一種云南省松茸的產(chǎn)地屬性dna指紋圖譜的建立方法
【專利摘要】一種云南省松茸的產(chǎn)地屬性DNA指紋圖譜的建立方法，本發(fā)明包括如下步驟：1)樣品DNA提?。簩?duì)云南各松茸產(chǎn)區(qū)的松茸樣品進(jìn)行DNA提取；2)按順序使用pL28l／DS48引物、pDGSL313一l／pS48引物、pDGSL719-2／pS48引物對(duì)提取的松茸樣品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3)運(yùn)用QIAxcel全自動(dòng)DNA分析系統(tǒng)進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè)；4)獲得云南松茸的產(chǎn)地特征屬性DNA指紋圖譜。本發(fā)明提供一種針對(duì)中國(guó)云南松茸主產(chǎn)區(qū)松茸的地屬性DNA指紋圖譜的構(gòu)建方法，以及由此方法得到的松茸的產(chǎn)地屬性的DNA指紋圖譜。從而能夠?yàn)闅埩舯O(jiān)控中的問(wèn)題松茸的云南原產(chǎn)地溯源提供理論參考依據(jù)。
【專利說(shuō)明】—種云南省松茸的產(chǎn)地屬性DNA指紋圖譜的建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種松茸的產(chǎn)地屬性DNA指紋圖譜的建立方法，尤其涉及的是中國(guó)云南松茸主產(chǎn)區(qū)的松茸產(chǎn)地屬性的DNA指紋圖譜的建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002]松鸞隸屬擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)、傘菌目(Agaricales)、口薦科(Tricholoma)、口薦屬(Tricholoma) [1]。全球已報(bào)道了 15 個(gè)種，我國(guó)已記載了 5個(gè)種一個(gè)變種，即松鸞(T.matsutake)、假松鸞(T.bakamatsukake)、青崗覃(T.quercicola)、粗壯口蘑(T.robustum)、黃褐口蘑(T.fulvoeastaneum)和臺(tái)灣松鸞變種(T.matsutake),松鸞是一種外生菌根真菌類(lèi)，由菌絲體、子實(shí)體和孢子組成,本發(fā)明所指的松茸是T.matsutake這個(gè)品種，且指可食用的子實(shí)體部分，也就是人們?cè)谑袌?chǎng)上見(jiàn)到的松茸菌。
[0003]松茸是一種味道鮮美、口感上乘、氣味濃郁獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、具有食療效果的純天然食用菌。目前尚不能人工馴化栽培，基本上都野生菌，所以來(lái)自不同分布區(qū)域的松茸擁有產(chǎn)地屬性。本發(fā)明只針對(duì)新鮮松茸，松茸加工制品中，DNA可能發(fā)生斷裂和降解，且目前多數(shù)松茸加工品不具有產(chǎn)地屬性，沒(méi)有對(duì)其進(jìn)行產(chǎn)地溯源的需要。
[0004]日本是松茸的最大消費(fèi)國(guó)，也是最大的進(jìn)口國(guó)。我國(guó)松茸主要出口至日本，其中鮮松茸的出口量占日本進(jìn)口量的43%，具有巨大的海外貿(mào)易價(jià)值。
[0005]我國(guó)松茸的主產(chǎn)區(qū)是云南、四川、吉林和黑龍江，其中云南的產(chǎn)量最大。
[0006]目前東北生產(chǎn)的鮮松鸞從吉林口岸出口，云南、四川和西藏鮮松鸞從云南出入境口岸出口，但有時(shí)東北產(chǎn)的松茸也會(huì)從云南口岸出口。年平均統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示:云南口岸出口的鮮松茸量平均占中國(guó)出口的鮮松茸量的71%，甚至有時(shí)可占占全國(guó)出口量的85%，居全國(guó)之首。
[0007]中國(guó)云南地區(qū)的松茸的主要分布在云南的迪慶州、大理州、楚雄州、怒江州的海拔為2000-4000米的原始森林區(qū)。交通不便，氣候寒冷，人煙稀少，多是高山少數(shù)名族居住于附近。目前多是由當(dāng)?shù)馗呱截毨贁?shù)民族開(kāi)始對(duì)其進(jìn)行采摘并賣(mài)給當(dāng)?shù)氐乃扇壮隹谑召?gòu)商，這已成為這些少數(shù)民族脫貧致富的主要經(jīng)濟(jì)來(lái)源。因此，松茸的順利出口關(guān)系到這些邊疆少數(shù)民族的經(jīng)濟(jì)收入，關(guān)系到邊疆地區(qū)的民族團(tuán)結(jié)和政治穩(wěn)定。
[0008]松茸雖然是純天然的野生食用菌 ，但是生長(zhǎng)地分散，采摘人員多半是居住于附近的當(dāng)?shù)鼐用瘛?，從采擷到出口還要經(jīng)歷很多環(huán)節(jié)，面對(duì)出口國(guó)特別是日本苛刻的進(jìn)口食品貿(mào)易壁壘，檢驗(yàn)檢疫部門(mén)必須對(duì)松茸的采摘到出口的全過(guò)程進(jìn)行質(zhì)量安全控制和溯源管理，盡可能保證松茸的順利出口。另外，日本也要求我國(guó)提供對(duì)日出口的松茸的官方原產(chǎn)地證明。
[0009]中國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局制定了《出口鮮松茸質(zhì)量安全控制要求》指出“在強(qiáng)化檢驗(yàn)把關(guān)中指出“指導(dǎo)出口企業(yè)避免從農(nóng)殘和重金屬污染嚴(yán)重的地區(qū)收購(gòu)原料，降低農(nóng)殘和重金屬含量超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)”。雖然檢驗(yàn)檢疫監(jiān)督管理部門(mén)按照溯源管理措施，要求企業(yè)對(duì)產(chǎn)地進(jìn)行編號(hào)管理，按照原料來(lái)源分產(chǎn)地加工、存儲(chǔ)堆放，在報(bào)檢時(shí)必須提供該批出口松茸原料溯源管理網(wǎng)絡(luò)圖，但實(shí)際情況是企業(yè)履行得并不嚴(yán)格，這給經(jīng)出口口岸檢驗(yàn)檢疫部門(mén)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)殘留監(jiān)控不合格的松茸的溯源造成困難，為了保護(hù)云南口岸出口的持續(xù)性，以及更有效、更有針對(duì)性對(duì)某個(gè)地區(qū)進(jìn)行松茸質(zhì)量的管理，管理監(jiān)管部門(mén)除了依靠企業(yè)誠(chéng)信備案登記外，還需要能識(shí)別松茸的產(chǎn)地屬性的技術(shù)手段，用于區(qū)別產(chǎn)地來(lái)自不同云南產(chǎn)地的松茸貨品。
[0010]中國(guó)整個(gè)西南地區(qū)的松茸外觀相近，氣味相同，微有口感上的差異，且不同成熟期松茸子實(shí)體外觀會(huì)發(fā)生變化，受此影響，僅從感官判斷不易辨別產(chǎn)地。王明富等研究者就認(rèn)為中國(guó)西南地區(qū)的松茸和日本的松茸即使地理跨度較大，但形態(tài)接近，菌絲體不拮抗，屬同一品系的松鸞。
[0011]以松茸含有的總蛋白以及多糖類(lèi)進(jìn)行分析，這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在松茸的不同成熟期表達(dá)量的不同，受此影響，由此得到的化學(xué)分析數(shù)據(jù)不能用于產(chǎn)地溯源。
[0012]相對(duì)于感官以及營(yíng)養(yǎng)成分的分析，遺傳物質(zhì)的特性不會(huì)隨著菌體生長(zhǎng)而發(fā)生顯著改變，相對(duì)于一個(gè)個(gè)體，遺傳物質(zhì)從幼到老基本都是穩(wěn)定的。
[0013]但沙濤等認(rèn)為滇產(chǎn)松茸的IGS1-RFLP與日產(chǎn)松茸的主要類(lèi)型十分相似，認(rèn)為滇產(chǎn)的和日產(chǎn)的松茸可能是同源的。
[0014]直到Murata等(2008)創(chuàng)建了并運(yùn)用這兩套引物pDGSL313_l/pS48和pDGSL719-2/pS48,序列為:pS48:GAGGTGGGGAAAAATATGGGACGAAC ;pDGSL313_l:CGATGTATGTGGCTGTGCCAGTACCAT ;pDGSL719_2:TGGGCCGCCCTTGATGGCTCATATT ;采用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，對(duì)日本、北朝鮮、中國(guó)東北省區(qū)、中國(guó)西南省區(qū)、不丹的松茸進(jìn)行了地理原產(chǎn)地的追溯，開(kāi)創(chuàng)了利用遺傳物質(zhì)進(jìn)行松茸原產(chǎn)地溯源的局面。其中對(duì)中國(guó)東北省的松茸進(jìn)行pDGSL719-2/pS48的PCR擴(kuò)增有PCR產(chǎn)物，而對(duì)中國(guó)西南省區(qū)的松茸進(jìn)行pDGSL719_2/PS48的PCR擴(kuò)增沒(méi)有PCR產(chǎn)物，這是區(qū)分中國(guó)西南省區(qū)和東北省區(qū)的松茸關(guān)鍵。
