一種用于裂解紅細(xì)胞的組合物、紅細(xì)胞裂解試劑及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于裂解紅細(xì)胞的組合物、紅細(xì)胞裂解試劑及應(yīng)用。本發(fā)明首先提供一種用于裂解紅細(xì)胞的組合物，其是由氯化銨、碳酸氫鹽、乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸鹽、裂解輔助劑組成的，其質(zhì)量比為800-820：80-100：0.3-3：2-10。本發(fā)明還提供了一種紅細(xì)胞裂解試劑，其是由上述的用于裂解紅細(xì)胞的組合物溶解于水得到的。本發(fā)明還提供了上述紅細(xì)胞裂解試劑在裂解生物樣本中的紅細(xì)胞中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案不僅解決了單獨(dú)使用NH4Cl時(shí)紅細(xì)胞裂解效率和樣本兼容性低的問(wèn)題，而且還消除了單獨(dú)使用表面活性劑對(duì)血細(xì)胞表面和內(nèi)部抗原檢測(cè)的不良影響，并提高了操作的可控制性。
【專利說(shuō)明】一種用于裂解紅細(xì)胞的組合物、紅細(xì)胞裂解試劑及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于裂解紅細(xì)胞的組合物、紅細(xì)胞裂解試劑及應(yīng)用，屬于生物材料【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]血液和造血組織中的細(xì)胞與功能分子是血液學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域的主要研究對(duì)象。近些年來(lái)，隨著基礎(chǔ)科學(xué)的飛速發(fā)展和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的日新月異，這些領(lǐng)域的研究?jī)?nèi)容和范疇不斷地深入與擴(kuò)大，為臨床診斷水平的提高奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。其中，以流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry Method, FCM)、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-Time Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)、突光原位雜交(Fluorescence in situ Hybridization, FISH)為代表的一系列先進(jìn)技術(shù)，已逐漸成為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，以及臨床診斷中不可或缺的重要技術(shù)手段之一，發(fā)揮著血液分析儀等常規(guī)診斷設(shè)備無(wú)法實(shí)現(xiàn)的、更為精準(zhǔn)的檢測(cè)用途。
[0003]FCM技術(shù)在免疫功能評(píng)價(jià)、血液腫瘤的診斷與分型、治療方案選擇與預(yù)后判斷、藥物敏感性篩選和發(fā)病機(jī)理研究等方面都發(fā)揮著重要作用；特別是干細(xì)胞研究及臨床應(yīng)用中，F(xiàn)CM檢測(cè)與監(jiān)測(cè)⑶34+細(xì)胞群比例是最為常規(guī)和必需的技術(shù)手段。RT-PCR技術(shù)則在基因水平對(duì)機(jī)體病毒感染實(shí)現(xiàn)了高靈敏度和高特異性的體外篩查。FISH技術(shù)不僅可用于已知基因或序列的染色體定位，還可用于未克隆基因或遺傳標(biāo)記及染色體畸變的研究，在基因定性、定量、整合、表達(dá)等方面的研究中具有明顯優(yōu)勢(shì)。這些聞新技術(shù)在為實(shí)驗(yàn)室和臨床提供重要參數(shù)的同時(shí)，其自身作為檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，特別是其在診斷應(yīng)用中的質(zhì)量控制成為了關(guān)鍵環(huán)節(jié)。衛(wèi) 生部臨床檢驗(yàn)中心專家在《分子診斷質(zhì)量控制面臨的問(wèn)題》(胡麗濤等，臨床檢驗(yàn)雜志，2012，30 (6):466-467) —文中詳細(xì)闡釋了這一問(wèn)題。此外，美國(guó)病理學(xué)家學(xué)會(huì)(College of American Pathologists, CAP)作為診斷檢驗(yàn)的權(quán)威機(jī)構(gòu),制定了一整套較為完整的檢測(cè)技術(shù)質(zhì)量控制程序指南和實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量監(jiān)控條例，該指南和條例從取材送材，到樣本前處理、上機(jī)等，對(duì)檢測(cè)所涉及技術(shù)的各個(gè)環(huán)節(jié)都作了詳細(xì)規(guī)定。
