一種鯉春病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種鯉春病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其通過(guò)選用鯉春病毒株SVCV-DL進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的制備，經(jīng)過(guò)毒株的鑒定、標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備，即通過(guò)病毒的增殖后收獲病毒培養(yǎng)物，再經(jīng)過(guò)凍干工藝，選用由海藻糖、脯氨酸、脫脂奶粉和去離子水制備的凍干保護(hù)劑，選用特定的凍干工藝制備鯉春病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品。最后通過(guò)均勻性和穩(wěn)定性檢查、定性檢定、定值等項(xiàng)工作獲得本標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制成功，不僅為檢測(cè)研究、醫(yī)藥研究、應(yīng)用研究提供了標(biāo)準(zhǔn)樣品的需求，同時(shí)為檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)技術(shù)指導(dǎo)、服務(wù)出口企業(yè)提供技術(shù)上的支持。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種鯉春病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于檢測(cè)用病毒培養(yǎng)物標(biāo)準(zhǔn)品及其制備方法【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及鯉春病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]我國(guó)是世界上最大的水產(chǎn)品生產(chǎn)和輸出國(guó)，目前，我國(guó)水產(chǎn)品總量已占全球漁業(yè)總產(chǎn)量的40%，連續(xù)15年居世界首位，養(yǎng)殖水產(chǎn)品產(chǎn)量占世界養(yǎng)殖總產(chǎn)量的70%。水產(chǎn)品在保障國(guó)家糧食安全、促進(jìn)農(nóng)民增收和農(nóng)村經(jīng)濟(jì)穩(wěn)步發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。我國(guó)水海產(chǎn)品出口面臨的壁壘主要為綠色壁魚(yú)，如日本的“肯定列表制度”、歐盟的《歐盟食品及飼料安全管理法規(guī)》及有關(guān)法令、美國(guó)的《最嚴(yán)謹(jǐn)?shù)乃a(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)范》(BAP)等，歐盟啟動(dòng)了對(duì)我國(guó)進(jìn)口人工養(yǎng)殖海產(chǎn)品的審查；韓國(guó)政府也禁止我國(guó)34家水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)向韓國(guó)出口魚(yú)類(lèi)等水產(chǎn)品，嚴(yán)重制約了我國(guó)水產(chǎn)品的出口增長(zhǎng)。
[0003]鯉春病毒病(又稱(chēng)鯉魚(yú)傳染性腹水癥)是由鯉春病病毒(SVC)感染而引起鯉魚(yú)科的一種急性、出血性傳染性病，是對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)危害較大的一種傳染性疫病。也是我國(guó)動(dòng)物防疫法規(guī)定的一類(lèi)動(dòng)物疫病，OIE將其列為需要向OIE申報(bào)的疫病。該病原廣泛存在，傳播速度快，潛伏期短，死亡率高，可導(dǎo)致整個(gè)魚(yú)塘毀滅性打擊，且該病毒傳播快且比較難控制疫情，是水生動(dòng)物檢疫中嚴(yán)格檢驗(yàn)控制的病毒。鯉春病毒血癥的流行地域廣，流行于歐洲、中東和俄羅斯，主要有奧地利、匈牙利、保加利亞、法國(guó)、德國(guó)、英國(guó)、意大利、西班牙以及捷克、斯洛伐克、俄羅斯等，近幾年逐步蔓延到美洲和亞洲。該病是魚(yú)類(lèi)口岸檢疫的第一類(lèi)檢疫對(duì)象，可引起各國(guó)的貿(mào)易摩擦和巨大的經(jīng)濟(jì)損失。1998年英國(guó)從北京進(jìn)口一批觀賞魚(yú)中檢出含有鯉春病病毒，并以此要求中國(guó)對(duì)所有出口觀賞魚(yú)飼養(yǎng)場(chǎng)進(jìn)行兩年以上的凈化及SVC監(jiān)測(cè)，直至保證沒(méi)有SVC，方可向英國(guó)出口。隨后，中國(guó)觀賞魚(yú)出口的傳統(tǒng)市場(chǎng)法國(guó)、意大利、西班牙、比利時(shí)、日本和新加坡等也相繼提出了類(lèi)似要求。后經(jīng)英國(guó)有關(guān)專(zhuān)家證實(shí)，北京并未發(fā)現(xiàn)任何SVC感染情況。但是，我國(guó)卻為此損失創(chuàng)匯I億多元，而且全國(guó)的觀賞魚(yú)產(chǎn)業(yè)從此一落千丈。2002年美國(guó)北卡羅來(lái)納州發(fā)生該病導(dǎo)致15萬(wàn)尾錦鯉的損失，同年6月美國(guó)威斯康星州的野生鯉魚(yú)也大量發(fā)病。2003、2005、2007年英國(guó)在本地均檢出SVCV。中國(guó)養(yǎng)殖鯉魚(yú)占淡水魚(yú)21%，養(yǎng)殖歷史悠久，但未見(jiàn)該病暴發(fā)的正式報(bào)道，該病一旦發(fā)病，將給我國(guó)養(yǎng)殖漁業(yè)以沉重的打擊。
