面上。
[0010]上述底座上表面上進一步設(shè)有一操作臺，用于表皮消化前的剪切等預處理。[0011 ] 所述振動器采用振動電機。
[0012]控制單元、電源和振動器分別安裝在底座的下表面上，振動器的頂部與消化容器的底部相接觸。
[0013]一種表皮細胞動態(tài)富集方法，包括預處理、消化、過濾和配液，具體步驟為:
(1)預處理:取表皮，在表皮細胞富集儀的操作臺上制成若干塊表皮片；
(2)消化:啟動表皮細胞富集儀電源，取步驟(1)所得表皮片置于消化容器中，加入消化酶，通過控制單元控制振動器和加熱器，進行動態(tài)消化，得細胞懸液；
(3)過濾:將步驟(2)所得細胞懸液滴入過濾容器進行過濾，去除表皮殘渣，下層的細胞液用于配液；
(4)配液:將過濾所得細胞液滴入混合容器，與蛋白凝膠混合，混合均勻完成配液。
[0014]作為優(yōu)選，上述步驟(1)中，所取的表皮為斷層皮片，斷層皮片為厚度為0.3-0.6mm的中厚皮片，制得的每塊表皮片的粒徑在l_5mm。
[0015]作為優(yōu)選，上述步驟(2)中，消化酶的添加比例為:每1-2 cm2斷層皮片加4_6ml的消化酶，所述消化酶由胰酶和EDTA配制而成，其中，胰酶在消化酶中的質(zhì)量濃度為0.25-0.5%，EDTA在消化酶中的質(zhì)量濃度為0.01-0.05% ;動態(tài)消化前先靜置5_7分鐘(也可稱為靜態(tài)消化)，再啟動振動器，進行動態(tài)消化3-7分鐘后，再靜置5-7分鐘，再啟動振動器，恒溫下循環(huán)2-5次，整個過程加熱器將溫度控制在36.8-37.5°C，循環(huán)結(jié)束后進行細胞沖刷；細胞沖刷采用的試劑為PBS、標準生理鹽水或格林氏液中的任一種，以細胞完全沖出消化容器為止。
[0016]作為優(yōu)選，在步驟(4)中，下層細胞液在蛋白凝膠混合前，先添加抑制劑形成細胞懸液，抑制劑優(yōu)選為自體血清或大豆胰蛋白酶，每5-15ml下層細胞液中自體血清添加1-3滴(每15滴為1ml)，大豆胰蛋白酶的添加量為下層細胞液的0.8-3倍。
[0017]作為優(yōu)選，在步驟(4)中，蛋白凝膠為纖維蛋白膠，混合過程為:分別將細胞懸液與促凝劑、纖維蛋白膠混合。較優(yōu)的，促凝劑和纖維蛋白膠先進行預混合，再將細胞懸液和促凝劑/纖維蛋白膠灌入雙筒注射器的不同筒中，在同樣壓力作用下，細胞懸液和促凝劑/纖維蛋白膠同時擠出，混合均勻完成配液，纖維蛋白膠與促凝劑的總量和細胞懸液等量。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，上述表皮細胞富集儀及其動態(tài)富集方法采用動態(tài)消化方式，一方面可以快速離散表皮，得到高密度的表皮細胞懸液，另一方面，可以使消化酶的使用濃度和使用量大幅度降低，消化更均勻，同時可縮短消化時間，有利于細胞活性的保持，減少細胞損耗，最終配液所得的已經(jīng)分化的表皮細胞噴涂在創(chuàng)面上，表皮細胞在創(chuàng)面通過逆分化形成表皮干細胞，促進傷口愈合，皮源得到充分合理的利用，擴增倍數(shù)達到100-120倍。
[0019]以下結(jié)合附圖及具體實施 例對本發(fā)明做進一步詳細描述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為本實施例的表皮細胞富集儀俯視圖；
圖2為本實施例的表皮細胞富集儀立體結(jié)構(gòu)示意圖；
圖3為本實施例的表皮細胞富集儀控制模塊圖；
圖4為采用本發(fā)明所得細胞應(yīng)用于裸鼠背部創(chuàng)面后第2周的染色結(jié)果對照(100倍顯微鏡下);圖5為采用本發(fā)明所得細胞應(yīng)用于裸鼠背部創(chuàng)面后第3周的染色結(jié)果對照(100倍顯微鏡下);
圖6為采用本發(fā)明所得細胞應(yīng)用于裸鼠背部創(chuàng)面后第4周的染色結(jié)果對照(100倍顯微鏡下);
