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乳腺癌標(biāo)志物的制作方法

文檔序號(hào):523085閱讀:383來(lái)源:國(guó)知局
乳腺癌標(biāo)志物的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本申請(qǐng)涉及乳腺癌標(biāo)志物。提供了多態(tài)性與乳腺癌之間的相關(guān)性。提供了乳腺癌的診斷、預(yù)后和治療方法。提供了乳腺癌診斷、預(yù)后和治療的系統(tǒng)和試劑盒。還記載了鑒定乳腺癌調(diào)控劑的方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】乳腺癌標(biāo)志物
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2006年11月29日、中國(guó)申請(qǐng)?zhí)枮?00680051710.0、發(fā)明名稱(chēng)為“乳腺癌標(biāo)志物”的發(fā)明申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002]相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
[0003]本申請(qǐng)請(qǐng)求Cox 等在 2005 年 11 月 29 日提交的 USSN60/740, 971MARKERS FORBREAST CANCER的優(yōu)先權(quán)和利益。本申請(qǐng)還請(qǐng)求Cox等在2006年3月10日提交的USSN60/781,483MARKERS FOR BREAST CANCER的優(yōu)先權(quán)和利益。將這些在先申請(qǐng)各自完整地引入本文作為參考。
[0004]發(fā)明背景
[0005]乳腺癌如其它常見(jiàn)的癌癥一樣表現(xiàn)出家族性聚類(lèi)(clustering)。大量流行病學(xué)調(diào)查已經(jīng)證實(shí),總體而言,該病在乳腺癌患者的一級(jí)親屬中普及約為2倍i。家族研究特別是雙生子研究提示如果不是所有該聚類(lèi),那么也是大部分該聚類(lèi)存在遺傳基礎(chǔ)2,3。例如,Peto和Mack3估計(jì)乳腺癌在患病女性的MZ雙生子中的風(fēng)險(xiǎn)約高于姊妹病例風(fēng)險(xiǎn)的4倍。
[0006]已經(jīng)鑒定了幾種乳腺癌易感性(susceptibility)基因,最重要的是BRCAl和BRCA2。在這些基因中的突變賦予了乳腺癌的高風(fēng)險(xiǎn)(截止到70歲分別為65%和45%的等級(jí))4?;谌后w的系列乳腺癌病例突變篩選已經(jīng)證實(shí)僅約15%的乳腺癌家族風(fēng)險(xiǎn)度可以解釋為這些基因中的突變5’6。其它已知的乳腺癌易感性基因(TP53、PTEN、ATM、CHEK2)對(duì)家族性風(fēng)險(xiǎn)僅有較小的貢獻(xiàn)(因?yàn)閻翰≠|(zhì)突變是罕見(jiàn)的和/或僅賦予較小的風(fēng)險(xiǎn))。因此,總體而言,估計(jì)已知的乳腺癌易感性基因占家族性風(fēng)險(xiǎn)的不超過(guò)20%7。
[0007]風(fēng)險(xiǎn)中的遺傳變異可能源自罕見(jiàn)的高度外顯性(penetrant)突變(諸如BRCAl和BRCA2中的那些)或源自賦予更為中度風(fēng)險(xiǎn)的變異。幾條證據(jù)強(qiáng)烈提示高度外顯性突變并非剩余的家族性乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的主要提供者。首先,多個(gè)病例家族的突變篩選發(fā)現(xiàn)具有極為明顯家族史(例如4個(gè)或個(gè)以上患病`親屬)的大部分病例在BRCAl或BRCA2中包含突變8。