[0004]所謂樣本前處理，是指在實(shí)施檢測(cè)方法之前，必須對(duì)生物樣本在體外進(jìn)行適宜的前處理操作，這一操作是保證這些技術(shù)實(shí)施效果的關(guān)鍵性步驟，將對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生較大影響。以上述三種最為常用的新型技術(shù)為例，生物樣本的前處理操作主要涉及對(duì)樣本中大量紅細(xì)胞的有效去除，這一目標(biāo)可以通過(guò)兩種途徑得以實(shí)現(xiàn):(I)選用合適的紅細(xì)胞裂解試劑(Red Blood Cell lysis agent)，以一定比例的濃度與生物樣本共孵育10-15分鐘，成熟紅細(xì)胞將發(fā)生裂解，其它細(xì)胞受到最小程度的影響；(2)密度梯度離心法分離處理，將血液或經(jīng)過(guò)消化后的組織單細(xì)胞懸液小心鋪在密度梯度介質(zhì)上，經(jīng)歷30-45分鐘離心后收獲細(xì)胞層。由于裂解法操作簡(jiǎn)單，并最大程度保持原始白細(xì)胞各項(xiàng)生物學(xué)參數(shù)和形態(tài)，是目前應(yīng)用最多的方法。例如，劉廣印等報(bào)道了不同白細(xì)胞提取方法對(duì)于RT-PCR法檢測(cè)巨細(xì)胞病毒的對(duì)比研究，結(jié)果顯示氯化銨裂解法和密度梯度離心法得到的結(jié)果沒(méi)有顯著性差異，但前者由于操作簡(jiǎn)便，用時(shí)短，而成為了優(yōu)選(劉廣印等，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)巨細(xì)胞病毒兩種白細(xì)胞提取方法對(duì)比分析，淮海醫(yī)藥，2007，25(2):95-96)。又例如，田志華等人在研究大鼠前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中波形纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化和波形纖維蛋白基因表達(dá)的研究時(shí)，使用基于氯化銨配方的紅細(xì)胞裂解液對(duì)大鼠脂肪組織進(jìn)行紅細(xì)胞裂解操作，然后對(duì)培養(yǎng)后的脂肪細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光觀察和原位雜交(田志華等，大鼠前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中波形纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化和波形纖維蛋白基因表達(dá)的研究，遺傳學(xué)報(bào)，2003，30(12):1113-1117)。
[0005] 紅細(xì)胞裂解試劑的應(yīng)用范圍很廣，不僅包括人的外周血、臍帶血、骨髓等臨床樣本，還包括小鼠、大鼠、犬類、靈長(zhǎng)類動(dòng)物的外周血、骨髓、脾臟等動(dòng)物類樣本。實(shí)現(xiàn)快速、有效、完全的去除紅細(xì)胞，并提高樣本類型的兼容性是這一試劑在應(yīng)用上追求的目標(biāo)。此外，紅細(xì)胞裂解試劑應(yīng)在最大程度裂解紅細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)白細(xì)胞造成最小程度的影響。
[0006]目前在售的紅細(xì)胞裂解試劑既有進(jìn)口試劑也有國(guó)產(chǎn)試劑，其配方較多，但主要是基于Saas等人于1979年所開(kāi)發(fā)的以氯化銨為主成分的水溶液。這類配方多為三元組分，其中氯化銨在各配方中比例有所不同，其它添加成分多為碳酸氫鹽和乙二胺四乙酸或其衍生物，例如碳酸氫鉀和乙二胺四乙酸二鈉。然而，紅細(xì)胞裂解試劑的多種配方在使用上均存在一定的問(wèn)題，這也在大量文獻(xiàn)中得到了報(bào)道。此外，由于產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)和配方各異，對(duì)于樣本的前處理而言，使用不同廠家、不同配方所得到的處理效果也差別較大，這對(duì)于細(xì)胞樣本下游的檢測(cè)分析和應(yīng)用存在不良影響，特別對(duì)于檢測(cè)和分析檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制的可實(shí)施性和室間質(zhì)量評(píng)價(jià)(External Quality Assessment, EQA)是十分不利的。
[0007]紅細(xì)胞裂解試劑在使用上的第一個(gè)問(wèn)題是紅細(xì)胞去除不完全和樣本兼容性不佳，這對(duì)于細(xì)胞樣本下游的檢測(cè)分析和應(yīng)用存在明確的不良影響。