一種海豚鏈球菌dna疫苗及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種海豚鏈球菌DNA疫苗及其應(yīng)用。海豚鏈球菌DNA疫苗為pCNSiE。本發(fā)明的疫苗對(duì)海豚鏈球菌的免疫保護(hù)效率達(dá)95％本發(fā)明的疫苗在免疫后兩個(gè)月內(nèi)的免疫保護(hù)效率沒(méi)有明顯減弱。
【專利說(shuō)明】—種海豚鏈球菌DNA疫苗及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種海豚鏈球菌DNA疫苗及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)為一種革蘭氏陽(yáng)性菌,屬于鏈球菌屬，是養(yǎng)殖魚(yú)類主要病原菌之一。在我國(guó)，海豚鏈球菌危害的魚(yú)類包括羅非魚(yú)、牙鲆、美國(guó)紅魚(yú)、鯛類等。除了水生動(dòng)物外，海豚鏈球菌還能夠感染人類和其它動(dòng)物，是一種典型的人畜共患病原，其感染人類后可造成各種軟組織炎癥以及敗血癥等。在我國(guó)，至今沒(méi)有商業(yè)化海豚鏈球菌疫苗，對(duì)海豚鏈球菌相關(guān)病害的防治一直以抗生素和化學(xué)藥物為主。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明目的在于提供一種海豚鏈球菌DNA疫苗及其應(yīng)用。
[0004]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0005]一種海豚鏈球菌DNA疫苗，疫苗為pCNSiE。
[0006]具體為:
[0007]以海豚鏈球菌G26為模板經(jīng) 引物F1/R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與載體pCN3質(zhì)粒連接轉(zhuǎn)化后質(zhì)粒pCNSiE，即為海豚鏈球菌DNA疫苗；
[0008]所述引物序列為:
[0009]Fl:5’ -CCCGGGATGATTTTTGGAAAAAGTAGTAATGGA-3 ；
[0010]Rl:5，-CCCGGGCCTTCTTACCTTTGACTGAT-3，。
[0011]所述質(zhì)粒pCNSiE在PBS中稀釋至終濃度為150 μ g/ml，作為疫苗制備液。所述疫苗為注射劑。
[0012]一種海豚鏈球菌DNA疫苗的制備方法，以海豚鏈球菌G26為模板，采用F1/R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后與用Sma I酶切的質(zhì)粒pCN3連接，連接液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α后在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 — 24小時(shí)，接轉(zhuǎn)化后質(zhì)粒為pCNSiE，即為海豚鏈球菌DNA疫苗質(zhì)粒。
[0013]一種海豚鏈球菌DNA疫苗的應(yīng)用，所述質(zhì)粒pCNSiE用于制備海豚鏈球菌的免疫疫苗中的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0015]1.高保護(hù)率。本發(fā)明的疫苗對(duì)海豚鏈球菌的免疫保護(hù)效率達(dá)95%。
[0016]2.長(zhǎng)效。本發(fā)明的疫苗在免疫后兩個(gè)月內(nèi)的免疫保護(hù)效率沒(méi)有明顯減弱。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例旨在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例描述，而非以任何形式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。
[0018]在本發(fā)明實(shí)施例中所涉及到的常規(guī)性實(shí)驗(yàn)方法均采用如下方法:[0019]1.質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相
應(yīng)試劑盒。
[0020]2.質(zhì)粒、DNA連接液轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor LaboratoryPress 2001)；[0021]3.所有限制性內(nèi)切酶和連接酶皆購(gòu)自于“北京，紐英倫生物技術(shù)有限公司”。
[0022]實(shí)施例1
[0023]DNA疫苗質(zhì)粒pCNSiE的構(gòu)建:
[0024]以海豚鏈球菌G26為模板，采用F1/R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為:94 V 60s預(yù)變性模板DNA，然后94 °C 40s, 52 V 60s, 72 V 60s, 5個(gè)循環(huán)后改為940C 40s, 63°C 60s, 72°C 60s, 25個(gè)循環(huán)后再在72°C延伸反應(yīng)10min。PCR產(chǎn)物用天根DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化。將質(zhì)粒pCN3 (pCN3構(gòu)建過(guò)程參見(jiàn)Jiao XD, Zhang M，Hu YH, SunL.Construction and evaluation of DNA vaccines encoding Edwardsiella tardaantigens.Vaccine 2009; 27:5195 202.)用 Sma I 酶切，回收 5.4kb 片段，將其與上述純化的PCR產(chǎn)物用T4DNA連接酶于室溫連接2 — 4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α后在含氨芐青霉素(100ug/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 — 24小時(shí)，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為pCNSiE。
