一株海洋產(chǎn)過氧化氫酶菌及利用該菌產(chǎn)過氧化氫酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一株來源于海洋的高產(chǎn)過氧化氫酶寡養(yǎng)單胞屬菌株(Stenotrophomonasmaltophilia)，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為：CGMCC?No.8294，保藏日期2013年10月8日。該菌株生長迅速、條件簡單，底物范圍廣泛。以該菌為出發(fā)菌種，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)之后制作的粗酶品，其最高過氧化氫酶酶活力和比酶活分別可達50000U/mL和200000U/mg以上。該工藝步驟簡單，成本低廉，得到的產(chǎn)品酶活力高。過氧化氫酶可廣泛應(yīng)用于食品、紡織、造紙、工業(yè)廢水處理等領(lǐng)域，屬于海洋生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【專利說明】一株海洋產(chǎn)過氧化氫酶菌及利用該菌產(chǎn)過氧化氫酶的方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于海洋生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株來自海洋的過氧化氫酶高產(chǎn)菌株及其利用該菌發(fā)酵生產(chǎn)過氧化氫酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]過氧化氫酶(Catalase，ECl.11.1.6)是一種酶類清除劑，又稱為觸酶，是以鐵卟啉為輔基的結(jié)合酶。它可促使過氧化氫分解為分子氧和水，是催化過氧化氫分解成氧和水的酶，存在于細胞的過氧化物體內(nèi)。由于過氧化氫具有較強的氧化和漂白的功能，因此過氧化氫酶和過氧化氫作為組合在印染、造紙、環(huán)保和電子工業(yè)等領(lǐng)域具有較大的研究和應(yīng)用價值。
[0003]研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的生物細胞內(nèi)都含有過氧化氫酶。但目前用于生產(chǎn)過氧化氫酶的主要是動物的肝臟和微生物發(fā)酵。動物肝臟破胞提取的方法由于受到原材料限制，導(dǎo)致成本過高。而利用微生物發(fā)酵的方法，其優(yōu)勢在于成本較低，而酶產(chǎn)量較大。
[0004]海洋特殊的生態(tài)環(huán)境，孕育了大量的微生物和酶資源。目前授權(quán)的細菌發(fā)酵產(chǎn)過氧化氫酶專利的菌株多數(shù)分離于土壤樣品。而僅中國專利200810057969.7和201310022577.8提供了兩種分離自海洋的過氧化氫酶產(chǎn)酶菌株，并且其過氧化氫酶酶活力和比酶活都較低，分別為1200U / mg和10000U / mg。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的一個目的是提供一種能夠高產(chǎn)過氧化氫酶的菌株。
[0006]本發(fā)明提供的菌株，分類學命名為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為=CGMCC N0.8294，保藏日期2013年10月8日。
[0007]本發(fā)明所述的菌株CGMCC N0.8294特性如下:
[0008](I)生長限制因子:溫度20_40°C (最適30°C )，ρΗ7.0-9.0 (最適7.5)，鹽度0-3.5% (w / V，最適 2.0% )；
[0009](2)菌落形態(tài):菌落呈圓形，表面光滑，邊緣平整，微凸起，物色透明；
[0010](3)細胞形態(tài):革蘭氏陰性桿菌，在顯微鏡下呈現(xiàn)運動性，端生單鞭毛；
[0011](4)生理生化特性:好氧生長；觸媒活性、氧化酶活性為陽性；對青霉素、萬古霉素、鏈霉素、紅霉素、氣霉素、卡那霉素、新霉素等多種抗生素敏感。
[0012](5)主要含有的脂肪酸為飽和脂肪酸iso-C15:Q，anteiso-C15:0, C16:(l。
[0013]利用通用引物對菌株CGMCC N0.8294的16S rRNA基因進行擴增和序列測定，得到長度為737bp的基因片段(Seq ID N0.1)，其序列具體見序列表。將其與細菌16S rRNA基因序列數(shù)據(jù)庫進行比對，得到其與已知的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌屬的標準菌株S.maltophilia的相似性為99.32%，并且菌株CGMCC N0.8294的生長限制因子、細胞形態(tài)和主要脂肪酸都與其對應(yīng)特征保持一致，因此，這兩株菌為同種不同菌株。參照《Bergey’ s Manual ofSystematic Bacteriology))第二版的內(nèi)容,根據(jù)菌株限制因子特點、形態(tài)特征和生理生化指標，結(jié)合16S rRNA基因序列相似性，鑒定菌株CGMCC N0.8294為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(S.maltophilia)。
[0014]本發(fā)明的另一目的是提供一種利用所述的菌株CGMCC N0.8294生產(chǎn)過氧化氫酶的方法。