例如專利申請(qǐng)201210379985.4中所提及的細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記時(shí)，抗體識(shí)別很容易受到血液中殘留紅細(xì)胞的影響；又例如宋文剛等也報(bào)道了流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行CD34+細(xì)胞監(jiān)測(cè)時(shí)，關(guān)鍵是保證紅細(xì)胞的裂解完全，否則很難分清有核細(xì)胞和紅細(xì)胞的界限，容易使數(shù)據(jù)發(fā)生偏差(宋文剛等，動(dòng)員外周血CD34陽(yáng)性細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定中的策略探討，中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2002，10 (4):347-350);又例如ALDAGEN公司的干細(xì)胞檢測(cè)產(chǎn)品ALDEFLU0R說(shuō)明書(shū)中明確提示使用氯化銨配方的紅細(xì)胞裂解試劑對(duì)外周血進(jìn)行紅細(xì)胞裂解時(shí)需要執(zhí)行兩次，以確保紅細(xì)胞被完全去除，不影響后續(xù)試驗(yàn)；然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的是，執(zhí)行兩次裂解及相應(yīng)的洗滌，將會(huì)造成部分細(xì)胞丟失，進(jìn)而造成實(shí)驗(yàn)誤差，例如劉艷榮在“流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)⑶34陽(yáng)性細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化與質(zhì)量控制，中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液雜志，2000，8 (4): 302-306.”中明確指出了這一問(wèn)題，并提出樣本制備過(guò)程的這些差異將會(huì)影響CD34陽(yáng)性細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化與質(zhì)量控制。此外，現(xiàn)有的紅細(xì)胞裂解試劑在樣本兼容性上也存在一定問(wèn)題，不同類型的血液樣本對(duì)紅細(xì)胞裂解試劑的表現(xiàn)相差迥異，例如Bautista ML等在研究紅細(xì)胞滲透脆性的研究中，發(fā)現(xiàn)丙三醇誘發(fā)的溶血試驗(yàn)中，臍帶血比成年人外周血發(fā)生50%溶解的時(shí)間要顯著更長(zhǎng)，P〈0.0001(Bautista ML 等，Cord blood red cell osmotic fragility:a comparison betweenpreterm and full-term newborn infants, Early Hum Dev, 2003，72 (I): 37-46);這提不對(duì)于不同生物樣本，紅細(xì)胞裂解的難易程度存在較大差異，臍帶血中的紅細(xì)胞比外周血可能更難于發(fā)生裂解，這不僅在紅細(xì)胞裂解試劑的品種選擇上引入了困難，也為實(shí)驗(yàn)操作的標(biāo)準(zhǔn)化帶來(lái)了障礙。又例如專利申請(qǐng)200880024758.1中所提及的現(xiàn)象，即由于紅細(xì)胞裂解試劑無(wú)法裂解有核紅細(xì)胞而給白細(xì)胞分析帶來(lái)誤差。再例如ALDAGEN公司的干細(xì)胞檢測(cè)產(chǎn)品ALDEFLUOR說(shuō)明書(shū)中明確指出，為保證紅細(xì)胞的有效去除，使用氯化銨配方的紅細(xì)胞裂解試劑對(duì)骨髓和臍帶血樣本進(jìn)行處理時(shí)，條件是不同的，應(yīng)嚴(yán)格按產(chǎn)品配套的不同實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行操作。再例如Lonza公司的著名產(chǎn)品ACK lysing buffer的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中明確指出，這一產(chǎn)品是針對(duì)人或小鼠的淋巴細(xì)胞制備液設(shè)計(jì)，而不是針對(duì)全血設(shè)計(jì)的；瑞士 Lonza公司的產(chǎn)品ACK lysing buffer的配方是氯化銨-碳酸氫鉀-乙二胺四乙酸二鈉，Lonza對(duì)其產(chǎn)品做出明確的適用性限制是有其原因的，這一配方的紅細(xì)胞裂解試劑很難同時(shí)滿足有效性和樣本兼容性。綜上，如何提高紅細(xì)胞裂解試劑的樣本兼容性，實(shí)現(xiàn)快速、穩(wěn)定、完全的去除不同類型生物樣本中的紅細(xì)胞是本領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。 [0008]紅細(xì)胞裂解試劑在使用上的第二個(gè)問(wèn)題是對(duì)紅細(xì)胞以外的細(xì)胞造成較大影響，特別對(duì)于豐度較低的細(xì)胞研究而言是非常不利的。例如，Menendenz等1998年報(bào)道了 Becton Dikinson公司的產(chǎn)品FACS Lysing Solution在裂解樣本中紅細(xì)胞的同時(shí)，可造成⑶34+細(xì)胞的選擇性丟失，該配方主要成分為二乙烯乙二醇(Menendez Pet al,Comparison between a lyse—and-then—wash method and a lyse—non—washtechnique for the enumeration of CD34+hematopoietic progenitor cellscytometry, 1998，34(6):264-271.)