第二,盡管在過(guò)去的9年中進(jìn)行了廣泛努力,但是遺傳連鎖研究尚未鑒定任何額外連鎖基因座9’1(1。第三,對(duì)較大系列的乳腺癌家族的分離分析已經(jīng)發(fā)現(xiàn),在調(diào)整BRCAl和BRCA2后,無(wú)進(jìn)一步重大顯性乳腺癌易感性等位基因的證據(jù)n’12。在最大規(guī)模的這類(lèi)分析中,Antoniou等13發(fā)現(xiàn)乳腺癌的最經(jīng)濟(jì)型(parsimonious)模型為多基因模型,它與大量小作用基因座的倍增聯(lián)合(a large number of loci of small effect combining multiplicatively)相當(dāng)。
[0008]盡管上述分析提示幾種較低外顯性乳腺癌易感性基因仍然有待檢測(cè),但是這類(lèi)基因的精確數(shù)目尚不了解。此外,在現(xiàn)有技術(shù)中,尚不清楚這類(lèi)易感性等位基因在群體中是常見(jiàn)的還是罕見(jiàn)的。本申請(qǐng)集中于相對(duì)常見(jiàn)(頻率高于5%)的等位基因且本文基于全基因組對(duì)這類(lèi)基因座進(jìn)行鑒定。
[0009]發(fā)明概述
[0010]本發(fā)明包括與乳腺癌表型,諸如乳腺癌易感性相關(guān)的多態(tài)性基因座的鑒定。圖1和2提供了表型基因座的描述。圖1提供了優(yōu)選的表型基因座的描述。因此,本發(fā)明提供了先前未知的各種多態(tài)性與乳腺癌易感性表型之間的相關(guān)性。因此,對(duì)這些多態(tài)性(或與之相關(guān)的基因座)的檢測(cè)提供了用于鑒定患者處于乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)中的有力和精確的方法和系統(tǒng)。此外,對(duì)這些多態(tài)性的鑒定提供了鑒定乳腺癌調(diào)控劑的高通量系統(tǒng)和方法。
[0011]因此,本發(fā)明在一個(gè)方面中提供了鑒定生物體或其衍生的生物學(xué)樣品的乳腺癌表型的方法。該方法包括檢測(cè)生物體或生物學(xué)樣品中的多態(tài)性或與之緊密連鎖的基因座,所述的多態(tài)性選自圖1的多態(tài)性,其中多態(tài)性與乳腺癌表型相關(guān)。這些方法進(jìn)一步包括使所述多態(tài)性或基因座與所述表型建立相關(guān)性。
[0012]生物體典型的是哺乳動(dòng)物,優(yōu)選人類(lèi)患者,最典型的是女性患者(盡管男性也會(huì)發(fā)生乳腺癌,而且本文中所述的相關(guān)性也適用于男性患者)。類(lèi)似的,生物學(xué)樣品典型的衍生自哺乳動(dòng)物,例如人類(lèi)患者,例如遵循適宜的知情同意實(shí)踐。所述方法可用于檢測(cè)取自人類(lèi)患者的樣品中的乳腺癌標(biāo)志物,或者可用于檢測(cè)由其衍生的生物學(xué)樣品(例如細(xì)胞,包括原代的和培養(yǎng)的細(xì)胞)中的標(biāo)志物。[0013]可以通過(guò)任何可利用的方法檢測(cè)多態(tài)性,包括擴(kuò)增、與探針或陣列雜交等。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中,檢測(cè)包括擴(kuò)增多態(tài)性、連鎖基因座或與之相關(guān)的序列(例如,側(cè)翼序列、轉(zhuǎn)錄序列等)并檢測(cè)所得擴(kuò)增子。例如,在一個(gè)實(shí)施方案中,擴(kuò)增包括:a)混合擴(kuò)增引物或擴(kuò)增引物對(duì)與分離自生物體或生物學(xué)樣品的核酸模板。所述的引物或引物對(duì)可以與鄰近或包含多態(tài)性或連鎖基因座的區(qū)互補(bǔ)或部分互補(bǔ),并且能夠在核酸模板上由聚合酶啟動(dòng)核酸聚合。所述的引物或引物對(duì)在包括聚合酶和模板核酸的DNA聚合反應(yīng)中延伸而生成擴(kuò)增子。