[0015]瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)電泳方法自身重復(fù)性不佳、分辨率低下、操作時(shí)間長(zhǎng)，操作人員易接觸可能致畸的基因染料，不適宜將來(lái)運(yùn)用于新鮮松茸的溯源檢測(cè)過(guò)程。全自動(dòng)DNA分析系統(tǒng)基于全自動(dòng)毛細(xì)管電泳的原理，是一種用樣量少，環(huán)境友好，操作快速，分辨率高，電泳條件固定的PCR產(chǎn)物分離系統(tǒng)，所得出的DNA指紋圖譜在數(shù)據(jù)的重復(fù)性和穩(wěn)定性、量化確定性、以及質(zhì)量的控制等方面都比瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)得出的DNA指紋圖譜更加可靠。
[0016] Murata 等(2006)設(shè)計(jì)的 pL281/pS48PCR 反應(yīng)系統(tǒng)，序列為 pL281:
[0017]CTTCACATATACTGGGCATCAGCAAGGG ；pS48:
[0018]GAGGTGGGGAAAAATATGGGACGAAC ；利用一對(duì)引物就可以得到豐富的遺傳多態(tài)信息，當(dāng)時(shí)Murata等用于區(qū)分是否為T(mén).matsutake類(lèi)的松鸞并未用這套引物進(jìn)行松鸞原產(chǎn)地的追溯。
[0019]目前除本發(fā)明外無(wú)任何學(xué)者對(duì)中國(guó)云南松茸主產(chǎn)區(qū)的松茸建立過(guò)產(chǎn)地屬性的DNA指紋圖譜。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0020]本發(fā)明的目的是針對(duì)出口松茸的原產(chǎn)地溯源管理的現(xiàn)實(shí)需求，補(bǔ)填我國(guó)目前沒(méi)有對(duì)中國(guó)云南松茸原產(chǎn)地溯源的DNA技術(shù)的缺口，提供一種針對(duì)中國(guó)云南松茸主產(chǎn)區(qū)松茸的地屬性DNA指紋圖譜的構(gòu)建方法，以及由此方法得到的松茸的產(chǎn)地屬性的DNA指紋圖譜。從而能夠?yàn)闅埩舯O(jiān)控中的問(wèn)題松茸的云南原產(chǎn)地溯源提供理論參考依據(jù)。
[0021]本發(fā)明的中國(guó)云南松茸產(chǎn)地屬性DNA指紋圖譜的建立具體包括下列步驟:
[0022]一種云南省松茸的產(chǎn)地屬性DNA指紋圖譜的建立方法，使用以下pL281/pS48引物、
[0023]pDGSL313-l/pS48引物、pDGSL719_2/pS48引物的引物序列，引物序列分別為:PL281:
[0024]CTTCACATATACTGGGCATCAGCAAGGG ；pS48:
[0025]GAGGTGGGGAAAAATATGGGACGAAC ;pDGSL313_l:
[0026]CGATGTATGTGGCTGTGCCAGTACCAT ;pDGSL719_2:
[0027]TGGGCCGCCCTTGATGGCTCATATT ;其特征在于，包括如下步驟:
[0028]I)樣品DNA提取:對(duì)云南各松茸產(chǎn)區(qū)的松茸樣品進(jìn)行DNA提??；
[0029]2)按順序使用 pL281/pS48 引物、pDGSL313_l/pS48 引物、pDGSL719_2/pS48 引物對(duì)提取的松茸樣品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0030]3)運(yùn)用QIAxcel全自動(dòng)DNA分析系統(tǒng)進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè)；
[0031]4)獲得云南松茸的產(chǎn)地 特征屬性DNA指紋圖譜。
[0032]本發(fā)明該方法的具體參數(shù)為，
[0033]I)樣品DNA提取:取每個(gè)地區(qū)的鮮松茸樣本菌褶部分500mg，以一個(gè)子實(shí)體用一個(gè)指套放入一次性PE手套為原則，放入一次性指套中捻碎；必須選擇使用非過(guò)柱離心的可破碎細(xì)胞壁的商業(yè)DNA提取試劑盒提取新鮮樣本的DNA ；
[0034]2)按順序使用 pL281/pS48 引物、pDGSL313_l/pS48 引物、pDGSL719_2/pS48 引物對(duì)提取的松茸樣品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；其中，PCR的反應(yīng)體系和檢測(cè)條件:Premix TaqVersion2.010 u L,上游引物 0.5 u M,下游引物 0.5 u M，DNA25_50ng，補(bǔ) ddH20 M 20 u L,混合均勻后，94°C 2min ；94°C 30sec，退火溫度 30sec，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 退火溫度:pL281/pS48 引物體系 64°C，pDGSL313-l/pS48 引物體系 64°C，pDGSL719_2/pS48 引物體系 68.5 °C ；
[0035]3)運(yùn)用QIAxcel全自動(dòng)DNA分析系統(tǒng)進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè):pDGSL719_2/pS48引物擴(kuò)增的產(chǎn)物采用DNA Screening kit卡夾執(zhí)行AL300程序進(jìn)行核酸分析；pL281/pS48引物擴(kuò)增的產(chǎn)物和pDGSL313-l/pS48引物擴(kuò)增的產(chǎn)物采用DNA High Resolution kit卡夾執(zhí)行分辨率適度的0M500程序進(jìn)行核酸分析；
[0036]4)獲得云南省松茸的產(chǎn)地特征屬性DNA指紋圖譜。
[0037]1:本發(fā)明按照上述步驟即得到云南省大理白族自治州劍川縣東山鄉(xiāng)、云南省楚雄彝族自治州南華縣五街鎮(zhèn)地區(qū)的松茸產(chǎn)地屬性DNA指紋圖譜。
[0038]I1:本發(fā)明按照在上述步驟3)后增加如下步驟:
[0039]a)單酶限制性酶切體系:10X QuickCut? Bufferl u L, QuickCut? EcoR V0.1 u L,DNA25-50ng,補(bǔ) ddH20 M 10 u L,混合均勻后，37°C IOmin ；
[0040]b)再次進(jìn)行pL281/pS48的PCR反應(yīng)體系:限制性酶切體系10 U L，Premix TaqVersion2.09.8 y L，上游引物 0.5 y M，下游引物 0.5 u M ；
[0041]即得到云南省大理白族自治州劍川縣老君山上蘭鄉(xiāng)、云南省大理白族自治州喜州鎮(zhèn)、云南省大理白族自治州賓川縣、云南省大理白族自治州祥云縣、云南省迪慶藏族自治州香格里拉縣的松茸產(chǎn)地屬性DNA指紋圖譜。
[0042]II1:本發(fā)明按照在上述步驟3)后增加如下步驟:
[0043]a)混合酶限制性酶切體系:10 X QuickCut? Bufferl u L, 10 X QuickCut?Bufferl u L, QuickCut? EcoR V0.1 u L, QuickCut? Sph 10.1 u L, DNAl u L,補(bǔ) ddH20 至
10u L，混合均勻后，37°C IOmin ；
[0044]b)再次進(jìn)行pL281/pS48的PCR反應(yīng)體系:限制性酶切體系10 U L，Premix TaqVersion2.09.8 y L，上游引物 0.5 y M，下游引物 0.5 u M ；
[0045]即得到云南省怒江傈僳族自治州蘭坪白族普米族自治縣和云南省麗江市納西族自治縣玉龍石鼓鎮(zhèn)的松茸產(chǎn)地屬性DNA指紋圖譜。
[0046]本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)是方法穩(wěn)定、重現(xiàn)性好、易于掌握，能將中國(guó)云南松茸主產(chǎn)區(qū)的松茸溯源至單個(gè)產(chǎn)地或者范圍較小的片區(qū)，可做為中國(guó)云南松茸主產(chǎn)區(qū)的鮮松茸的原產(chǎn)地溯源的理論方法之一。
[0047] 本發(fā)明旨在為判別云南松茸的產(chǎn)地提供參考數(shù)據(jù)，此方法的推行與運(yùn)用，可更好的對(duì)云南本地產(chǎn)的松茸進(jìn)行針對(duì)性的區(qū)域管理提供技術(shù)支撐，從而起到保護(hù)云南口岸出口的持續(xù)性的作用。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0048]圖1是實(shí)施例1中運(yùn)用pDGSL719_2/pS48PCR體系得到的云南省大理白族自治州劍川縣東山鄉(xiāng)松茸DNA指紋圖譜；