圖7為顯微鏡下靜態(tài)消化獲得的活的表皮細胞得到富集(100倍相差顯微鏡下)；
圖8為顯微鏡下動態(tài)消化獲得的成纖維細胞得到富集(100倍相差顯微鏡下)。
[0021]標號說明:
底座I ;底座上表面11 ;底座下表面12 ;操作臺13 ；
控制面板2 ;顯示屏21 ;按鍵22 ；
消化容器3 ；
過濾容器4 ；
混合容器5 ;控制單元6 ;加熱器7 ;振動器8 ;傳感器9 ;電源10。
【具體實施方式】
[0022]實施例1
如圖1-3所示，一種表皮細胞富集儀，包括底座1，以及設(shè)置在底座I上的控制面板2、消化容器3、過濾容器4、混合容器5、控制單元6、加熱器7、振動器8、傳感器9和電源10等，其中，控制面板2包括顯示屏21和按鍵22，在本實施例中，上述顯示屏21采用數(shù)碼管顯示，主要用于顯示溫度、振動頻率、循環(huán)時間等參數(shù)，按鍵22包括電源啟動按鍵和振動開啟按鍵。振動器8安裝在消化容器3的底部，使消化容器3產(chǎn)生一定頻率的振動；在本實施例中，所述振動器8采用振動電機，振動電機的轉(zhuǎn)速范圍為1100-2500rpm。振動器8也可以采用其他類似部件替代，只要能是消化容器3內(nèi)的溶液產(chǎn)生一定頻率的震動或晃動就行，如采用搖床替代振動器8，搖床轉(zhuǎn)速一般控制在60-300rpm。加熱器7安裝在消化容器3的外表面上，用于加熱消化容器3，使消化容器3內(nèi)的溶液保持在36.8-37.5°C之間，傳感器9安裝在消化容器3側(cè)壁的通孔上，溫度傳感器的探頭伸入溶液內(nèi)，實時監(jiān)測消化容器3的加熱溫度，溫度傳感器9可以采用多種型號的溫度傳感器，目的在于能精確感應(yīng)到消化容器3內(nèi)溶液的溫度。
[0023]上述加熱器7、振動器8分別與控制單元6的輸出端相連，控制面板2和傳感器器9分別與控制單元6的輸入端相連，電源10分別為控制面板2、控制單元6、加熱器7和振動器8供電。在本實施例中，上述控制單兀6米用微處理器芯片,可以選擇多個型號的微處理器，只要能實現(xiàn)上述控制功能就行。
[0024]過濾容器4的上端設(shè)有60目的過濾網(wǎng)。
[0025]上述消化容器3、過濾容器5和混合容器6的入口部以及控制面板2分別安裝在底座I的上表面11上。消化容器3、過濾容器5和混合容器6的容量一般為10-20ml。
[0026]上述底座上表面11上進一步設(shè)有一操作臺13，用于表皮消化前，剪切等預處理。
[0027]控制單元6、電源10和振動器8分別安裝在底座I的下表面12上，振動器8的頂部與消化容器3的底部相接觸。
[0028]一種表皮細胞動態(tài)富集方法，包括預處理、消化、過濾和配液，具體步驟為，
(1)預處理:取表皮，在表皮細胞富集儀的操作臺13上制成若干塊表皮片，所取的表皮為斷層皮片，所述斷層皮片為厚度為0.3mm的中厚皮片，制得的每塊表皮片的粒徑在Imm ；
(2)消化:啟動表皮細胞富集儀電源10，取步驟(1)所得表皮片置于消化容器3中，加入消化酶，通過控制單元6控制振動器8和加熱器7，進行動態(tài)消化，得細胞懸液；在本實施例中，每I cm2斷層皮片加4ml的消化酶，所述消化酶由胰酶和EDTA配制而成，其中，胰酶在消化酶中的質(zhì)量濃度為0.25%，EDTA在消化酶中的質(zhì)量濃度為0.01% ;動態(tài)消化前要先靜置5分鐘(也可稱為靜態(tài)消化)，然后再啟動振動器8，進行動態(tài)消化3分鐘后，再靜置5分鐘，再啟動振動器8，在36.8°C的恒溫下循環(huán)2次，振動電機的轉(zhuǎn)速為IlOOrmp，循環(huán)結(jié)束后進行細胞沖刷；細胞沖刷采用的試劑為PBS，以細胞完全沖出消化容器3為止；