[0025]PCR 引物為 Fl:5’ -CCCGGGATGATTTTTGGAAAAAGTAGTAATGGA-3’和 Rl:5’ -CCCGGGCCTTCTTACCTTTGACTGAT-3’。
[0026]所述菌株G26保存于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC，保藏編號(hào)為:CGMCC N0.1984，分類命名為海豚鏈球菌(Sti^ptococcus iniae)，保藏日期為2007年3月22日，保藏單位地址為北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)。
[0027]所述LB組成成分按重量百分比計(jì):1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化鈉，97.5%蒸餾水.[0028]實(shí)施例2
[0029]疫苗pCNSiE的應(yīng)用
[0030]步驟I)疫苗制備液的制備。將上述DNA疫苗pCNSiE質(zhì)粒在PBS中稀釋至終濃度為150 μ g/ml,即為疫苗制備液。
[0031]所述PBS 組成成分按重量百分比計(jì):0.8%NaCl, 0.02%KC1, 0.358%Na2HP04.12H20, 0.024%NaH2P04,余量為水。
[0032]步驟2)疫苗的接種。將100條牙鲆(每條重約11.2g)隨機(jī)分為4組，每組25條。將這4組分別命名為A、B、C和D。將A和C組的每條魚(yú)腹腔注射IOOul上述步驟I)的疫苗制備液，將B和D組(對(duì)照組)的每條魚(yú)腹腔注射IOOul PBS0
[0033]步驟3)海豚鏈球菌懸液的制備。在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)海豚鏈球菌G26至0D_為
0.8，然后離心(5000g，4°C，IOmin),收集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為lxl08cfu/ml，即為G26懸液。
[0034]步驟4)疫苗的免疫保護(hù)效應(yīng)檢測(cè)。在步驟2)免疫注射后一個(gè)月，用上述步驟3)的G26懸液腹腔注A和B組魚(yú)，每條魚(yú)的注射量為IOOul。在步驟2)免疫注射后兩個(gè)月，用上述步驟3)的G26懸液腹腔注射C和D組魚(yú)，每條魚(yú)的注射量為lOOul。在以后的20天中，每天觀察并記錄各組魚(yú)的死亡情況。20天后，統(tǒng)計(jì)各組魚(yú)的總死亡數(shù)目:A組，I條；B組，19條；C組，2條；D組，17條。利用下列公式計(jì)算相對(duì)免疫保護(hù)效率(RPS):
[0035]RPS=100x(l 一免疫組魚(yú)的總死亡百分比/對(duì)照組魚(yú)的總死亡百分比)
[0036]由此得出疫苗pCNSiE免疫一個(gè)月和兩個(gè)月時(shí)對(duì)海豚鏈球菌的免疫保護(hù)率分別為95%和88%。因此，pCNSiE是一種非常`高效的DNA疫苗。
【權(quán)利要求】
1.一種海豚鏈球菌DNA疫苗，其特征在于:疫苗為pCNSiE。
2.按權(quán)利要求1所述的海豚鏈球菌DNA疫苗，其特征在于: 以海豚鏈球菌G26為模板經(jīng)引物F1/R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與載體pCN3質(zhì)粒連接轉(zhuǎn)化后質(zhì)粒pCNSiE，即為海豚鏈球菌DNA疫苗； 所述引物序列為:
Fl:5’ -CCCGGGATGATTTTTGGAAAAAGTAGTAATGGA-3 ；
Rl:5’ -CCCGGGCCTTCTTACCTTTGACTGAT-3’。
3.按權(quán)利要求1或2所述的海豚鏈球菌DNA疫苗，其特征在于:所述質(zhì)粒pCNSiE在PBS中稀釋至終濃度為150 μ g/ml，作為疫苗制備液。
4.按權(quán)利要求1或2所述的海豚鏈球菌DNA疫苗，其特征在于:所述疫苗為注射劑。
5.一種權(quán)利要求1所述的海豚鏈球菌DNA疫苗的制備方法，其特征在于: 以海豚鏈球菌G26為模板，采用F1/R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后與用SmaI酶切的質(zhì)粒PCN3連接，連接液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α后在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 - 24小時(shí)，接轉(zhuǎn)化后質(zhì)粒為pCNSiE，即為海豚鏈球菌DNA疫苗質(zhì)粒。
6.一種權(quán)利要求1所述的海豚鏈球菌DNA疫苗的應(yīng)用，其特征在于:所述質(zhì)粒pCNSiE用于制備海豚鏈球菌的免疫疫 苗中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/46GK103550765SQ201310557674
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月11日
【發(fā)明者】孫黎, 孫云, 孫鉑光 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所