[0049]圖2是實(shí)施例1中運(yùn)用pDGSL313_l/pS48PCR體系得到的云南省大理白族自治州劍川縣東山鄉(xiāng)松茸DNA指紋圖譜；
[0050]圖3是實(shí)施例1中運(yùn)用pL281/pS48PCR體系得到的云南省大理白族自治州劍川縣東山鄉(xiāng)松茸的DNA指紋圖譜；
[0051]圖4是實(shí)施例2中運(yùn)用pDGSL719-2/pS48PCR體系得到的云南省楚雄彝族自治州南華縣五街鎮(zhèn)松茸DNA指紋圖譜；
[0052]圖5是實(shí)施例2中運(yùn)用pDGSL313_l/pS48PCR體系得到的云南省楚雄彝族自治州南華縣五街鎮(zhèn)松茸DNA指紋圖譜；
[0053]圖6是實(shí)施例2中運(yùn)用pL281/pS48PCR體系得到的云南省楚雄彝族自治州南華縣五街鎮(zhèn)松茸DNA指紋圖譜；
[0054]圖7是實(shí)施例3中運(yùn)用pDGSL719_2/pS48PCR體系得到的云南省大理白族自治州劍川縣老君山上蘭鄉(xiāng)松茸DNA指紋圖譜；
[0055]圖8是實(shí)施例3中運(yùn)用pDGSL313-l/pS48PCR體系得到的云南省大理白族自治州劍川縣老君山上蘭鄉(xiāng)松茸DNA指紋圖譜；
[0056]圖9是實(shí)施例3中運(yùn)用pL281/pS48PCR體系得到的云南省大理白族自治州劍川縣老君山上蘭鄉(xiāng)松茸DNA指紋圖譜；
[0057]圖10是實(shí)施例3中采用限制性酶EcoR V處理樣本DNA后再運(yùn)用pL281/pS48PCR體系得到的云南省大理白族自治州劍川縣老君山上蘭鄉(xiāng)松茸DNA指紋圖譜；
[0058]圖11是實(shí)施例4中運(yùn)用pDGSL719_2/pS48PCR體系得到的云南省大理白族自治州喜州鎮(zhèn)松茸DNA指紋圖譜；
[0059]圖12是實(shí)施例4運(yùn)用pDGSL313_l/pS48PCR體系得到的云南省大理白族自治州喜州鎮(zhèn)松茸DNA指紋圖譜；
[0060]圖13是實(shí)施例4運(yùn)用pL281/pS48PCR體系得到的云南省大理白族自治州喜州鎮(zhèn)松茸DNA指紋圖譜；
[0061]圖14是實(shí)施例4采用限制性酶EcoR V處理樣本DNA后再運(yùn)用pL281/pS48PCR體系得到的云南省大理白族自治州賓川縣松茸DNA指紋圖譜；
[0062]圖15是實(shí)施例5中運(yùn)用pDGSL719_2/pS48PCR體系得到的云南省大理白族自治州賓川縣松茸DNA指紋圖譜；
[0063]圖16是實(shí)施例5運(yùn)用pDGSL313_l/pS48PCR體系得到的云南省大理白族自治州賓川縣松茸DNA指紋圖譜；
[0064]圖17是實(shí)施例5運(yùn)用pL281/pS48PCR體系得到的云南省大理白族自治州賓川縣松茸DNA指紋圖譜；
[0065]圖18是實(shí)施例5采用限制性酶EcoR V處理樣本DNA后再運(yùn)用pL281/pS48PCR體系得到的云南省大理白族自治州祥云縣松茸DNA指紋圖譜；
[0066]圖19是實(shí)施 例6中運(yùn)用pDGSL719_2/pS48PCR體系得到的云南省大理白族自治州祥云縣松茸DNA指紋圖譜；
[0067]圖20是實(shí)施例6運(yùn)用pDGSL313_l/pS48PCR體系得到的云南省大理白族自治州祥云縣松茸DNA指紋圖譜；
[0068]圖21是實(shí)施例6運(yùn)用pL281/pS48PCR體系得到的云南省大理白族自治州祥云縣松茸DNA指紋圖譜；
[0069]圖22是實(shí)施例6采用限制性酶EcoR V處理樣本DNA后再運(yùn)用pL281/pS48PCR體系得到的云南省大理白族自治州祥云縣松茸DNA指紋圖譜；
[0070]圖23是實(shí)施例7中運(yùn)用pDGSL719-2/pS48PCR體系得到的云南省迪慶藏族自治州香格里拉縣松茸DNA指紋圖譜；
[0071]圖24是實(shí)施例7運(yùn)用pDGSL313-l/pS48PCR體系得到的云南省迪慶藏族自治州香格里拉縣松茸DNA指紋圖譜；
[0072]圖25是實(shí)施例7運(yùn)用pL281/pS48PCR體系得到的云南省迪慶藏族自治州香格里拉縣松茸DNA指紋圖譜；
[0073]圖26是實(shí)施例7采用限制性酶EcoR V處理樣本DNA后再運(yùn)用pL281/pS48PCR體系得到的云南省迪慶藏族自治州香格里拉縣松茸DNA指紋圖譜；
[0074]圖27是實(shí)施例8中運(yùn)用pDGSL719_2/pS48PCR體系得到的云南省麗江市納西族自治縣玉龍石鼓鎮(zhèn)松茸DNA指紋圖譜；
[0075]圖28是實(shí)施例8運(yùn)用pDGSL313_l/pS48PCR體系得到的云南省麗江市納西族自治縣玉龍石鼓鎮(zhèn)松茸DNA指紋圖譜；
[0076]圖29是實(shí)施例8運(yùn)用pL281/pS48PCR體系得到的云南省麗江市納西族自治縣玉龍石鼓鎮(zhèn)松茸DNA指紋圖譜；
[0077]圖30是實(shí)施例8采用限制性酶EcoR V+Sph I處理樣本DNA后再運(yùn)用pL281/PS48PCR體系得到的云南省麗江市納西族自治縣玉龍石鼓鎮(zhèn)松茸DNA指紋圖譜；[0078]圖31是實(shí)施例9中運(yùn)用pDGSL719_2/pS48PCR體系得到的云南省怒江傈僳族自治州蘭坪白族普米族自治縣松茸DNA指紋圖譜；
[0079]圖32是實(shí)施例9運(yùn)用pDGSL313_l/pS48PCR體系得到的云南省怒江傈僳族自治州蘭坪白族普米族自治縣松茸DNA指紋圖譜；
[0080]圖33是實(shí)施例9運(yùn)用pL281/pS48PCR體系得到的云南省怒江傈僳族自治州蘭坪白族普米族自治縣松茸DNA指紋圖譜；
[0081]圖34是實(shí)施例9采用限制性酶EcoR V+Sph I處理樣本DNA后再運(yùn)用pL281/PS48PCR體系得到的云南省怒江傈僳族自治州蘭坪白族普米族自治縣松茸指紋圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0082]實(shí)施例1
[0083]松茸樣本:6個(gè)來(lái)自云南省大理白族自治州劍川縣東山鄉(xiāng)的新鮮松茸子實(shí)體。
[0084]DNA提取:分別取菌褶部分500mg，以一個(gè)子實(shí)體用一個(gè)指套放入一次性PE手套為原則，放入一次性的指套中搶碎；移入Tissue DNA Purification Kit (promega)的放樣孔中，用promega Maxwel 116核酸自 動(dòng)提取儀提取DNA。
[0085]按順序依次進(jìn)行pDGSL719-2/pS48、pDGSL313_l/pS48、pL281/pS48 引物體系的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下:Premix Taq Version2.010 y L，上游引物(IOmM) I y L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,補(bǔ) ddH20 至 20 y L，混合均勻后，94°C 2min ；94°C 30sec,退火溫度30sec，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 退火溫度:pDGSL719_2/pS48 引物體系 68.5°C，pDGSL313-l/pS48 引物體系 64°C，pL281/pS48 引物體系 64°C。
[0086]pDGSL719-2/pS48 引物擴(kuò)增的產(chǎn)物采用 DNA Screening kit (QIAxcel)卡夾執(zhí)行AL300程序進(jìn)行核酸分析；pL281/pS48引物擴(kuò)增的產(chǎn)物和pDGSL313_l/pS48引物擴(kuò)增的產(chǎn)物采用DNA High Resolution kit卡夾(QIAxcel)執(zhí)行0M500程序(分辨率更高)進(jìn)行核酸分析。
[0087]云南省大理白族自治州劍川縣東山鄉(xiāng)松茸經(jīng)按順序依次進(jìn)行pDGSL719_2/pS48、pDGSL313-l/pS48、pL281/pS48引物體系擴(kuò)增得到的DNA指紋圖譜見(jiàn)圖1至圖3。
[0088]圖1圖注:M:DNA Size Marker，大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道，使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大??；01_06為樣品標(biāo)號(hào)。
[0089]圖1圖譜特征:pDGSL719-2/pS48引物擴(kuò)增無(wú)條帶。