(3)過濾:將步驟(2)所得細胞懸液滴入過濾容器4進行過濾，去除表皮殘渣，下層的細胞液用于配液，在本實施例中，所述過濾網(wǎng)為60目；
(4)配液:將過濾所得細胞液滴入混合容器5，與蛋白凝膠混合，混合均勻完成配液，在本實施例中，下層細胞液中添加抑制劑形成細胞懸液，抑制劑為自體血清，每5ml下層細胞液中添加自體血清I滴(每15滴為Iml);蛋白凝膠為纖維蛋白膠，混合過程為:分別將細胞懸液與促凝劑、纖維蛋白膠混合。可以促凝劑和纖維蛋白膠先進行預混合，再將細胞懸液和促凝劑/纖維蛋白膠灌入雙筒注射器的不同筒中，在同樣壓力作用下，細胞懸液和促凝劑/纖維蛋白膠同時擠出，混合均勻完成配液，纖維蛋白膠與促凝劑的總量和細胞懸液等量。
[0029]實施例2
一種表皮細胞富集儀其結(jié)構(gòu)同實施例1，主要區(qū)別在于過濾網(wǎng)為50目。
[0030]一種表皮細胞動態(tài)富集方法，包括預處理、消化、過濾和配液，具體步驟為:
(1)預處理:取表皮，在表皮細胞富集儀的操作臺13上制成若干塊表皮片；所取的表皮為斷層皮片，制得的每塊表 皮片的粒徑在3mm，斷層皮片的厚度為0.5mm的中厚皮片；
(2)消化:啟動表皮細胞富集儀電源10，取步驟(1)所得表皮片置于消化容器3中，加入消化酶，通過控制單元6控制振動器8和加熱器7，進行動態(tài)消化，得細胞懸液；在本實施例中，每1.5 cm2斷層皮片加5ml的消化酶，所述消化酶由胰酶和EDTA配制而成，其中，胰酶在消化酶中的質(zhì)量濃度為0.4%，EDTA在消化酶中的質(zhì)量濃度為0.03% ;動態(tài)消化前要先靜置6分鐘(也可稱為靜態(tài)消化)，然后再啟動振動器8，進行動態(tài)消化5分鐘后，再靜置6分鐘，再啟動振動器8，37°C恒溫下循環(huán)4次，振動電機的轉(zhuǎn)速為2000rmp，循環(huán)結(jié)束后進行細胞沖刷；細胞沖刷采用的試劑為標準生理鹽水，以細胞完全沖出消化容器為止。
[0031](3)過濾:將步驟(2)所得細胞懸液滴入過濾容器4進行過濾，去除表皮殘渣，下層的細胞液用于配液；在本實施例中，所述過濾網(wǎng)為50目；
(4)配液:將過濾所得細胞液滴入混合容器5，與蛋白凝膠混合，混合均勻完成配液。在本實施例中，下層細胞液中添加抑制劑形成細胞懸液，抑制劑大豆胰蛋白酶，大豆胰蛋白酶則以等摩爾量添加。蛋白凝膠為纖維蛋白膠，混合過程為:分別將細胞懸液與促凝劑、纖維蛋白膠混合。較優(yōu)的，促凝劑和纖維蛋白膠先進行預混合，再將細胞懸液和促凝劑/纖維蛋白膠灌入雙筒注射器的不同筒中，在同樣壓力作用下，細胞懸液和促凝劑/纖維蛋白膠同時擠出，混合均勻完成配液，纖維蛋白膠與促凝劑的總量和細胞懸液等量。
[0032]實施例3
一種表皮細胞富集儀其結(jié)構(gòu)同實施例1，主要區(qū)別在于過濾網(wǎng)為20目。
[0033]一種表皮細胞動態(tài)富集方法，包括預處理、消化、過濾和配液，具體步驟為，(1)預處理:取表皮，在表皮細胞富集儀的操作臺13上制成若干塊表皮片；所取的表皮為斷層皮片，制得的每塊表皮片的粒徑在5mm。斷層皮片的厚度為0.6mm的中厚皮片；
(2)消化:啟動表皮細胞富集儀電源，取步驟(1)所得表皮片置于消化容器中，加入消化酶，通過控制單元10控制振動器8和加熱器7，進行動態(tài)消化，得細胞懸液；在本實施例中，每2 cm2斷層皮片加6ml的消化酶，所述消化酶由胰酶和EDTA配制而成，其中，胰酶在消化酶中的質(zhì)量濃度為0.5%，EDTA在消化酶中的質(zhì)量濃度為0.05% ;動態(tài)消化前要先靜置7分鐘(也可稱為靜態(tài)消化)，然后再啟動振動器8，進行動態(tài)消化7分鐘后，再靜置7分鐘，再啟動振動器8，37.5°C恒溫下循環(huán)5次，振動電機的轉(zhuǎn)速為2500rmp，循環(huán)結(jié)束后進行細胞沖刷，細胞沖刷采用的試劑為格林氏液，以細胞完全沖出消化容器為止；