。鞏文玉等在研究骨髓移植前動(dòng)員外周血CD34+細(xì)胞相對(duì)計(jì)數(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)，使用Becton Dikinson公司的產(chǎn)品FACS Lysing Solution裂解處理后的粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的FSC、SSC信號(hào)強(qiáng)度均弱于Beckman Coulter公司的產(chǎn)品IOTest，且前者處理的標(biāo)本CD45+細(xì)胞在所有收集的信號(hào)中的百分比要高于后者，這提示IOTest的裂解作用較為溫和，但會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞污染，IOTest的配方為氯化銨、碳酸氫鉀和乙二胺四乙酸；此外，該研究還發(fā)現(xiàn)裂解后所得總白細(xì)胞數(shù)與CD34+細(xì)胞數(shù)并不存在相關(guān)關(guān)系，這些現(xiàn)象均提示裂解液的配方對(duì)于預(yù)測(cè)輸注給受者的⑶34+細(xì)胞量存在重大影響，主要原因在于CD34+細(xì)胞含量很低，其檢測(cè)結(jié)果可能對(duì)任何可能造成微小變異的因素均很敏感，特別是紅細(xì)胞裂解這一操作(鞏玉文等，紅細(xì)胞裂解液對(duì)CD34+細(xì)胞相對(duì)計(jì)數(shù)的影響，中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2010，18 (3):762-765.)。崔巍等人在分析小鼠外周血免疫細(xì)胞的研究中嘗試了自行配制的紅細(xì)胞裂解試劑，其配方為8.3g氯化銨、1.0g碳酸氫鉀和
1.8ml5%乙二胺四乙酸溶解于800ml水中，結(jié)果顯示其適用于免疫細(xì)胞表型研究和細(xì)胞內(nèi)因子研究，但對(duì)裂解時(shí)間要進(jìn)行嚴(yán)格控制，且很難掌握，需肉眼觀察紅細(xì)胞懸液從模糊至清晰，即立即停止裂解，否則會(huì)影響粒細(xì)胞分析(崔巍等，流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠外周血免疫細(xì)胞全血裂解試劑比較研究，中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2011，19(2):491-495.)。Sue Chow等人對(duì)多種非離子型表面活性劑對(duì)紅細(xì)胞的裂解作用做了嘗試，結(jié)果顯示TritonX-100、NP-40、Brij-58三種表面活性劑在孵育10分鐘后表現(xiàn)出了裂解紅細(xì)胞的能力，但當(dāng)這些表面活性劑超過(guò)0.2%濃度時(shí)會(huì)對(duì)白細(xì)胞的光散射角產(chǎn)生不良影響，而小于0.1%的濃度又會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞裂解不完全，由此得到結(jié)論0.1%濃度的上述表面活性劑孵育30分鐘效果最好(Sue Chow et al, Whole blood fixation and permeabilization protocolwith red blood cell lysis for flow cytometry of intracellular phosphorylatedepitopes in leukocyte subpopulations, Cytometry Part A, 2005, 67(I):4-17.),在其他濃度范圍下的效果相對(duì)差一些；而且這一方案效率較低，用時(shí)和密度梯度離心法相當(dāng)。Sue Chow等人也把使用純水裂解紅細(xì)胞作為嘗試用于其研究中，具體方法是將外周血用純水裂解30秒,然后加入高滲的溶液進(jìn)行終止(Sue Chow et al., Measurement ofMAP kinase activation by flow cytometry using phospho-specific antibodies toMEK and ERK:potential for pharmacodynamic monitoring of signal transductioninhibitors.Cytometry2001;46:72-78.),但這種方法的穩(wěn)定性不佳,對(duì)于不同生物樣本的