[0090]圖2圖注:M:DNA Size Marker，大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道，使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大??；01_06為樣品標(biāo)號(hào)；三角形標(biāo)注的地方表示此大小的條帶為樣品間共有條帶。
[0091]圖2圖譜特征:pDGSL313-l/pS48引物擴(kuò)增有273bp條帶，個(gè)別樣本還有60bp和65bp條帶。
[0092]圖3圖注:M:DNA Size Marker，大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道，使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大??；01_06為樣品標(biāo)號(hào)；三角形標(biāo)注的地方表示此大小的條帶為樣品間共有條帶。
[0093]圖3圖譜特征:pL281/pS48引物擴(kuò)增一定具有100、155、210、620bp條帶
[0094]綜合圖1至圖3的圖譜特征，即為云南省大理白族自治州劍川縣東山鄉(xiāng)松茸的DNA產(chǎn)地屬性的指紋圖譜，此組圖譜信息可為云南省大理白族自治州劍川縣東山鄉(xiāng)松茸的產(chǎn)地溯源提供參考依據(jù)。[0095]實(shí)施例2
[0096]松茸樣本:6個(gè)來(lái)自云南省楚雄彝族自治州南華縣五街鎮(zhèn)的新鮮松茸子實(shí)體。
[0097]DNA提取:分別取菌褶部分500mg，以一個(gè)子實(shí)體用一個(gè)指套放入一次性PE手套為原則，放入一次性的指套中搶碎；移入Tissue DNA Purification Kit (promega)的放樣孔中，用promega Maxwel 116核酸自動(dòng)提取儀提取DNA。
[0098]按順序依次進(jìn)行pDGSL719-2/pS48、pDGSL313_l/pS48、pL281/pS48 引物體系的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下:Premix Taq Version2.010 y L，上游引物(IOmM) I y L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,補(bǔ) ddH20 至 20 y L，混合均勻后，94°C 2min ；94°C 30sec,退火溫度30sec，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 退火溫度:pDGSL719_2/pS48 引物體系 68.5°C，pDGSL313-l/pS48 引物體系 64°C，pL281/pS48 引物體系 64°C。
[0099]pDGSL719-2/pS48 引物擴(kuò)增的產(chǎn)物采用 DNA Screening kit (QIAxcel)卡夾執(zhí)行AL300程序進(jìn)行核酸分析；pL281/pS48引物擴(kuò)增的產(chǎn)物和pDGSL313_l/pS48引物擴(kuò)增的產(chǎn)物采用DNA High Resolution kit卡夾(QIAxcel)執(zhí)行分辨率適當(dāng)0M500程序進(jìn)行核酸分析。
[0100]云南省楚雄彝族自治州南華縣五街鎮(zhèn)松茸經(jīng)按順序依次進(jìn)行PDGSL719-2/PS48、pDGSL313-l/pS48、pL281/pS48引物體系擴(kuò)增得到的DNA指紋圖譜見(jiàn)圖4至圖6。
[0101]圖4圖注:M:DNA Size Marker，大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道，使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大小；01_06為樣品標(biāo)號(hào)。
[0102]圖4圖譜特征:pDGSL719-2/pS48引物擴(kuò)增無(wú)條帶。
[0103]圖5圖注:M:DNA Size Marker，大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道，使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大??；01_06為樣品標(biāo)號(hào)；三角形標(biāo)注的地方表示此大小的條帶為樣品間共有條帶。
[0104]圖5圖譜特征:pDGSL313-l/pS48引物擴(kuò)增只有273bp條帶。
[0105]圖6圖注:M:DNA Size Marker,大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道，使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大??；01_06為樣品標(biāo)號(hào)；三角形標(biāo)注的地方表示此大小的條帶為樣品間共有條帶。
[0106]圖6圖譜特征:pL281/pS48引物擴(kuò)增一定具有210、330、800、620bp條帶。
[0107]綜合圖4至圖6的圖譜特征:即為云南省楚雄彝族自治州南華縣五街鎮(zhèn)松茸的DNA產(chǎn)地屬性的指紋圖譜，此組圖譜信息可為云南省楚雄彝族自治州南華縣五街鎮(zhèn)松茸的產(chǎn)地溯源提供參考依據(jù)。
[0108]實(shí)施例3
[0109]松茸樣本:5個(gè)來(lái)自云南省大理白族自治州劍川縣老君山上蘭鄉(xiāng)的新鮮松茸子實(shí)體
[0110]DNA提取:分別取菌褶部分500mg，以一個(gè)子實(shí)體用一個(gè)指套放入一次性PE手套為原則，放入一次性的指套中搶碎；移入Tissue DNA Purification Kit (promega)的放樣孔中，用promega Maxwel 116核酸自動(dòng)提取儀提取DNA。
[0111]將提取的DNA 進(jìn)行如下酶切反應(yīng):10XQuickCut? Buffer (TaKaRa) Iu L,,QuickCut?EcoR V (TaKaRa) 0.2 y L，DNAl y L，補(bǔ) ddH20 至 10 y L，混合均勻后，37°C IOmin,得到模板DNA2。
[0112]以DNAl 為模板按順序依次進(jìn)行 pDGSL719-2/pS48、pDGSL313_l/pS48、pL281/PS48引物體系的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下=Premix Taq Version2.010 ii L，上游引物(IOmM) I U L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,補(bǔ) ddH20 至 20 y L，混合均勻后，94°C 2min ；94°C 30sec，退火溫度 30sec，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 退火溫度:pDGSL719_2/pS48 引物體系 68.5°C, pDGSL313-l/pS48 引物體系 64°C，pL281/pS48 引物體系 64。。。
[0113]以DNA2為模板進(jìn)行pL281/pS48引物體系擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下:Premix TaqVersion2.010 ii L，上游引物(IOmM) I U L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,補(bǔ) ddH20 至20 u L,混合均勻后，94 0C 2min ；94 °C 30sec,退火溫度 30sec，72 °C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 退火溫度:pL281/pS48 引物體系 64。。。
[0114]pDGSL719-2/pS48 引物擴(kuò)增的產(chǎn)物采用 DNA Screening kit (QIAxcel)卡夾執(zhí)行AL300程序進(jìn)行核酸分析；pL281/pS48引物擴(kuò)增的產(chǎn)物和pDGSL313_l/pS48引物擴(kuò)增的產(chǎn)物采用DNA High Resolution kit卡夾(QIAxcel)執(zhí)行分辨率適當(dāng)0M500程序進(jìn)行核酸分析。
[0115]云南省大理白族自治州劍川縣老君山上蘭鄉(xiāng)松茸經(jīng)按順序依次進(jìn)行PDGSL719-2/pS48、pDGSL313-l/pS48、pL281/pS48引物體系擴(kuò)增得到的DNA指紋圖譜見(jiàn)圖7至圖10。
[0116]圖7圖注:M:DNA Size Marker，大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道，使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大??；01_05為樣品標(biāo)號(hào)?