在某些方面中,任選通過(guò)如下方法檢測(cè)擴(kuò)增子,該方法包括使所述的擴(kuò)增子與陣列雜交、用限制酶消化該擴(kuò)增子或?qū)崟r(shí)PCR分析。例如,可以任選通過(guò)雜交對(duì)擴(kuò)增子進(jìn)行完全或部分測(cè)序。一般而言,擴(kuò)增可以包括使用分離自生物體或生物學(xué)樣品的核酸作為PCR、RT-PCR或LCR中的模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)或連接酶鏈反應(yīng)(LCR)??梢杂闷渌夹g(shù)取代擴(kuò)增,例如使用分支DNA(bDNA)探針。
[0014]在典型的實(shí)施方案中,多態(tài)性或連鎖基因座可以包括SNP。等位基因的實(shí)例包括圖1和/或2中所述的那些。例如,相關(guān)多態(tài)性可以為圖1 (最優(yōu)選)或圖2的那些。優(yōu)選的多態(tài)性包括選自SNP識(shí)別號(hào)碼所述的SNP組的SNP,所述的識(shí)別號(hào)碼選自:SNP ID2312116,SNP ID1622530, SNP ID3712013, SNP ID1509710, SNP ID843029, SNP ID1990126,SNP ID604819, SNP ID3025734, SNP ID1152499, SNP ID4415909, SNP ID1732681,SNP ID4281579, SNP ID4454457, SNP ID2616199, SNP ID1720694, SNP ID4077723,SNP ID3711990, SNP ID3337858, SNP ID4093095, SNP ID4213825, SNP ID3488617,SNP ID3610210, SNP ID3451239, SNP ID1582533, SNP ID3488150, SNP ID2770052, SNPID4141351,SNP ID1335030, SNP ID2211665 和 SNP ID4538418。這些識(shí)別號(hào)碼為 PerlegenSNP 識(shí)別號(hào)碼(Perlegen Sciences, Inc.1n Mountain View, CA),其為公眾可得到的并且可以在Perlegen (dot) com上查閱到大量相關(guān)信息,通過(guò)使用該公司在genome (dot)perlegen (dot) com/browser/index (dot) html 可利用的基因組瀏覽器查閱??梢栽?SNP_ID開(kāi)始處添加通配符(例如,符號(hào))以便例如按照提供的完整說(shuō)明書(shū)鑒定有關(guān)所有SNP等位基因的相關(guān)信息。該數(shù)據(jù)庫(kù)還與NCBI基因組數(shù)據(jù)庫(kù)鏈接,由此提供大量有關(guān)相關(guān)基因和多態(tài)性的額外信息。這些SNP包括與例如如下基因相關(guān)的SNP:FGFR2, A2BP1, TNRC9, H19,F(xiàn)STL5, LSPl,L0C388927, UNQ9391, HCNl,L0C441192, TNRC9, NR3C2, KIAA0826, FLJ31033,AACS, FRMD4A和SEC31L2(另外,參見(jiàn)圖1)。因此,與這些基因相關(guān)的多態(tài)性也是可能與乳腺癌多態(tài)性相關(guān)的優(yōu)選SNP。