[0004]由于養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境惡化，疾病預(yù)防意識(shí)差，濫用藥物普遍，水生動(dòng)物種苗質(zhì)量不高，防疫體系不健全等原因?qū)е滤鷦?dòng)物發(fā)病。系統(tǒng)內(nèi)送檢魚(yú)的樣品通常眼觀來(lái)看都比較健康，而鯉春病毒通常只有在適宜的溫度下才能發(fā)病，而且現(xiàn)在用的PCR方法只能從重度感染表現(xiàn)出臨床癥狀的魚(yú)中檢出病毒，無(wú)法檢測(cè)潛在的病毒。隨著進(jìn)出口貿(mào)易的增大，檢驗(yàn)流程時(shí)限要求縮減，魚(yú)類(lèi)疫病多數(shù)要上細(xì)胞進(jìn)行先增殖，而普通的水生動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室很難得到該病毒，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制 及研究帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，幫助實(shí)驗(yàn)室建立好的質(zhì)量保證，遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局從2006年就開(kāi)始從事水生動(dòng)物疫病及標(biāo)準(zhǔn)樣品的研究工作，成立了研制標(biāo)準(zhǔn)樣品工作小組，由遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局制備測(cè)試樣品，使用的鯉春病毒株SVCV-DL來(lái)源于日常搜集樣品。進(jìn)行了原材料的選取、標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備、均勻性和穩(wěn)定性檢查、定性檢定、定值等項(xiàng)工作。
[0006]本標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制成功，不僅為檢測(cè)研究、醫(yī)藥研究、應(yīng)用研究提供了標(biāo)準(zhǔn)樣品的需求，同時(shí)為檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)技術(shù)指導(dǎo)、服務(wù)出口企業(yè)提供技術(shù)上的支持。
[0007]本發(fā)明的一方面在于:公開(kāi)一種鯉春病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其包括以下操作步驟:
[0008]a.病毒的增殖
[0009]選長(zhǎng)滿(mǎn)單層的EPC細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)液，接種SVC病毒液；于15°C吸附2小時(shí)；補(bǔ)加M199維持液，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞病變達(dá)到80%以上，收獲病毒培養(yǎng)物，于_20°C保存?zhèn)溆茫?br>
[0010]b.凍干工藝
[0011]凍干保護(hù)劑為:按以下組分和重量體積比配制而成:海藻糖:去離子水為5%，脯氨酸:去離子水為5%，脫脂奶粉:去離子水為10% ；
[0012]凍干工藝為:取步驟a中病毒培養(yǎng)物與凍干保護(hù)劑按等體積比均勻混合，于_30°C中預(yù)凍24h后，移至凍干機(jī)中，保持真空度在30~40mtorr間，真空干燥24h，即為鯉春病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品。
[0013]對(duì)于上述技術(shù)方案中，所述的鯉春病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其步驟a所述收獲病毒培養(yǎng)物為:待EPC細(xì)胞感染SVC病毒后脫落，出現(xiàn)細(xì)胞病變后反復(fù)凍融細(xì)胞培養(yǎng)物三次，于4°C, 10000r/min離心IOmin制備獲得。
[0014]對(duì)于上述技術(shù)方案中，所述的鯉春病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其步驟b所述凍干保護(hù)劑經(jīng)過(guò)108°C，15min滅菌。
[0015]對(duì)于上述技術(shù)方案中，所述的鯉春病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其步驟a所述收毒的病毒滴度通過(guò)Karber法測(cè)定，TCID50值為10_6 7 525/ 0.1ml。
[0016]本發(fā)明的另一方面在于，保護(hù)一種利用上述技術(shù)方案中所述方法制備的鯉春病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品。
【專(zhuān)利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0017]本發(fā)明附圖4幅，
[0018]圖1 =SVCV目的片段外套引物擴(kuò)增PCR電泳圖；M:DL2000 Marker ；1:F1/R2擴(kuò)增產(chǎn)物；大小約為714bp ；
[0019]圖2 =SVCV目的片段內(nèi)套引物擴(kuò)增PCR電泳圖；M:DL2000 Marker ；1:F1/R4擴(kuò)增產(chǎn)物;2:陰性；
[0020]圖3:鯉春病毒糖蛋白核酸序列對(duì)比圖；
`[0021]圖4 =Neighbor Joining方法作系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；圖中所示本鯉春病毒株SVCV-DL (圖中以lcll22631為簡(jiǎn)稱(chēng))與S30病毒株親緣關(guān)系最近，為一個(gè)分支。