[0117]圖7圖譜特征:pDGSL719-2/pS48引物擴(kuò)增無(wú)條帶。
[0118]圖8圖注:M:DNA Size Marker，大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是 為了對(duì)齊每一個(gè)泳道，使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大小；01_05為樣品標(biāo)號(hào)；三角形標(biāo)注的地方表示此大小的條帶為樣品間共有條帶。
[0119]圖8圖譜特征:pDGSL313-l/pS48引物擴(kuò)增僅有273bp條帶。
[0120]圖9圖注:M:DNA Size Marker，大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道，使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大??；01_05為樣品標(biāo)號(hào)；三角形標(biāo)注的地方表示此大小的條帶為樣品間共有條帶。[0121]圖9圖譜特征:pL281/pS48引物擴(kuò)增一定具有100、210bp條帶，沒(méi)有155bp的條帶。
[0122]圖10圖注:M:DNA Size Marker，大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道,使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大小；01_05為樣品標(biāo)號(hào)。
[0123]圖10圖譜特征:經(jīng)EcoR V酶切+pL281/pS48引物后，一定呈現(xiàn)固定的由100、155、210、600、620、800bp條帶構(gòu)成的結(jié)構(gòu)圖譜。
[0124]綜合圖7至圖10的圖譜特征，即為云南省大理白族自治州劍川縣老君山上蘭鄉(xiāng)松茸的DNA產(chǎn)地屬性的指紋圖譜，此組圖譜信息可為云南省大理白族自治州劍川縣老君山上蘭鄉(xiāng)松茸的產(chǎn)地溯源提供參考依據(jù)。
[0125]實(shí)施例4
[0126]松茸樣本:8個(gè)來(lái)自云南省大理白族自治州喜州鎮(zhèn)的新鮮松茸子實(shí)體
[0127]DNA提取:分別取菌褶部分500mg，以一個(gè)子實(shí)體用一個(gè)指套放入一次性PE手套為原則，放入一次性的指套中搶碎；移入Tissue DNA Purification Kit (promega)的放樣孔中，用promega Maxwel116核酸自動(dòng)提取儀提取DNA,得到模板DNAl。
[0128]將提取的DNA 進(jìn)行如下酶切反應(yīng):10 X QuickCut? Buffer (TaKaRa) I U L,,QuickCut?EcoR V (TaKaRa) 0.2 y L，DNAl y L，補(bǔ) ddH20 至 10 y L，混合均勻后，37°C IOmin,得到模板DNA2。
[0129]以DNAl 為模板按順序依次進(jìn)行 pDGSL719-2/pS48、pDGSL313_l/pS48、pL281/PS48引物體系的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下=Premix Taq Version2.010 ii L，上游引物(IOmM) I U L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,補(bǔ) ddH20 至 20 y L，混合均勻后，94°C 2min ；94°C 30sec，退火溫度 30sec，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 退火溫度:pDGSL719_2/pS48 引物體系 68.5°C, pDGSL313-l/pS48 引物體系 64°C，pL281/pS48 引物體系 64。。。
[0130]以DNA2為模板進(jìn)行pL281/pS48引物體系擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下:Premix TaqVersion2.010 ii L，上游引物(IOmM) I U L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,補(bǔ) ddH20 至20 u L,混合均勻后，94 0C 2min ；94 °C 30sec,退火溫度 30sec，72 °C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 退火溫度:pL281/pS48 引物體系 64。。。
[0131]pDGSL719-2/pS48 引物擴(kuò)增的產(chǎn)物采用 DNA Screening kit (QIAxcel)卡夾執(zhí)行AL300程序進(jìn)行核酸分析；pL281/pS48引物擴(kuò)增的產(chǎn)物和pDGSL313_l/pS48引物擴(kuò)增的產(chǎn)物采用DNA High Resolution kit卡夾(QIAxcel)執(zhí)行分辨率適當(dāng)0M500程序進(jìn)行核酸分析。
[0132]云南省大理白族自治州喜州鎮(zhèn)松茸經(jīng)按順序依次進(jìn)行pDGSL719_2/pS48、pDGSL313-l/pS48、pL281/pS48引物體系擴(kuò)增得到的DNA指紋圖譜見(jiàn)圖11至圖14。
[0133]圖11圖注:M:DNA Size Marker，大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道,使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大??；01_08為樣品標(biāo)號(hào).[0134]圖11圖譜特征:pDGSL719-2/pS48引物擴(kuò)增無(wú)條帶。[0135]圖12圖注:M:DNA Size Marker，大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道,使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大小；01_08為樣品標(biāo)號(hào)；三角形標(biāo)注的地方表示此大小的條帶為樣品間共有條帶。
[0136]圖12圖譜特征:pDGSL313-l/pS48引物擴(kuò)增僅有273bp條帶。
[0137]圖13圖注:M:DNA Size Marker，大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道,使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大??；01_08為樣品標(biāo)號(hào)；三角形標(biāo)注的地方表示此大小的條帶為樣品間共有條帶。
[0138]圖13圖譜特征:pL281/pS48引物擴(kuò)增一定具有100、210bp條帶，沒(méi)有155bp的條帶。
[0139]圖14圖注:M:DNA Size Marker,大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道,使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大??；01_08為樣品標(biāo)號(hào)。
[0140]圖14圖譜特征:經(jīng)EcoR V酶切+pL281/pS48引物后，一定呈現(xiàn)固定的由100、155、210、600、620、800bp條帶構(gòu)成的結(jié)構(gòu)圖譜。
[0141]綜合圖11至圖14的圖譜特征，即為云南省大理白族自治州喜州鎮(zhèn)松茸的DNA產(chǎn)地屬性的指紋圖譜，此組圖譜信息可為云南省大理白族自治州喜州鎮(zhèn)松茸的產(chǎn)地溯源提供參考依據(jù)。
[0142]實(shí)施例5
[0143]松茸樣本:11個(gè)來(lái)自云南省大理白族自治州賓川縣的新鮮松茸子實(shí)體。
[0144]DNA提取:分別取菌褶部分500mg，以一個(gè)子實(shí)體用一個(gè)指套放入一次性PE手套為原則，放入一次性的指套中搶碎；移入Tissue DNA Purification Kit (promega)的放樣孔中，用promega Maxwel116核酸自動(dòng)提取儀提取DNA,得到模板DNAl。
[0145]將提取的DNA 進(jìn)行如下酶切反應(yīng):10 X QuickCut? Buffer (TaKaRa) I U L,,QuickCut?EcoR V (TaKaRa) 0.2 y L，DNAl y L，補(bǔ) ddH20 至 10 y L，混合均勻后，37°C IOmin,得到模板DNA2。
[0146]以 DNAl 為模板按順序依次進(jìn)行 pDGSL719-2/pS48、pDGSL313_l/pS48、pL281/PS48引物體系的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下=Premix Taq Version2.010 ii L，上游引物(IOmM) I U L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,補(bǔ) ddH20 至 20 y L，混合均勻后，94°C 2min ；94°C 30sec，退火溫度 30sec，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 退火溫度:pDGSL719_2/pS48 引物體系 68.5°C, pDGSL313-l/pS48 引物體系 64°C，pL281/pS48 引物體系 64。。。
[0147]以DNA2為模板進(jìn)行pL281/pS48引物體系擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下:Premix TaqVersion2.010 ii L，上游引物(IOmM) I U L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,補(bǔ) ddH20 至20 u L,混合均勻后，94 0C 2min ；94 °C 30sec,退火溫度 30sec，72 °C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 退火溫度:pL281/pS48 引物體系 64。。。
[0148]pDGSL719-2/pS48 引物擴(kuò)增的產(chǎn)物采用 DNA Screening kit (QIAxcel)卡夾執(zhí)行AL300程序進(jìn)行核酸分析；pL281/pS48引物擴(kuò)增的產(chǎn)物和pDGSL313_l/pS48引物擴(kuò)增的產(chǎn)物采用DNA High Resolution kit卡夾(QIAxcel)執(zhí)行分辨率適當(dāng)0M500程序進(jìn)行核酸分析。