[0015]采用S.maltophilia CGMCC N0.8294 生產(chǎn)過氧化氫酶，以 CGMCC N0.8294 菌株為出發(fā)菌種，經(jīng)種子液培養(yǎng)和液體發(fā)酵得到過氧化氫酶，包括以下步驟:
[0016](I)將菌株CGMCC N0.8294接種至種子液培養(yǎng)基，培養(yǎng)之后的菌液作為種子液；
[0017](2)將種子液轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)2天之后即得到具有過氧化氫酶活性的發(fā)酵液。
[0018]上述方法步驟(1)中，所述的天然海水培養(yǎng)基的配方為天然海水中加入0.1-0.5%的蛋白胨、0.01-0.1 %的酵母提取物以及0.1-0.5%的酪蛋白氨基酸，調(diào)節(jié)pH為
6.8-7.5。
[0019]一個優(yōu)選的實施例中，天然海水液體培養(yǎng)基為天然海水中加入0.5%的蛋白胨，
0.1 %的酵母提取物，0.5%的酪蛋白氨基酸，調(diào)節(jié)pH為7.5。
[0020]步驟(1)中細菌培養(yǎng)時間為36-48小時，優(yōu)選40_45小時；培養(yǎng)溫度為20_40°C，優(yōu)選 30-35 °C。
[0021]上述方法步驟(2)中的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為天然海水中加入0.1-2%的葡萄糖和
0.5-5%的蛋白胨，pH為6.5-7.5。一個優(yōu)選的實施例中，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為天然海水中加入1-2%的葡萄糖和1-2%的蛋白胨，pH為7.0-7.5。培養(yǎng)時間為36-48小時，優(yōu)選40-48小時；培養(yǎng)溫度為20-40°C，優(yōu)選30-35°C。
[0022]根據(jù)上述方法可獲得過氧化氫酶活力和比酶活分別為10000-50000U / mL和100000-200000U / mg的發(fā)酵液，在一個優(yōu)選的實施例中酶活力分別達53228U / mL和181987.22U / mg。
[0023]根據(jù)需要，可任選對具有酶活力的發(fā)酵液進行處理，從中分離純化出過氧化氫酶的產(chǎn)物，優(yōu)選的分離純化條件如離子交換層析、反相層析、疏水層析、分子篩層析或其組合。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(S.maltophilia) CGMCC N0.8294的單碳源實驗結(jié)果。
[0025]圖2為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(S.maltophilia) CGMCC N0.8294的單氮源實驗結(jié)果。
【具體實施方式】
[0026]實施例1嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(S.maltophilia) CGMCC N0.8294的分離篩選和酶活力的測定。
[0027]采集含有過氧化氫的廢水樣品，先采用海生菌肉湯2216液體培養(yǎng)基培養(yǎng)得到對數(shù)期菌液。海生菌肉湯2216液體培養(yǎng)基的配方為IL去離子水中加入硫酸鎂6.64g，氯化鈉19.45g，氯化鎂12.6g，氯化鉀0.55g，氯化鈣1.8g，氟化鈉2.4mg,硅酸鈉9.3mg,硝酸銨
2.4mg,磷酸氫二鈉8mg,磷酸二氫鉀0.4g,碳酸氫鈉0.16g,溴化鉀0.08mg,硼酸22mg,氯化鍶57mg，檸檬酸鐵0.lg，酵母抽提物(Difco) lg，蛋白胨5g，調(diào)節(jié)pH為7.5。再將對數(shù)期菌液接入含有過氧化氫的液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，觀察其生長狀況。假若生長良好，則接種至較高過氧化氫濃度的液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；假若生長不好，則接種至較低過氧化氫濃度的液體培養(yǎng)基中，接著再觀察其生長狀況，以確定接下來接種的培養(yǎng)基其過氧化氫濃度是降低還是升高。如此循環(huán)往復(fù)，直至培養(yǎng)基的過氧化氫含量到達20-200mM。再經(jīng)平板稀釋涂布分離，挑取單克隆進行保存。
[0028]將保存下來的菌體分別接入含海生菌肉湯2216液體培養(yǎng)基的搖瓶中，30°C培養(yǎng)40小時。將培養(yǎng)得到的菌液12000rpm離心5分鐘收集得到菌體，以pH7.0，50mM磷酸鹽緩沖液重懸菌體并在冰浴中超聲破碎。破碎后的液體以6500g離心20分鐘，取上清液為粗酶液，對其進行過氧化氫酶活力測定，得到此粗酶液的酶活力大小(U / mL)。
[0029]過氧化氫酶活力采用分光光度法測量，利用了過氧化氫在240nm下的吸光值與其濃度的線性關(guān)系。具體操作為將細胞液進行破胞處理得到粗酶液，利用粗酶液與過氧化氫反應(yīng)時，吸光值的下降率作為依據(jù)計算粗酶液的酶活大小，具體公式:Aod24ciXioooX稀釋倍數(shù)X反應(yīng)體系體積/ ( Λ t X 43.6 X酶液體積)，43.6M—1 ^cnT1為H2O2在240nm下的摩爾消光系數(shù)。