操作更是缺乏普遍適用的試驗(yàn)方案。 [0009]對(duì)于裂解液的配方優(yōu)化在一些文獻(xiàn)報(bào)道或?qū)＠暾?qǐng)中有所涉及，特別是依靠表面活性劑單獨(dú)直接發(fā)揮溶血作用的方案見(jiàn)諸報(bào)道，但其往往由于作用劇烈，對(duì)白細(xì)胞的多種生物學(xué)參數(shù)造成不良影響。例如專利申請(qǐng)200910177186.7中公開(kāi)了一種白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)試劑、試劑盒以及白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的方法，該試劑包括花菁類陽(yáng)離子化合物、陽(yáng)離子表面活性劑和非離子表面活性劑，其目的在于溶解紅細(xì)胞和血小板，并損傷白細(xì)胞，使白細(xì)胞各亞類產(chǎn)生形態(tài)變化，對(duì)白細(xì)胞內(nèi)部核酸物質(zhì)進(jìn)行熒光標(biāo)記；專利申請(qǐng)200910109215.6中公開(kāi)了類似的白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)試劑、試劑盒及其制備方法和白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的方法，該試劑包括花菁類熒光染料、糖苷類化合物等，該試劑的組成同以上所述的專利申請(qǐng)200910177186.7中的試劑的組成均用于白細(xì)胞的分類和計(jì)數(shù)，屬于單一用途的專屬試劑，其目的在于區(qū)分多類白細(xì)胞，因此對(duì)白細(xì)胞的散射光信息造成較大影響。具有類似用途的試劑在專利申請(qǐng)200880024758.1中也有所記載，該發(fā)明申請(qǐng)包含第I試劑和第2試劑，前者含有陽(yáng)離子型表面活性劑、非離子表面活性劑和芳香族羧酸，第2試劑含有能夠?qū)⒑怂崛旧臒晒馍?，然而與前面幾件申請(qǐng)相似的是，第I試劑的用途在于使紅細(xì)胞發(fā)生溶血的同時(shí)，對(duì)白細(xì)胞的細(xì)胞膜造成能讓熒光色素透過(guò)程度的損傷，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.03%-0.9%之間，用量較大，因此對(duì)白細(xì)胞影響較大。專利申請(qǐng)200810115932.5中公開(kāi)了一種可兼用作溶血?jiǎng)┑钠颇┘捌溆梅?，其配方由皂角苷、疊氮化鈉、多聚甲醛、磷酸鹽緩沖液組成，當(dāng)用作破膜劑時(shí)，皂角苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.1-0.5%，而用作溶血?jiǎng)r(shí)，皂角苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為
0.05%，其用作溶血?jiǎng)r(shí)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)可知，粒細(xì)胞側(cè)向散射角與對(duì)照組發(fā)生明顯變化，鑒于該試劑的組成具有雙重用途，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示單純依靠皂角苷進(jìn)行破膜作用，可能會(huì)對(duì)白細(xì)胞產(chǎn)生不良影響，其濃度很難控制，操作可控性也相對(duì)不強(qiáng)。
[0010]綜上所述，紅細(xì)胞裂解試劑存在如下問(wèn)題:
[0011](a)進(jìn)口在售產(chǎn)品價(jià)格昂貴，貨期長(zhǎng)，不利于廣泛使用，且各品牌試劑配方不同、作用機(jī)制和標(biāo)準(zhǔn)各異，導(dǎo)致紅細(xì)胞裂解的標(biāo)準(zhǔn)化操作很難實(shí)現(xiàn)；
[0012](b)裂解試劑配方對(duì)紅細(xì)胞裂解不完全，或裂解時(shí)間很難控制(操作可控制性差)，對(duì)于后續(xù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生不利影響；
[0013](C)裂解試劑配方對(duì)紅細(xì)胞以外的細(xì)胞造成較大影響，特別對(duì)于豐度較低的細(xì)胞研究而言是非常不利的，例如⑶34+造血干細(xì)胞；
[0014](d)裂解試劑的兼容性差，對(duì)于臍帶血等難于裂解的樣本表現(xiàn)不佳，缺乏普遍通用的配方可供選擇。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0015]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種用于裂解紅細(xì)胞的組合物，通過(guò)采用該組合物制成的紅細(xì)胞裂解試劑能夠快速、有效、完全地去除紅細(xì)胞，并且具有良好的生物樣本兼容性以及操作的可控制性。
[0016]本發(fā)明的目的還在于提供一種采用上述組合物制成的紅細(xì)胞裂解試劑。[0017]本發(fā)明的目的還在于提供上述紅細(xì)胞裂解試劑在裂解紅細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0018]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明首先提供了一種用于裂解紅細(xì)胞的組合物，其是由氯化銨、碳酸氫鹽、“乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸鹽”、裂解輔助劑組成的，其質(zhì)量比為800-820:80-100:0.3-3:2_10。
[0019]在上述用于裂解紅細(xì)胞的組合物中，優(yōu)選地，所采用的碳酸氫鹽為碳酸氫鉀、碳酸氫鈉或碳酸氫銨等。