[0149]云南省大理白族自治州賓川縣松茸經(jīng)按順序依次進(jìn)行pDGSL719_2/pS48、pDGSL313-l/pS48、pL281/pS48引物體系擴(kuò)增得到的DNA指紋圖譜見(jiàn)圖15至圖18。
[0150]圖15圖注:M:DNA Size Marker,大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道,使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大??；01_11為樣品標(biāo)號(hào).[0151]圖15圖譜特征:pDGSL719-2/pS48引物擴(kuò)增無(wú)條帶。
[0152]圖16圖注:M:DNA Size Marker,大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道,使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大??；01_11為樣品標(biāo)號(hào)；三角形標(biāo)注的地方表示此大小的條帶為樣品間共有條帶。
[0153]圖16圖譜特征:pDGSL313-l/pS48引物擴(kuò)增僅有273bp條帶。
[0154]圖17圖注:M:DNA Size Marker,大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道,使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大??；01_11為樣品標(biāo)號(hào)；三角形標(biāo)注的地方表示此大小的條帶為樣品間共有條帶。
[0155]圖17圖譜特征:pL281/pS48引物擴(kuò)增一定具有100、210bp條帶，沒(méi)有155bp的條帶。
[0156]圖18圖注:M:DNA Size Marker,大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道,使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大??；01_11為樣品標(biāo)號(hào)。
[0157] 圖18圖譜特征:經(jīng)EcoR V酶切+pL281/pS48引物后，一定呈現(xiàn)固定的由100、155、210、600、620、800bp條帶構(gòu)成的結(jié)構(gòu)圖譜。
[0158]綜合圖15至圖18的圖譜特征，即為云南省大理白族自治州賓川縣松茸的DNA產(chǎn)地屬性的指紋圖譜，此組圖譜信息可為云南省大理白族自治州賓川縣松茸的產(chǎn)地溯源提供參考依據(jù)。
[0159]實(shí)施例6
[0160]松茸樣本:6個(gè)來(lái)自云南省大理白族自治州祥云縣的新鮮松茸子實(shí)體。
[0161]DNA提取:分別取菌褶部分500mg，以一個(gè)子實(shí)體用一個(gè)指套放入一次性PE手套為原則，放入一次性的指套中搶碎；移入Tissue DNA Purification Kit (promega)的放樣孔中，用promega Maxwel116核酸自動(dòng)提取儀提取DNA,得到模板DNAl。
[0162]將提取的DNA 進(jìn)行如下酶切反應(yīng):10 X QuickCut? Buffer (TaKaRa) I U L,,QuickCut?EcoR V (TaKaRa) 0.2 y L，DNAl y L，補(bǔ) ddH20 至 10 y L，混合均勻后，37°C IOmin,得到模板DNA2。
[0163]以DNAl 為模板按順序依次進(jìn)行 pDGSL719-2/pS48、pDGSL313_l/pS48、pL281/PS48引物體系的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下=Premix Taq Version2.010 ii L，上游引物(IOmM) I y L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,補(bǔ) ddH20 至 20 y L，混合均勻后，94°C 2min ；94°C 30sec，退火溫度 30sec，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 退火溫度:pDGSL719_2/pS48 引物體系 68.5°C, pDGSL313-l/pS48 引物體系 64°C，pL281/pS48 引物體系 64。。。
[0164]以DNA2為模板進(jìn)行pL281/pS48引物體系擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下:Premix TaqVersion2.010 ii L，上游引物(IOmM) I U L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,補(bǔ) ddH20 至20 u L,混合均勻后，94 0C 2min ；94 °C 30sec,退火溫度 30sec，72 °C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 退火溫度:pL281/pS48 引物體系 64。。。
[0165]pDGSL719-2/pS48 引物擴(kuò)增的產(chǎn)物采用 DNA Screening kit (QIAxcel)卡夾執(zhí)行AL300程序進(jìn)行核酸分析；pL281/pS48引物擴(kuò)增的產(chǎn)物和pDGSL313_l/pS48引物擴(kuò)增的產(chǎn)物采用DNA High Resolution kit卡夾(QIAxcel)執(zhí)行分辨率適當(dāng)?shù)?M500程序進(jìn)行核酸分析。
[0166]云南省大理白族自治州祥云縣松茸經(jīng)按順序依次進(jìn)行pDGSL719-2/pS48、pDGSL313-l/pS48、pL281/pS48引物體系擴(kuò)增得到的DNA指紋圖譜見(jiàn)圖19至圖22。
[0167]圖19圖注:M:DNA Size Marker,大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道,使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大??；01_06為樣品標(biāo)號(hào).[0168]圖19圖譜特征:pDGSL719-2/pS48引物擴(kuò)增無(wú)條帶。
[0169]圖20圖注:M:DNA Size Marker，大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道,使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大小；01_06為樣品標(biāo)號(hào)；三角形標(biāo)注的地方表示此大小的條帶為樣品間共有條帶。
[0170]圖20圖譜特征:pDGS`L313-l/pS48引物擴(kuò)增僅有273bp條帶。
[0171]圖21圖注:M:DNA Size Marker，大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道,使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大小；01_06為樣品標(biāo)號(hào)；三角形標(biāo)注的地方表示此大小的條帶為樣品間共有條帶。
[0172]圖21圖譜特征:pL281/pS48引物擴(kuò)增一定具有100、210bp條帶，沒(méi)有155bp的條帶。
[0173]圖22圖注:M:DNA Size Marker，大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道,使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大??；01_06為樣品標(biāo)號(hào)。
[0174]圖22圖譜特征:經(jīng)EcoR V酶切+pL281/pS48引物后，一定呈現(xiàn)固定的由100、155、210、600、620、800bp條帶構(gòu)成的結(jié)構(gòu)圖譜。
[0175]綜合圖19至圖22的圖譜特征，即為云南省大理白族自治州祥云縣松茸的DNA產(chǎn)地屬性的指紋圖譜，此組圖譜信息可為云南省大理白族自治州祥云縣松茸的產(chǎn)地溯源提供參考依據(jù)。
[0176]實(shí)施例7[0177]松茸樣本:6個(gè)來(lái)自云南省迪慶藏族自治州香格里拉縣的新鮮松茸子實(shí)體。
[0178]DNA提取:分別取菌褶部分500mg，以一個(gè)子實(shí)體用一個(gè)指套放入一次性PE手套為原則，放入一次性的指套中搶碎；移入Tissue DNA Purification Kit (promega)的放樣孔中，用promega Maxwel116核酸自動(dòng)提取儀提取DNA,得到模板DNAl。
[0179]將提取的DNA 進(jìn)行如下酶切反應(yīng):10 X QuickCut? Buffer (TaKaRa) I U L,QuickCut? EcoR V (TaKaRa)0.2WL，DNAl WL，補(bǔ) ddH20 至 IOli L，混合均勻后，37°C IOmin,得到模板DNA2。
[0180]以DNAl 為模板按順序依次進(jìn)行 pDGSL719-2/pS48、pDGSL313_l/pS48、pL281/PS48引物體系的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下=Premix Taq Version2.010 ii L，上游引物(IOmM) I U L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,補(bǔ) ddH20 至 20 y L，混合均勻后，94°C 2min ；、94°C 30sec，退火溫度 30sec，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 退火溫度:pDGSL719_2/pS48 引物體系 68.5°C, pDGSL313-l/pS48 引物體系 64°C，pL281/pS48 引物體系 64。。。
[0181]以DNA2為模板進(jìn)行pL281/pS48引物體系擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下:Premix TaqVersion2.010 ii L，上游引物(IOmM) I U L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,補(bǔ) ddH20 至20 u L,混合均勻后，94 0C 2min ；94 °C 30sec,退火溫度 30sec，72 °C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 退火溫度:pL281/pS48 引物體系 64。。。