(3)過濾:將步驟(2)所得細胞懸液滴入過濾容器4進行過濾，去除表皮殘渣，下層的細胞液用于配液，在本實施例中，所述過濾網(wǎng)為20目；
(4)配液:將過濾所得細胞液滴入混合容器5，與蛋白凝膠混合，混合均勻完成配液。在本實施例中，下層細胞液中添加抑制劑形成細胞懸液，抑制劑優(yōu)選為自體血清，每15ml下層細胞液中添加自體血清3滴(每15滴為1ml)。蛋白凝膠為纖維蛋白膠，混合過程為:分別將細胞懸液與促凝劑、纖維蛋白膠混合。促凝劑和纖維蛋白膠先進行預混合，再將細胞懸液和促凝劑/纖維蛋白膠灌入雙筒注射器的不同筒中，在同樣壓力作用下，細胞懸液和促凝劑/纖維蛋白膠同時擠出，混合均勻完成配液，纖維蛋白膠與促凝劑的總量和細胞懸液
雄且寺里。
[0034]上述3個實施例中，根據(jù)表皮處理量的增加，選用的消化酶中胰酶、EDTA等的濃度也逐漸增加，以適應(yīng)處理能力，抑制劑的添加量與待處理的表皮量相對應(yīng)。
[0035]以下以應(yīng)用于燒傷裸鼠背部`創(chuàng)面時的測試結(jié)果為例，進行本發(fā)明技術(shù)方案的具體闡述。
[0036]圖4、圖5和圖6為采用實施例2技術(shù)方案后，創(chuàng)面的染色結(jié)果對照，其中圖4為第二周HE染色結(jié)果，A為微載體培養(yǎng)表皮細胞，可見表皮已經(jīng)形成，并且較厚，但是欠均勻，復層化明顯，B為未經(jīng)培養(yǎng)的表皮細胞懸液，同樣形成較厚的表皮層，有明顯的復層化，C為原代培養(yǎng)表皮細胞也已經(jīng)形成表皮層，有明顯的復層化，D為單純纖維蛋白膠，無明顯表皮層形成，創(chuàng)面有大量成纖維細胞；圖5為第三周動物實驗組織學檢測，HE染色結(jié)果:A為微載體培養(yǎng)表皮細胞，有較厚的但不均勻的表皮層形成，B為未經(jīng)培養(yǎng)的表皮細胞懸液，有較厚的表皮層形成，且比較均勻，C為原代培養(yǎng)表皮細胞，有較薄的均勻的表皮層形成，D為單純纖維蛋白膠，無明顯表皮層形成；圖6為第四周動物實驗組織學檢測，HE染色結(jié)果:A為微載體培養(yǎng)表皮細胞，有較厚的但不均勻的表皮層形成，B為未經(jīng)培養(yǎng)的表皮細胞懸液，有較厚的表皮層形成，且比較均勻，C為原代培養(yǎng)表皮細胞，表皮層較薄，D為單純纖維蛋白膠，無表皮層形成。
[0037]從在圖7和圖8中可以明顯看出:通過動態(tài)消化獲得的細胞(圖8)明顯多于靜態(tài)消化所獲得的細胞(圖7)，通過臺盼藍染色后，動態(tài)消化的細胞仍然維持較高的細胞活力(圖 8)。
[0038]表皮細胞中除表皮干細胞外，其他細胞同樣具有增殖的功能，有助于創(chuàng)面愈合，因此，本發(fā)明所提供的上述方案中，將全部的斷層皮片作為表皮細胞來源；在進行動態(tài)消化過程中，在一定溫度下采用振動方式提供動態(tài)消化條件，一方面可獲得更大、更多的細胞量，同時，消化酶的使用濃度和使用量也可以大大降低，同時可縮短消化時間，有利于細胞活性的保持，減少細胞損耗，采用本發(fā)明中的動態(tài)消化方法獲得表皮細胞是一種可靠的方法，已經(jīng)分化的表皮細胞可以在創(chuàng)面通過逆分化，形成表皮干細胞，促進傷口愈合，皮源得到充分合理的利用，擴增倍數(shù)達到100-120倍。 [0039]上述實施例和圖式并非限定本發(fā)明的產(chǎn)品形態(tài)和式樣，任何所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員對其所做的適當變化或修飾，皆應(yīng)視為不脫離本發(fā)明的專利范疇。
【權(quán)利要求】