【具體實(shí)施方式】[0022]下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0023]本發(fā)明中使用的EPC細(xì)胞系(全稱(chēng)鯉上皮乳頭狀瘤細(xì)胞系)由ATCC購(gòu)買(mǎi)；M199培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程公司。感受態(tài)細(xì)胞E.coli JM109、PCR試劑盒、分子量標(biāo)準(zhǔn)DL-2000、DNA快速純化回收試劑盒、DNA片段的連接轉(zhuǎn)化試劑盒等均為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；氨芐青霉素(Amp)為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品；其余試劑均為分析純產(chǎn)品。
[0024]實(shí)施例1鯉春病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備
[0025]一.病毒的鑒定
[0026]將遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局日常收集的魚(yú)病病料組織(毒株來(lái)源于樣品)，根據(jù)OIE和《GB/T15805.5-2008魚(yú)類(lèi)檢疫方法第5部分:鯉春病毒(SVCV)》方法進(jìn)行前處理，并進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。
[0027]RNA的提取
[0028]①Trizol法提取病毒RNA:
[0029]②取3個(gè)1.5mL滅菌EP管，病毒樣品2個(gè)，陰性對(duì)照I個(gè)，并對(duì)每個(gè)管進(jìn)行編號(hào)。
[0030]③每管加入600 μ L裂解液，樣品200 μ L ;再加入200 μ L氯仿，混勻器上震蕩混勻5s。于 4°C條件下，12000r/min 離心 15min。
[0031]④再取相同個(gè)數(shù)的EP管，加入-20°C預(yù)冷的異丙醇500 μ L，對(duì)每個(gè)管進(jìn)行編號(hào)。取離心后上清至少500 μ L,顛倒混勻。于4°C條件下，12000r/min離心15min。
[0032]⑤輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，吸干液體。加入600 μ L75%乙醇，顛倒洗滌。于4°C條件下，12000r/min 離心` lOmin。
[0033]⑥輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，吸干液體。4000r/min離心10s。
[0034]⑦用微量加樣器盡吸干液體，室溫干燥3min。
[0035]⑧加入11 μ L DEPC水，輕輕混勻，溶解管壁上的RNA，2000r/min離心5s，冰上保存?zhèn)溆谩?br>
[0036]RT 反應(yīng):
[0037]①解二級(jí)結(jié)構(gòu):在PCR管中，加入如下體系:
[0038]RNA 模板 IOyL
[0039]Rl3 μ L
[0040]DEPC 水 2 μ L
[0041 ] 總體積15 μ L。70°C加熱5min后，立即冰浴。
[0042]②合成cDNA:在上述管中，加入如下體系:
[0043]
?.V 5 X Buffer5 μ L
ΛΤΡη2μ 1.HEP (201:)I μ L
DEFC 水I μ L
MLV〗μ L[0044]總體積25 μ L。40°C加熱 60min。
[0045]PCR反應(yīng):在上述管中加入如下體系:
[0046]
【權(quán)利要求】
1.一種鯉春病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其特征在于包括以下操作步驟: a.病毒的增殖 選長(zhǎng)滿(mǎn)單層的EPC細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)液，接種鯉春病毒的病毒液；于15°C吸附2小時(shí)；補(bǔ)加M199維持液，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞病變達(dá)到80%以上，收獲病毒培養(yǎng)物，于_20°C保存?zhèn)溆茫? b.凍干工藝 凍干保護(hù)劑由以下組分按重量體積比配制而成，海藻糖:去離子水為5%，脯氨酸:去離子水為5%,脫脂奶粉:去離子水為10% ； 凍干工藝為:取步驟a中病毒培養(yǎng)物與步驟b中的凍干保護(hù)劑按等體積比均勻混合，于_30°C中預(yù)凍24h后，移至凍干機(jī)中，保持真空度在30~40mtorr間，真空干燥24h，即為鯉春病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鯉春病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其特征在于步驟a所述收獲病毒培養(yǎng)物為:待EPC細(xì)胞感染SVC病毒后脫落，出現(xiàn)細(xì)胞病變后反復(fù)凍融細(xì)胞培養(yǎng)物三次，于4°C, 10000r/min離心IOmin制備獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鯉春病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其特征在于步驟b所述凍干保護(hù)劑經(jīng)過(guò)108°C，15min滅菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鯉春病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其特征在于步驟a收獲病毒培養(yǎng)物的 TCID5tl 值為 10 -67 525 / 0.1ml。
5.一種利用權(quán)利要求1所述方法制備的鯉春病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品。
【文檔編號(hào)】C12N7/00GK103555860SQ201310557758
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月7日
【發(fā)明者】吳斌, 肇慧君, 蔡曉萍, 張雪 申請(qǐng)人:吳斌, 肇慧君, 蔡曉萍, 張雪