[0182]pDGSL719-2/pS48 引物擴(kuò)增的產(chǎn)物采用 DNA Screening kit (QIAxcel)卡夾執(zhí)行AL300程序進(jìn)行核酸分析；pL281/pS48引物擴(kuò)增的產(chǎn)物和pDGSL313_l/pS48引物擴(kuò)增的產(chǎn)物采用DNA High Resolution kit卡夾(QIAxcel)執(zhí)行分辨率適當(dāng)?shù)?M500程序進(jìn)行核酸分析。
[0183]云南省迪慶藏族自治州香格里拉縣松茸經(jīng)按順序依次進(jìn)行pDGSL719_2/pS48、pDGSL313-l/pS48、pL281/pS48引物體系擴(kuò)增得到的DNA指紋圖譜見(jiàn)圖23至圖26。
[0184]圖23圖注:M:DNA Size Marker，大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道,使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大小；01_06為樣品標(biāo)號(hào).[0185]圖23圖譜特征:pDGSL719-2/pS48引物擴(kuò)增無(wú)條帶。
[0186]圖24圖注:M:DNA Size Marker,大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道,使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大?。?1_06為樣品標(biāo)號(hào)；三角形標(biāo)注的地方表示此大小的條帶為樣品間共有條帶。
[0187]圖24圖譜特征:pDGSL313-l/pS48引物擴(kuò)增僅有273bp條帶。
[0188]圖25圖注:M:DNA Size Marker，大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道,使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大??；01_06為樣品標(biāo)號(hào)；三角形標(biāo)注的地方表示此大小的條帶為樣品間共有條帶。
[0189]圖25圖譜特征:pL281/pS48引物擴(kuò)增無(wú)IOObp條帶，具有210bp和155bp的條帶。
[0190]圖26圖注:M:DNA Size Marker，大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道,使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大小；01_06為樣品標(biāo)號(hào)。
[0191]圖26圖譜特征:經(jīng)EcoR V酶切+pL281/pS48引物擴(kuò)增后始終不會(huì)出現(xiàn)IOObp的條帶，部分樣本大于250bp以上的片段全部消失。
[0192]綜合圖23至圖26的圖譜特征，即為云南省迪慶藏族自治州香格里拉縣松茸的DNA產(chǎn)地屬性的指紋圖譜，此組圖譜信息可為云南省迪慶藏族自治州香格里拉縣松茸的產(chǎn)地溯源提供參考依據(jù)。
[0193]實(shí)施例8
[0194]松茸樣本:6個(gè)來(lái)自云南省麗江市納西族自治縣玉龍石鼓鎮(zhèn)的新鮮松茸子實(shí)體。
[0195]DNA提取:分別取菌褶部分500mg，以一個(gè)子實(shí)體用一個(gè)指套放入一次性PE手套為原則，放入一次性的指套中搶碎；移入Tissue DNA Purification Kit (promega)的放樣孔中，用promega Maxwel116核酸自動(dòng)提取儀提取DNA,得到模板DNAl。
[0196]10XQuickCut? Buffer (TaKaRa)Iu L,10XQuickCut? Buffer (TaKaRa)Iu L,，QuickCut?EcoR V (TaKaRa)0.1u L,QuickCut? Sph I (TaKaRa)0.1u L，DNA1u L，補(bǔ) ddH20至10 ii L，混合均勻后，37°C IOmin,得到模板DNA2。
[0197]以DNAl 為模板按順序依次進(jìn)行 pDGSL719-2/pS48、pDGSL313_l/pS48、pL281/PS48引物體系的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下=Premix Taq Version2.010 ii L，上游引物(IOmM) I U L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,補(bǔ) ddH20 至 20 y L，混合均勻后，94°C 2min ；94°C 30sec，退火溫度 30sec，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 退火溫度:pDGSL719_2/pS48 引物體系 68.5°C, pDGSL313-l/pS48 引物體系 64°C，pL281/pS48 引物體系 64。。。
[0198]以DNA2為模板進(jìn)行pL281/pS48引物體系擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下:Premix TaqVersion2.010 ii L，上游引物(IOmM) I U L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,補(bǔ) ddH20 至20 u L,混合均勻后，94 0C 2min ；94 °C 30sec,退火溫度 30sec，72 °C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 退火溫度:pL281/pS48 引物體系 64。。。
[0199]pDGSL719-2/pS48 引物擴(kuò)增的產(chǎn)物采用 DNA Screening kit (QIAxcel)卡夾執(zhí)行AL300程序進(jìn)行核酸分析；pL281/pS48引物擴(kuò)增的產(chǎn)物和pDGSL313_l/pS48引物擴(kuò)增的產(chǎn)物采用DNA High Resolution kit卡夾(QIAxcel)執(zhí)行分辨率適當(dāng)?shù)?M500程序進(jìn)行核酸分析。
[0200]云南省麗江市納西族自治縣玉龍石鼓鎮(zhèn)松茸經(jīng)按順序依次進(jìn)行PDGSL719-2/pS48、pDGSL313-l/pS48、pL281/pS48引物體系擴(kuò)增得到的DNA指紋圖譜見(jiàn)圖27至30。
[0201]圖27圖注:M:DNA Size Marker，大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道,使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大小；01_06為樣品標(biāo)號(hào).[0202]圖27圖譜特征:pDGSL719_2/pS48引物擴(kuò)增無(wú)條帶。
[0203]圖28圖注:M:DNA Size Marker，大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道,使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大??；01_06為樣品標(biāo)號(hào)；三角形標(biāo)注的地方表示此大小的條帶為樣品間共有條帶。[0204]圖28圖譜特征:pDGSL313_l/pS48引物擴(kuò)增僅有273bp條帶。
[0205]圖29圖注:M:DNA Size Marker，大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道,使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大?。?1_06為樣品標(biāo)號(hào)；三角形標(biāo)注的地方表示此大小的條帶為樣品間共有條帶。
[0206]圖29圖譜特征:pL281/pS48引物擴(kuò)增無(wú)IOObp條帶，具有210bp和155bp的條帶。
[0207]圖30圖注:M:DNA Size Marker ，大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道,使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大?。?1_06為樣品標(biāo)號(hào)。
[0208]圖30圖譜特征:經(jīng)EcoR V+Sph I酶切+pL281/pS48引物擴(kuò)增后，大于250bp以上的片段全部消失，僅在100、155、210、250bp處出現(xiàn)條帶。
[0209]綜合圖27至圖30的圖譜特征即為云南省麗江市納西族自治縣玉龍石鼓鎮(zhèn)松茸的DNA產(chǎn)地屬性的指紋圖譜，此組圖譜信息將來(lái)可為云南省麗江市納西族自治縣玉龍石鼓鎮(zhèn)松茸的產(chǎn)地溯源提供參考數(shù)據(jù)。
[0210]實(shí)施例9
[0211]松茸樣本:6個(gè)來(lái)自云南省怒江傈僳族自治州蘭坪白族普米族自治縣的新鮮松茸子實(shí)體。
[0212]DNA提取:分別取菌褶部分500mg，以一個(gè)子實(shí)體用一個(gè)指套放入一次性PE手套為原則，放入一次性的指套中搶碎；移入Tissue DNA Purification Kit (promega)的放樣孔中，用promega Maxwel116核酸自動(dòng)提取儀提取DNA,得到模板DNAl。
[0213]將提取的DNA 進(jìn)行如下酶切反應(yīng):10 X QuickCut? Buffer (TaKaRa) I U L,,10XQuickCut?Buffer (TaKaRa)I u L, QuickCut? EcoR V (TaKaRa)0.1 u L, QuickCut? SphI (TaKaRa) 0.1 u L, DNAl u L,補(bǔ) ddH20 M 10 u L,混合均勻后，37°C IOmin,得到模板 DNA2。
[0214]以DNAl 為模板按順序依次進(jìn)行 pDGSL719-2/pS48、pDGSL313_l/pS48、pL281/PS48引物體系的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下=Premix Taq Version2.010 ii L，上游引物(IOmM) I U L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,補(bǔ) ddH20 至 20 y L，混合均勻后，94°C 2min ；94°C 30sec，退火溫度 30sec，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 退火溫度:pDGSL719_2/pS48 引物體系 68.5°C, pDGSL313-l/pS48 引物體系 64°C，pL281/pS48 引物體系 64。。。