1.一種表皮細胞富集儀，其特征在于:包括底座，以及設(shè)置在底座上的控制面板、消化容器、過濾容器、混合容器、控制單元、加熱器、振動器、傳感器和電源，其中，控制面板包括顯示屏和按鍵，振動器安裝在消化容器的底部，使消化容器產(chǎn)生一定頻率的振動；加熱器安裝在消化容器的外表面上，用于加熱消化容器內(nèi)的液體，溫度傳感器安裝在消化容器上，用于監(jiān)測消化容器的加熱溫度，上述加熱器、振動器分別與控制單元的輸出端相連，控制面板和傳感器器分別與控制單元的輸入端相連，電源分別為控制面板、控制單元、加熱器和振動器供電。
2.如權(quán)利要求1所述的一種表皮細胞富集儀，其特征在于:上述消化容器的側(cè)壁上設(shè)有一通孔，用于安裝溫度傳感器。
3.如權(quán)利要求1所述的一種表皮細胞富集儀，其特征在于:上述過濾容器的上端設(shè)有濾網(wǎng)，用于過濾動態(tài)消化后的溶液，濾網(wǎng)的目數(shù)為20-60。
4.如權(quán)利要求1所述的一種表皮細胞富集儀，其特征在于:上述消化容器、過濾容器和混合容器的入口部以及控制面板分別安裝在底座的上表面上；上述底座上表面上進一步設(shè)有一操作臺。
5.如權(quán)利要求1所述的一種表皮細胞富集儀，其特征在于:控制單元、電源和振動器分別安裝在底座的下表面上，振動器的頂部與消化容器的底部相接觸；所述振動器采用振動電機。
6.一種表皮細胞動態(tài)富集方法，其特征在于:包括預處理、消化、過濾和配液，具體步驟為: (1)預處理:取表皮，在表皮細胞富集儀的操作臺上制成若干塊表皮片； (2)消化:啟動表皮細胞富集儀電源，取步驟(1)所得表皮片置于消化容器中，加入消化酶，通過控制單元控制振動器和加熱器，進行動態(tài)消化，得細胞懸液； (3)過濾:將步驟(2)所得細胞懸液滴入過濾容器進行過濾，去除表皮殘渣，下層的細胞液用于配液； (4)配液:將過濾所得細胞液滴入混合容器，與蛋白凝膠混合，混合均勻完成配液。
7.如權(quán)利要求6所述的一種表皮細胞動態(tài)富集方法，其特征在于:上述步驟(1)中，所取的表皮為斷層皮片，斷層皮片為厚度為0.3-0.6mm的中厚皮片，制得的每塊表皮片的粒徑在1-5mm。
8.如權(quán)利要求6或7所述的一種表皮細胞動態(tài)富集方法，其特征在于:上述步驟(2)中，1-2 cm2斷層皮片加4-6ml的消化酶，所述消化酶由胰酶和EDTA配制而成，其中，胰酶在消化酶中的質(zhì)量濃度為0.25-0.5%，EDTA在消化酶中的質(zhì)量濃度為0.01-0.05% ;動態(tài)消化前先靜置5-7分鐘，再啟動振動器，進行動態(tài)消化3-7分鐘后，再靜置5-7分鐘，再啟動振動器，恒溫下循環(huán)2-5次，整個過程加熱器將溫度控制在36.8-37.5°C，循環(huán)結(jié)束后進行細胞沖刷；細胞沖刷采用的試劑為PBS、標準生理鹽水或格林氏液中的任一種，以細胞完全沖出消化容器為止。
9.如權(quán)利要求6所述的一種表皮細胞動態(tài)富集方法，其特征在于:在步驟(4)中，下層細胞液在蛋白凝膠混合前，先添加抑制劑形成細胞懸液，抑制劑為自體血清或大豆胰蛋白酶，每5-15ml下層細胞液中自體血清添加1-3滴，大豆胰蛋白酶的添加量為下層細胞液的·0.8-3 倍。
10.如權(quán)利要求9所述的一種表皮細胞動態(tài)富集方法，其特征在于:在步驟(4)中，蛋白凝膠為纖維蛋白膠，混合過程為分別將細胞懸液與促凝劑、纖維蛋白膠混合:促凝劑和纖維蛋白膠先進行預混合，再將細胞懸液和促凝劑/纖維蛋白膠灌入雙筒注射器的不同筒中，在同樣壓力作用下，細胞懸液和促凝劑/纖維蛋白膠同時擠出，混合均勻完成配液，纖維蛋白膠與促凝劑的 總量和細胞懸液等量。
【文檔編號】C12M1/38GK103614295SQ201310610927
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月27日
【發(fā)明者】韓春茂, 胡信雷, 魯建國, 韓陽 申請人:紹興振德醫(yī)用敷料有限公司