[0030]蛋白質(zhì)濃度定量:(1)標準曲線的制作:取6支5mL離心管，分別加入0、5、10、20、30、40、50 μ L和定量的考馬斯亮藍G-250試劑。放置6分鐘后在595nm波長下比色測定。利用Excel表格軟件，以蛋白含量為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪出標準曲線，并得到標準曲線的公式。(2)蛋白質(zhì)含量測定:取I支5mL離心管，準確加入50yL粗酶液樣品，再加入定量的考馬斯亮藍G-250試劑，放置2分鐘后比色，記錄吸光度，根據(jù)標準曲線公式計算得到粗酶液樣品的蛋白含量。(3)酶活力計算:將得到的酶活(U / mL)除以蛋白含量(μ g / mL) X 1000,即得到此粗酶液的比酶活大小(U / mg)。
[0031]通過以上方法，得到一株高產(chǎn)過氧化氫酶的菌株，其粗酶活力和比酶活最高分別能達到53228U / mL和181987.22U / mg。其菌種保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為=CGMCC N0.8294。
[0032]實施例2寡養(yǎng)單胞屬菌株(S.maltophilia) CGMCC N0.8294的形態(tài)鑒定及生物學特性
[0033]寡養(yǎng)單胞屬菌株(S.maltophilia) CGMCC N0.8294接種于天然海水液體培養(yǎng)基中，若制備固體培養(yǎng)基可再加入20g / L的瓊脂。培養(yǎng)30小時后，進行鑒定，該菌具有以下特征:(1)菌落形態(tài):菌落呈圓形，表面光滑，邊緣平整，微凸起，無色透明；(2)細胞形態(tài):革蘭氏陰性菌，細胞顯微鏡下(Olympus，BX40)呈現(xiàn)運動性，形態(tài)為桿狀；(3)生理生化特征:好氧生長；氧化酶陽性；能利用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖等多種簡單有機物以及牛肉膏、蛋白胨、干酪素和魚粉等復(fù)合有機物；對青霉素、萬古霉素、鏈霉素、紅霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素等多種抗生素敏感。
[0034]實施例3寡養(yǎng)單胞屬菌株(S.maltophilia) CGMCC N0.8294的16S rRNA基因的PCR擴增與序列測定
[0035]寡養(yǎng)單胞屬菌株(S.maltophilia) CGMCC N0.8294接種于天然海水固體培養(yǎng)基中，從斜面中直接挑取菌體，加入200 μ L無菌水并充分懸浮菌體，沸水浴30分鐘，立即冰浴30分鐘，然后12000rpm離心2分鐘，上清液作為模板進行PCR。擴增16S rRNA基因的一對通用引物如下:
[0036]正向引物:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ；
[0037]反向引物:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’ ；
[0038]上述引物分別對應(yīng)大腸桿菌的16S rRNA基因的第8-27和1510-1492位堿基。PCR反應(yīng)體系(50 μ L)為:10Xbuffer5y L，IOmM dNTPsl μ L，4 μ M 引物各 I μ L，Taq 酶 0.5 μ L，DNA模板0.5 μ L，無菌純水42 μ L。PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性10分鐘；94°C變性45秒，55°C退火45秒；72°C延伸90秒，35個循環(huán)；72°C后延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物純化與序列測定由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。完成測定的16S rRNA基因部分片斷長度為737bp，與菌株 S.maltophilia 41^013637^^163 rRNA 基因序列相似性最高。菌株 S.maltophiliaCGMCC N0.8294的16S rRNA序列具體可見序列表Seq ID N0.1。
[0039]因此，參照《Bergey’sManual ofSystematic Bacteriology》第二版內(nèi)容，根據(jù)菌株的限制因子、形態(tài)特征和生理生化指標特點，結(jié)合16S rRNA基因序列相似性，鑒定CGMCCN0.8294為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(S.maltophilia)。
[0040]實施例4發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化