[0015]并且任選在某些實(shí)施方案中,該方法包括在一種以上這類(lèi)基因中檢測(cè)多態(tài)性(例如,在某些便利性的應(yīng)用中,可以同時(shí)對(duì)單一患者檢測(cè)幾種多態(tài)性以便更完整地確定或指定相關(guān)表型)。如此,本發(fā)明在一個(gè)方面中包括檢測(cè)多個(gè)所述基因中的多個(gè)多態(tài)性或連鎖基因座。該方法可以包括,例如,檢測(cè)下列每種的至少一個(gè)多態(tài)性:SNP ID2312116、SNP ID1622530、SNP ID3712013、SNP ID1509710 和 SNP ID84302,和 / 或 FGFR2、A2BP1、TNRC9、H19和FSTL5中的多態(tài)性。類(lèi)似地,該方法可以包括檢測(cè)下列每種的至少一個(gè)多態(tài)性:SNP ID2312116, SNP ID1622530, SNP ID3712013, SNP BD1509710, SNP ID843029,SNP ID1990126, SNP ID604819, SNP ID3025734, SNP ID1152499, SNP ID4415909,SNP ID1732681, SNP ID4281579, SNP ID4454457, SNP ID2616199, SNP ID1720694,SNP ID4077723, SNP ID3711990, SNP ID3337858, SNP ID4093095, SNP ID4213825,SNP ID3488617, SNP ID3610210, SNP ID3451239, SNP ID1582533, SNP ID3488150, SNPID2770052,SNP ID4141351, SNP ID1335030, SNP ID2211665和 SNP ID4538418 ;或如下每種中的至少一個(gè)多態(tài)性:FGFR2,A2BP1, TNRC9, H19, FSTL5, LSPl,L0C388927, UNQ9391, HCNl,L0C441192, TNRC9, NR3C2, KIAA0826, FLJ31033, AACS, FRMD4A 和 SEC31L2。一般而言,可以檢測(cè)本文圖中的這些或任何其它多態(tài)性/基因/基因座的任何組合,并且所有這類(lèi)組合均任選為本發(fā)明的特征,無(wú)論是否特別列出。本發(fā)明用于檢測(cè)本文多態(tài)性的探針或引物可以包括圖1和/或2多態(tài)性的核苷酸序列,其側(cè)翼序列或其互補(bǔ)核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(例如,由基因組序列例如通過(guò)轉(zhuǎn)錄或剪接產(chǎn)生的nRNA或mRNA形式)。還可以檢測(cè)多肽序列,例如對(duì)任何由核酸指定等位基因形式轉(zhuǎn)錄的多肽序列檢測(cè)多態(tài)性。
[0016]一般而言,與QTL相關(guān)的任何多態(tài)性可以用作QTL的標(biāo)志物。因此,與圖中指定多態(tài)性相關(guān)的標(biāo)志物可以用作指定多態(tài)性的代替(proxy)標(biāo)志物。一般而言,相關(guān)性越緊密,則作為QTL/多態(tài)性的標(biāo)志物越好。因此,期望連鎖基因座可以為距多態(tài)性約為5cM或以下(且任選IcM或以下)的緊密連鎖基因座。
[0017]所述的方法任選包括通過(guò)參照查閱表使多態(tài)性或連鎖基因座與乳腺癌表型建立相關(guān)性,所述的查閱表包含多態(tài)性或連鎖基因座的等位基因與乳腺癌表型的相關(guān)性的信息。用于這種相關(guān)性的數(shù)據(jù)庫(kù)可以為啟發(fā)式的(heuristic),或者以其它方式能夠基于通過(guò)關(guān)聯(lián)標(biāo)志物-性狀信息獲得的信息改進(jìn)相關(guān)性。
[0018]相關(guān)的組合物為本發(fā)明的特征,例如,包含多個(gè)標(biāo)志物探針或擴(kuò)增引物的組合物,所述的標(biāo)志物探針或擴(kuò)增引物檢測(cè)或擴(kuò)增例如如本文所述與乳腺癌表型相關(guān)的多種多態(tài)性。引物/探針可以基于陣列或在溶液中游離。