[0020]在上述用于裂解紅細(xì)胞的組合物中，優(yōu)選地，所采用的乙二胺四乙酸鹽為乙二胺
四乙酸二鈉等。
[0021]在上述用于裂解紅細(xì)胞的組合物中，優(yōu)選地，所采用的表面活性劑為十二烷基三甲基氯化銨、十四烷基三甲基溴化銨、十六烷基三甲基氯化銨或十八烷基三甲基氯化銨等；更優(yōu)選為十四烷基三甲基溴化銨。[0022]在上述用于裂解紅細(xì)胞的組合物中，優(yōu)選地，該組合物是由氯化銨、碳酸氫鉀、乙二胺四乙酸二鈉和十四烷基三甲基溴化銨組成的，其質(zhì)量比為800:100:0.3:2。
[0023]本發(fā)明還提供了一種紅細(xì)胞裂解試劑，其是由上述用于裂解紅細(xì)胞的組合物溶解于水得到的。該紅細(xì)胞裂解試劑能夠用于體外裂解紅細(xì)胞。
[0024]在上述紅細(xì)胞裂解試劑中，優(yōu)選地，以重量百分比計(jì)，該紅細(xì)胞裂解試劑含有
0.80-0.82%的氯化銨、0.08-0.10%的碳酸氫鹽、0.0003-0.003%的乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸鹽、0.002-0.01%的裂解輔助劑，余量為水。
[0025]在上述紅細(xì)胞裂解試劑中，優(yōu)選地，以重量百分比計(jì)，該紅細(xì)胞裂解試劑含有
0.80%的氯化銨、0.10%的碳酸氫鉀、0.0003%的乙二胺四乙酸二鈉、0.002%的十四烷基三甲
基溴化銨，余量為水。
[0026]本發(fā)明還提供了上述紅細(xì)胞裂解試劑在裂解生物樣本中的紅細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0027]在上述應(yīng)用中，優(yōu)選地，上述生物樣本是指哺乳動(dòng)物的血液和組織細(xì)胞樣本，更優(yōu)選地，上述生物樣本包括人骨髓、人外周血、人臍帶血、小鼠骨髓樣本或小鼠脾臟樣本等。
[0028]本發(fā)明還提供了一種流式細(xì)胞術(shù)用紅細(xì)胞裂解試劑盒，其中，該試劑盒包括一盒體，該盒體內(nèi)至少設(shè)有一個(gè)裂解試劑放置區(qū)和一個(gè)洗滌試劑放置區(qū)。
[0029]在上述流式細(xì)胞術(shù)用紅細(xì)胞裂解試劑盒中，優(yōu)選地，所述盒體中還設(shè)有一個(gè)固定試劑放置區(qū)。
[0030]在上述流式細(xì)胞術(shù)用紅細(xì)胞裂解試劑盒中，優(yōu)選地，所述裂解試劑放置區(qū)設(shè)有一裂解試劑管。
[0031]在上述流式細(xì)胞術(shù)用紅細(xì)胞裂解試劑盒中，優(yōu)選地，所述裂解試劑管的容積為5OmL 或 IOOmL。
[0032]在上述流式細(xì)胞術(shù)用紅細(xì)胞裂解試劑盒中，優(yōu)選地，所述洗滌試劑放置區(qū)設(shè)有至少兩個(gè)洗滌試劑管。
[0033]在上述流式細(xì)胞術(shù)用紅細(xì)胞裂解試劑盒中，優(yōu)選地，所述洗滌試劑管的容積為10OmT,或 200mL。
[0034]在上述流式細(xì)胞術(shù)用紅細(xì)胞裂解試劑盒中，優(yōu)選地，所述固定試劑放置區(qū)設(shè)有至少兩個(gè)固定試劑管。
[0035]在上述流式細(xì)胞術(shù)用紅細(xì)胞裂解試劑盒中，優(yōu)選地，所述固定試劑管的容積為10OmT,或 200mL。
[0036]在上述試劑盒中，裂解試劑管用于盛裝十倍濃度(IOX)的紅細(xì)胞裂解試劑。該紅細(xì)胞裂解試劑可以是本發(fā)明提供的紅細(xì)胞裂解試劑，其可以具有以下成分組成:以重量百分比計(jì)，該紅細(xì)胞裂解試劑含有8.0-8.2%的氯化銨、0.8-1.0%的碳酸氫鹽、0.003-0.03%的乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸鹽、0.02-0.1%的裂解輔助劑，余量為水。其中，碳酸氫鹽的實(shí)例包括碳酸氫鈉、碳酸氫鉀等；乙二胺四乙酸鹽的實(shí)例包括乙二胺四乙酸二鈉等；裂解輔助劑的實(shí)例包括十二烷基硫酸鈉、十二烷基三甲基氯化銨、聚山梨酯-80等。裂解輔助劑可以有效通過(guò)增加紅細(xì)胞膜滲透性而達(dá)到提升樣本兼容性的目的，這不僅提高了紅細(xì)胞的裂解效率，對(duì)不同類型的生物樣本也提供了普遍通用的配方可供選擇，有助于提高分析檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制的可實(shí)施性。洗滌試劑管用于盛裝十倍濃度(10 X )的洗滌試劑，上述洗滌試劑可以是平衡鹽溶液(PBS溶液、Hanks溶液等)或生理鹽水。該洗滌試劑同樣可以用作樣本稀釋試劑。固定試劑管用于盛裝固定試劑，上述固定試劑可以是濃度為0-4% (w/V)的多聚甲醛或甲醛的水溶液。高兼容性紅細(xì)胞裂解試劑與統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的洗滌試劑和固定試劑的組合形式為紅細(xì)胞裂解操作提供了系統(tǒng)化解決方案，這為獲得跨越時(shí)間和空間可比性的檢測(cè)數(shù)據(jù)奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