[0041]嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(S.maltophilia) CGMCC N0.8294接種至天然海水液體培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)30小時達到對數(shù)生長末期得到種子液。以I %的轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接至裝有50mL只含有單碳源或單氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度30°C，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)24小時之后，用分光光度計進行測量，利用菌液在600nm波長下的吸光值與細胞濃度的線性關(guān)系，以吸光值的大小反映菌株的生長狀況?；A(chǔ)培養(yǎng)基的配方為去離子水中加入0.01%的酵母提取物。進行測試的碳源有葡萄糖、蔗糖、麥芽浸膏、淀粉和麥芽糖；氮源有酵母浸膏、牛肉膏、干酪素、蛋白胨、尿素和魚粉。具體結(jié)果見圖1、2。結(jié)果顯示，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌CGMCCN0.8294以葡萄糖、麥芽糖和·蔗糖為碳源，菌株的生長狀況最為良好。加上原料的價格因素進行綜合考慮，決定選用蔗糖為菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的唯一碳源。在氮源的利用方面，菌株CGMCC N0.8294利用有機氮源的能力遠強于無機氮源，以魚粉和蛋白胨作為氮源物質(zhì)時生長得最好，這可能是因為有機氮源中除含有豐富的蛋白質(zhì)、多肽和游離的氨基酸外，往往還含有少量的糖類、脂肪、無機鹽、維生素及某些生長因子，因而相對于無機氮源更有利于菌體生長。由于魚粉成分的不穩(wěn)定性，綜合考慮決定采用蛋白胨作為菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的唯一氮源。
【權(quán)利要求】
1.一株寡養(yǎng)單胞屬菌株(S.maltophilia)及其突變體，已保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為=CGMCC N0.8294。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過氧化氫酶高產(chǎn)菌，其特征在于: (1)菌落形態(tài):菌落生長成形后呈圓形，表面光滑，邊緣平整，微凸起，無色透明； (2)細胞形態(tài):革蘭氏陰性菌，細胞形態(tài)為桿狀，在顯微鏡下呈現(xiàn)運動性； (3)生理生化特征:好氧生長；在20-40°C、pH7.0-9.0、鹽度0-3.5% (w / v)范圍內(nèi)均能生長，最佳生長條件在30°C、pH7.5、鹽度2.0%左右；氧化酶陽性；能利用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖等多種簡單有機物以及牛肉膏、蛋白胨、干酪素和魚粉等復(fù)合有機物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過氧化氫酶高產(chǎn)菌，其特征在于:所述菌株的16s核糖體亞基基因(16s rRNA)序列包含如Seq ID N0.1所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體，其特征在于:所述突變體為對菌株CGMCCN0.8294原代進行誘變、馴化、基因重組等操作或者經(jīng)自然突變而獲得的突變體。
5.一種利用權(quán)利要求1所述的過氧化氫酶高產(chǎn)菌生產(chǎn)過氧化氫酶的方法，包括以下步驟: (1)將菌株CGMCC.N0.8294接種至種子液培養(yǎng)基，培養(yǎng)之后的菌液作為種子液； (2)將種子液轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，得到具有過氧化氫酶活性的發(fā)酵液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述方法步驟(1)中的種子液培養(yǎng)基的配方為天然海水中加入0.1-0.5%的蛋白胨、0.01-0.05%的酵母提取物以及0.1-0.5%的酪蛋白氨基酸，調(diào)節(jié)PH為6.8-7.5。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述方法步驟(2)中的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為天然海水中加入0.1-1%的葡萄糖和0.5-5%的蛋白胨，pH為6.5-7.5。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7任一項所述的方法，其特征在于:所述方法步驟(2)最后獲得發(fā)酵液中的過氧化氫酶活力和比酶活分別為10000-50000U / mL和100000-200000U / mg。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-7任一項所述的方法，其特征在于:根據(jù)需要，可任意選取方法對具有酶活力的發(fā)酵液進行后續(xù)處理，從中分離純化出過氧化氫酶產(chǎn)物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于:所述處理方法的分離純化條件為離子交換層析、反相層析、疏水層析、分子篩層析或其以上組合。
【文檔編號】C12N9/08GK103789225SQ201310565472
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2013年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月8日
【發(fā)明者】潘杰, 吳敏, 許學偉, 霍穎異, 張文武 申請人:浙江大學