[0215]以DNA2為模板進(jìn)行pL281/pS48引物體系擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下:Premix TaqVersion2.010 ii L，上游引物(IOmM) I U L，下游引物(IOmM) I u L, DNA2 u L,補(bǔ) ddH20 至20 u L,混合均勻后，94 0C 2min ；94 °C 30sec,退火溫度 30sec，72 °C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 退火溫度:pL281/pS48 引物體系 64。。。
[0216]pDGSL719-2/pS48 引物擴(kuò)增的產(chǎn)物采用 DNA Screening kit (QIAxcel)卡夾執(zhí)行AL300程序進(jìn)行核酸分析；pL281/pS48引物擴(kuò)增的產(chǎn)物和pDGSL313_l/pS48引物擴(kuò)增的產(chǎn)物采用DNA High Resolution kit卡夾(QIAxcel)執(zhí)行分辨率適當(dāng)?shù)?M500程序進(jìn)行核酸分析。
[0217]云南省怒江傈僳族自治州蘭坪白族普米族自治縣松茸經(jīng)按順序依次進(jìn)行pDGSL719-2/pS48、pDGSL313_l/pS48、pL281/pS48引物體系擴(kuò)增得到的DNA指紋圖譜見(jiàn)圖31 至 34。
[0218]圖31圖注:M:DNA Size Marker，大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道,使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大小；01_06為樣品標(biāo)號(hào).[0219]圖31圖譜特征:pDGSL719-2/pS48引物擴(kuò)增無(wú)條帶。
[0220]圖32圖注:M:DNA Size Marker，大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道,使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大??；01_06為樣品標(biāo)號(hào)；三角形標(biāo)注的地方表示此大小的條帶為樣品間共有條帶。
[0221]圖32圖譜特征:pDGSL313-l/pS48引物擴(kuò)增僅有273bp條帶。
[0222]圖33 圖注:DNA Size Marker ;每一個(gè)泳道都有的 15bp 和 1000bp 為 AlignmentMarker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道，使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大小。三角形標(biāo)注的地方表示此大小的條帶為樣品間共有條帶，角型括符標(biāo)注的地方某些產(chǎn)地特有的一段區(qū)間內(nèi)的擴(kuò)增條帶系列。
[0223]圖33圖譜特征:pL281/pS48引物擴(kuò)增一定具有100、620、210bp條帶，且在210-620bp間有其他多態(tài)性擴(kuò)增條帶，但同一地區(qū)樣本間無(wú)共有性。
[0224]圖34圖注:M:DNA Size Marker，大小單位為bp ;每一個(gè)泳道都有的15bp和1000bp為Alignment Marker,不是PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物，作用是為了對(duì)齊每一個(gè)泳道,使PCR產(chǎn)物的電泳條帶能夠準(zhǔn)確錨定于DNA Size Marker區(qū)間里，以便準(zhǔn)確讀出產(chǎn)物大小；01_06為樣品標(biāo)號(hào)。
[0225]圖34圖譜特征:經(jīng)EcoR V+Sph I酶切+pL281/pS48引物擴(kuò)增后，具有600bp、620、800bp的條帶,多態(tài)性擴(kuò)增條帶區(qū)間消失。
[0226]綜合圖31至圖34的圖譜特征即為云南省怒江傈僳族自治州蘭坪白族普米族自治縣松茸的DNA產(chǎn)地屬性的指紋圖譜，此組圖譜信息將來(lái)可為云南省怒江傈僳族自治州蘭坪白族普米族自治縣松茸的產(chǎn)地溯源提供參考數(shù)據(jù)。
[0227]運(yùn)用pL281/pS48引物的指紋圖譜總結(jié)
[0228]pL281/pS48引物得到的多態(tài)性較高，為了便于理解由此得到的圖譜特征，用下述表格進(jìn)行總結(jié)。
[0229]表1運(yùn)用pL281/pS48引物的指紋圖譜總結(jié)
【權(quán)利要求】
1.一種云南省松茸的產(chǎn)地屬性DNA指紋圖譜的建立方法，使用以下pL281/pS48引物、 pDGSL313-l/pS48引物、pDGSL719_2/pS48引物的引物序列，引物序列分別為:pL281:
CTTCACATATACTGGGCATCAGCAAGGG ；pS48:
GAGGTGGGGAAAAATATGGGACGAAC ;pDGSL313_l:
CGATGTATGTGGCTGTGCCAGTACCAT ;pDGSL719_2: TGGGCCGCCCTTGATGGCTCATATT ;其特征在于，包括如下步驟: 1)樣品DNA提取:對(duì)云南各松茸產(chǎn)區(qū)的松茸樣品進(jìn)行DNA提?。? 2)按順序使用pL281/pS48 引物、pDGSL313-l/pS48 引物、pDGSL719_2/pS48 引物對(duì)提取的松茸樣品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 3)運(yùn)用QIAxcel全自動(dòng)DNA分析系統(tǒng)進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè)； 4)獲得云南松茸的產(chǎn)地特征屬性DNA指紋圖譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種云南省松茸的產(chǎn)地屬性DNA指紋圖譜的建立方法，其特征在于，該方法的具體參數(shù)為， 1)樣品DNA提取:取每個(gè)地區(qū)的鮮松茸樣本菌褶部分500mg，以一個(gè)子實(shí)體用一個(gè)指套放入一次性PE手套為原則，放入一次性指套中捻碎；必須選擇使用非過(guò)柱離心的可破碎細(xì)胞壁的商業(yè)DNA提取試劑盒提取新鮮樣本的DNA ； 2)按順序使用pL281/pS48 引物、pDGSL313-l/pS48 引物、pDGSL719_2/pS48 引物對(duì)提取的松茸樣品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；其中，PCR的反應(yīng)體系和檢測(cè)條件:Premix TaqVersion2.0lO y L，上游引物 0.5 y M，下游引物 0.5 y M，DNA25_50ng，補(bǔ) ddH20 至 20 y L，混合均勻后，94°C 2min ；94°C 30sec，退火溫度 30sec，72°C lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 退火溫度:pL281/pS48 引物體系 64°C，pDGSL313-l/pS48 引物體系 64°C，pDGSL719_2/pS48 引物體系 68.5 °C ； 3)運(yùn)用QIAxcel全自動(dòng)DNA分析系統(tǒng)進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè):pDGSL719_2/pS48引物擴(kuò)增的產(chǎn)物采用DNA Screening kit卡夾執(zhí)行AL300程序進(jìn)行核酸分析；pL281/pS48引物擴(kuò)增的產(chǎn)物和pDGSL313-l/pS48引物擴(kuò)增的產(chǎn)物采用DNA High Resolution kit卡夾執(zhí)行分辨率適度的0M500程序進(jìn)行核酸分析； 4)獲得云南省松茸的產(chǎn)地特征屬性DNA指紋圖譜。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種云南省松茸的產(chǎn)地屬性DNA指紋圖譜的建立方法，其特征在于，按照該步驟即得到云南省大理白族自治州劍川縣東山鄉(xiāng)、云南省楚雄彝族自治州南華縣五街鎮(zhèn)地區(qū)的松茸產(chǎn)地屬性DNA指紋圖譜。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種云南省松茸的產(chǎn)地屬性DNA指紋圖譜的建立方法，其特征在于，該方法在步驟3)后還包括如下步驟: a)單酶限制性酶切體系:10XQuickCut?Buffer I u L, QuickCut? EcoR V0.1 u L,DNA25-50ng,補(bǔ) ddH20 M 10 u L,混合均勻后，37°C IOmin ； b)再次進(jìn)行pL281/pS48的PCR反應(yīng)體系:限制性酶切體系10ii L，Premix TaqVersion2.09.8 y L，上游引物 0.5 y M，下游引物 0.5 y M ; 即得到云南省大理白族自治州劍川縣老君山上蘭鄉(xiāng)、云南省大理白族自治州喜州鎮(zhèn)、云南省大理白族自治州賓川縣、云南省大理白族自治州祥云縣、云南省迪慶藏族自治州香格里拉縣的松茸產(chǎn)地屬性DNA指紋圖譜。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種云南省松茸的產(chǎn)地屬性DNA指紋圖譜的建立方法，其特征在于，該方法在步驟3)后還包括如下步驟: a)混合酶限制性酶切體系:10XQuickCut? Bufferl u L, 10 X QuickCut? Bufferl u L,QuickCut? EcoR V0.1 u L, QuickCut? Sph 10.1 u L, DNAl u L,補(bǔ) ddH20 M 10 u L,混合均勻后，37°C IOmin ； b)再次進(jìn)行pL281/pS48的PCR反應(yīng)體系:限制性酶切體系10ii L，Premix TaqVersion2.09.8 y L，上游引物 0.5 y M，下游引物 0.5 y M ; 即得到云南省怒江傈僳族自治州蘭坪白族普米族自治縣和云南省麗江市納西族自治縣玉龍石鼓鎮(zhèn)的松茸產(chǎn)地屬性DNA指紋圖譜。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103571966SQ201310594661
【公開(kāi)日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月21日
【發(fā)明者】陳麗萍, 陳蕓, 劉忠民, 趙永昌, 陳立佼, 陳衛(wèi)民, 李樹(shù)紅, 岳亮亮, 李旻, 丁元明, 楊玲春, 滕平, 王裔耿, 李云飛, 殷紅, 陳宏仙, 顏慶, 傅士華 申請(qǐng)人:云南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心