[0037]本發(fā)明提供的流式細(xì)胞術(shù)用紅細(xì)胞裂解試劑盒為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及臨床診斷中“生物樣本前處理-紅細(xì)胞裂解”這一關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)提供普遍適用、效果穩(wěn)定的系統(tǒng)化解決方案，不僅提高了執(zhí)行這一步驟的便捷程度，更有助于提高分析檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制的可實(shí)施性和室間質(zhì)量評(píng)價(jià)(External Quality Assessment, EQA)中的表現(xiàn)，以保證檢驗(yàn)結(jié)果可以最佳地符合受檢對(duì)象的實(shí)際情況，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)操作和醫(yī)療行為提供更為準(zhǔn)確的依據(jù)。
[0038]本發(fā)明所提供的用于裂解紅細(xì)胞的組合物以及紅細(xì)胞裂解試劑通過(guò)向氯化銨、碳酸氫鹽、乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸鹽組成的裂解試劑中添加特定量的十四烷基三甲基溴化銨等作為裂解輔助劑，通過(guò)增加紅細(xì)胞膜的滲透性，促進(jìn)了 NH4C1裂解紅細(xì)胞的作用效果，實(shí)現(xiàn)了快速、有效、完全地去除紅細(xì)胞，并具備良好的生物樣本兼容性和操作的可控制性，對(duì)除紅細(xì)胞外的其它細(xì)胞·造成最低程度的影響。本發(fā)明的技術(shù)方案不僅解決了單獨(dú)使用NH4C1配方時(shí)紅細(xì)胞裂解效率和樣本兼容性低的問(wèn)題，而且還消除了單獨(dú)使用表面活性劑對(duì)血細(xì)胞表面和內(nèi)部抗原檢測(cè)的不良影響，并提高了操作的可控制性。在本發(fā)明的技術(shù)方案中，十四烷基三甲基溴化銨等對(duì)NH4Cl裂解的作用方式是間接輔助性的，而非直接對(duì)紅細(xì)胞發(fā)揮裂解作用，這與現(xiàn)有技術(shù)存在很大不同。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0039]圖1a-1h為使用對(duì)照組A、對(duì)照組B、對(duì)照組C、對(duì)照組D、LA01、LA05、LA11、LA16對(duì)人外周血進(jìn)行裂解后，用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)所得細(xì)胞進(jìn)行光散射角分析結(jié)果圖；
[0040]圖2a-2h為使用對(duì)照組A、對(duì)照組B、對(duì)照組C、對(duì)照組D、LA01、LA05、LA11、LA16對(duì)人外周血進(jìn)行裂解后，用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)所得細(xì)胞進(jìn)行典型的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果圖；
[0041]圖3a-3h為使用對(duì)照組A、對(duì)照組B、對(duì)照組C、對(duì)照組D、LA01、LA05、LA11、LA16對(duì)人臍帶血進(jìn)行裂解后，用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)所得細(xì)胞進(jìn)行光散射角分析結(jié)果圖；
[0042]圖4a-4h為使用對(duì)照組A、對(duì)照組B、對(duì)照組C、對(duì)照組D、LA01、LA05、LA11、LA16對(duì)人臍帶血進(jìn)行裂解后，用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)所得細(xì)胞進(jìn)行典型的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果圖；[0043]圖5為實(shí)施例5提供的流式細(xì)胞術(shù)用紅細(xì)胞裂解試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0044]圖6為實(shí)施例6提供的流式細(xì)胞術(shù)用紅細(xì)胞裂解試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0045]附圖標(biāo)號(hào)說(shuō)明:
[0046]盒體I 裂解試劑放置區(qū)2 洗滌試劑放置區(qū)3 固定試劑放置區(qū)4裂解試劑管5 洗滌試劑管6 固定試劑管7
【具體實(shí)施方式】
[0047]為了對(duì)本發(fā)明的技術(shù)特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，現(xiàn)對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行以下詳細(xì)說(shuō)明，但不能理解為對(duì)本發(fā)明的可實(shí)施范圍的限定。
[0048]實(shí)施例1用于紅細(xì)胞裂解的組合物和液體試劑的配制通法