[0019]在另一個(gè)方面中,還提供了鑒定乳腺癌表型調(diào)控劑的方法。所述的方法包括使?jié)撛诘恼{(diào)控劑接觸基因或基因產(chǎn)物,例如,其中基因或基因產(chǎn)物包含本文所述的多態(tài)性(例如,在圖1和/或2中)或與之緊密連鎖。檢測(cè)潛在調(diào)控劑對(duì)基因或基因產(chǎn)物的作用,由此鑒定潛在的調(diào)控劑是否調(diào)控表型。
[0020]基因或基因產(chǎn)物任選包括選自本文所列那些的多態(tài)性的特定等位基因,但還可以對(duì)其它等位基因測(cè)試調(diào)控劑以便鑒定特異性或非特異性調(diào)控等位基因的調(diào)控劑??梢詼y(cè)試的作用包括如下中的任意種:(a)在有調(diào)控劑存在下基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的升高或降低;(b)在有調(diào)控劑存在下基因廣物活性的升聞或降低;和(C)在有調(diào)控劑存在下基因或基因產(chǎn)物表達(dá)圖式的改變。
[0021]治療乳腺癌表型的試劑盒可以包括所述方法鑒定的調(diào)控劑和用于對(duì)患者給藥以便治療所述表型的說(shuō)明書(shū)。
[0022]除上述方法外,用于實(shí)施所述方法的試劑盒和系統(tǒng)也為本發(fā)明的特征。例如,用于鑒定生物體或其衍生的生物學(xué)樣品的乳腺癌表型的系統(tǒng)為本發(fā)明的一個(gè)特征。該系統(tǒng)包括,例如,一組為檢測(cè)一種或多種多態(tài)性或連鎖基因座中的至少一種等位基因配置的標(biāo)志物探針或引物,例如,其中所述的多態(tài)性為本文所述,例如,在圖1或2中所述的任何多態(tài)性。該系統(tǒng)任選還包括檢測(cè)器,該檢測(cè)器為檢測(cè)來(lái)自所述標(biāo)志物探針或引物組或由該標(biāo)志物探針或引物組產(chǎn)生的擴(kuò)增子的一種或多種信號(hào)輸出,由此鑒定存在或不存在所述的等位基因。一般在該系統(tǒng)中包括使等位基因的存在或不存在與預(yù)測(cè)的表型建立相關(guān)性的系統(tǒng)指令(例如,在該系統(tǒng)計(jì)算機(jī)中包含的軟件)作為系統(tǒng)的組成部分。
[0023]篩選調(diào)控劑的系統(tǒng)也為本發(fā)明的特征。這些系統(tǒng)可以包括,例如,與本文多態(tài)性相關(guān)的基因或基因編碼的表達(dá)產(chǎn)物。這些系統(tǒng)一般包括檢測(cè)器,該檢測(cè)器測(cè)定在有調(diào)控劑存在下基因或基因產(chǎn)物表達(dá)的升高或降低;在有調(diào)控劑存在下基因產(chǎn)物活性的升高或降低;或在有調(diào)控劑存在下基因或基因產(chǎn)物表達(dá)圖式的改變。這些系統(tǒng)還可以包括用于混合和等分調(diào)控劑和/或基因或產(chǎn)物、混合它們、進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室操作(例如純化,合成,細(xì)胞培養(yǎng)等)的流體操作部件。用于記錄調(diào)控 劑作用且任選用于選擇調(diào)控劑的系統(tǒng)指令也為這些系統(tǒng)的任選特征。
[0024]用于進(jìn)行本文任何方法的試劑盒為本發(fā)明的另一個(gè)特征。這類(lèi)試劑盒可以包括用于檢測(cè)本文的任何多態(tài)性的探針或擴(kuò)增子、適當(dāng)?shù)陌b材料和用于實(shí)施所述方法的說(shuō)明書(shū)。