[0049]本實(shí)施例提供了一種用于紅細(xì)胞裂解的組合物及液體試劑的配制方法，其包括以下步驟:
[0050]在溫度為20_25°C、濕度小于60%的條件下，用萬(wàn)分之一或十萬(wàn)分之一精密度天平準(zhǔn)確稱量相應(yīng)質(zhì)量的固體原料或液體原料，置于一支50mL無(wú)菌離心管中，即得到用于紅細(xì)胞裂解的組合物；
[0051]將上述組合物充分溶解于相應(yīng)質(zhì)量的注射用水中，形成無(wú)色透明溶液；
[0052]在局部百級(jí)層流凈化條件的無(wú)菌環(huán)境中，將所得到的溶液再經(jīng)過(guò)0.22 μ m直徑的濾膜過(guò)濾到另一支50mL的無(wú)菌離心管中，即得到用于紅細(xì)胞裂解的液體試劑，4°C避光保存?zhèn)溆谩?br>
[0053]實(shí)施例2用于纟工 細(xì)胞裂解的液體試劑的組成
[0054]本實(shí)施例提供了一組用于紅細(xì)胞裂解的液體試劑，其組成如表1所示。其中，編號(hào)為 LA01、LA02、LA03、LA04、LA05、LA06、LA07、LA08、LA09、LA10、LA11、LA12、LA13、LA14、LA15的液體介質(zhì)為本發(fā)明提供的用于處理生物樣本的液體介質(zhì)一紅細(xì)胞裂解試劑，編號(hào)為L(zhǎng)A16、LA17、LA18的液體試劑為對(duì)比例，其中LA18即表示不加任何溶質(zhì)的注射用水。
[0055]表1液體試劑的組成(以重量百分比計(jì)，余量為注射用水)
[0056]
【權(quán)利要求】
1.一種用于裂解紅細(xì)胞的組合物，其是由氯化銨、碳酸氫鹽、乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸鹽、裂解輔助劑組成的，其質(zhì)量比為800-820:80-100:0.3-3:2_10。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于裂解紅細(xì)胞的組合物，其中，所述碳酸氫鹽為碳酸氫鉀、碳酸氫鈉或碳酸氫銨。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于裂解紅細(xì)胞的組合物，其中，所述乙二胺四乙酸鹽為乙二胺四乙酸二鈉。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于裂解紅細(xì)胞的組合物，其中，所述裂解輔助劑為十二烷基三甲基氯化銨、十四烷基三甲基溴化銨、十六烷基三甲基氯化銨或十八烷基三甲基氯化銨。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于裂解紅細(xì)胞的組合物，其中，該組合物是由氯化銨、碳酸氫鉀、乙二胺四乙酸二鈉和十四烷基三甲基溴化銨組成的，其質(zhì)量比為800:100:0.3:2。
6.一種紅細(xì)胞裂解試劑，其是由權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的用于裂解紅細(xì)胞的組合物溶解于水得到的。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的紅細(xì)胞裂解試劑，其中，以重量百分比計(jì)，該紅細(xì)胞裂解試劑含有0.80-0.82%的氯化銨、0.08-0.10%的碳酸氫鹽、0.0003-0.003%的乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸鹽、0.002-0.01%的裂解輔助劑，余量為水；優(yōu)選地，以重量百分比計(jì)，該紅細(xì)胞裂解試劑含有0.80%的氯化銨、0.10%的碳酸氫鉀、0.0003%的乙二胺四乙酸二鈉、0.002%的十四烷基三甲基溴化銨，余量為水。
8.權(quán)利要求6或7所述的紅細(xì)胞裂解試劑在裂解生物樣本中的紅細(xì)胞中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中，所述生物樣本包括哺乳動(dòng)物血液及組織細(xì)胞；優(yōu)選地，所述生物樣本包括人骨髓、人外周血、人臍帶血、小鼠骨髓樣本或小鼠脾臟樣本。
10.一種流式細(xì)胞術(shù)用紅細(xì)胞裂解試劑盒，其特征在于，該流式細(xì)胞術(shù)用紅細(xì)胞裂解試劑盒包括一盒體，該盒體內(nèi)至少設(shè)有一個(gè)裂解試劑放置區(qū)、一個(gè)洗滌試劑放置區(qū)、一個(gè)固定試劑放置區(qū)； 其中，所述裂解試劑放置區(qū)設(shè)有一個(gè)裂解試劑管，所述裂解試劑管的容積為50mL或1OOmL ； 所述洗滌試劑放置區(qū)設(shè)有至少兩個(gè)洗滌試劑管，所述洗滌試劑管的容積為IOOmL或200mL ； 所述固定試劑放置區(qū)設(shè)有至少兩個(gè)固定試劑管，所述固定試劑管的容積為IOOmL或200mLo
【文檔編號(hào)】C12N1/06GK103627638SQ201310585815
【公開(kāi)日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月10日
【發(fā)明者】趙侃, 王春有, 劉湘連, 甘朝, 李莉莉 申請(qǐng)人:北京東方華輝生物醫(yī)藥科技有限公司