[0025]上述多態(tài)性和基因和相應(yīng)標(biāo)志物探針、擴(kuò)增子或引物可以以物理核酸或多肽的形式或系統(tǒng)說(shuō)明書(shū)的形式具體配置在本文的任何系統(tǒng)中,所述的系統(tǒng)說(shuō)明書(shū)包括有關(guān)核酸和多肽的序列信息。例如,該系統(tǒng)可以包括對(duì)應(yīng)于本文所述基因或多態(tài)性的引物或擴(kuò)增子或者擴(kuò)增其一部分的引物或擴(kuò)增子,所述的基因或多態(tài)性諸如SNP ID2312116,SNPID1622530,SNP ID3712013,SNP ID1509710,SNP ID843029,SNP ID1990126,SNP ID604819,SNP ID3025734, SNP ID1152499, SNP ID4415909, SNP ID1732681, SNP ID4281579,SNP ID4454457, SNP ID2616199, SNP ID1720694, SNP ID4077723, SNP ID3711990,SNP ID3337858, SNP ID4093095, SNP ID4213825, SNP ID3488617, SNP ID3610210,SNP ID3451239, SNP ID1582533, SNP ID3488150, SNP ID2770052, SNP ID4141351, SNPID1335030, SNP ID2211665 和 SNP ID4538418,和 / 或 FGFR2,A2BP1, TNRC9, H19, FSTL5,LSPl,L0C388927, UNQ9391, HCNl,L0C441192, TNRC9, NR3C2, KIAA0826, FLJ31033, AACS,FRMD4A和SEC31L2。正如在上述方法中,標(biāo)志物探針或引物組任選檢測(cè)多個(gè)所述基因或遺傳基因座中的多個(gè)多態(tài)性。因此,例如,標(biāo)志物探針或引物組檢測(cè)本文圖中的這些多態(tài)性或基因或任何其它多態(tài)性、基因或基因座每種中的至少一個(gè)多態(tài)性。任何這類(lèi)探針或引物可以包括任何這類(lèi)多態(tài)性或基因或其互補(bǔ)核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核苷酸序列(例如,由基因組序列,例如通過(guò)轉(zhuǎn)錄或剪接產(chǎn)生的nRNA或mRNA形式)。
[0026]許多可選擇的變體為本發(fā)明的實(shí)施方案。例如,檢測(cè)器一般檢測(cè)一種或多種光發(fā)射,它表示存在或不存在所述的等位基因。說(shuō)明書(shū)一般包含至少一種查閱表,它包括所述等位基因的存在或不存在與所述表型之間的相關(guān)性。系統(tǒng)任選包括測(cè)試樣品,例如,基因組DNA、擴(kuò)增的基因組DNA、cDNA、擴(kuò)增的cDNA、RNA或擴(kuò)增的RNA。樣品可以來(lái)自或衍生自哺乳動(dòng)物,諸如人類(lèi)患者。
[0027]所述方法、試劑盒和系統(tǒng)的所有特征可以彼此結(jié)合使用。例如,用于檢測(cè)調(diào)控劑的系統(tǒng)可以用于實(shí)施調(diào)控劑檢測(cè)方法。用于鑒定乳腺癌表型與多態(tài)性之間相關(guān)性的系統(tǒng)可以用于實(shí)施本文的方法。試劑盒可以用于實(shí)施本文的方法。因此,系統(tǒng)、方法和試劑盒的所述特征可以適用于本文的不同系統(tǒng)、方法和試劑盒。
[0028]本發(fā)明涉及下述各項(xiàng)。
[0029]1.對(duì)生物體或其衍生的生物學(xué)樣品鑒定乳腺癌表型的方法,該方法包括:
[0030]檢測(cè)生物體或生物學(xué)樣品中的多態(tài)性或與之緊密連鎖的基因座,所述的多態(tài)性選自圖1或2的多態(tài)性,其中所述的多態(tài)性與乳腺癌表型相關(guān);并且
[0031]將所述的多態(tài)性或基因座與所述的表型建立相關(guān)性。
[0032]2.項(xiàng)I所述的方法,其中所述的生物體為哺乳動(dòng)物或所述的生物學(xué)樣品衍生自哺乳動(dòng)物。
[0033]3.項(xiàng)I所述的方法,其中所述的生物體為人類(lèi)患者或所述的生物學(xué)樣品衍生自人
類(lèi)患者。
[0034]4.項(xiàng)I所述的方法,其中所述的檢測(cè)包括擴(kuò)增多態(tài)性、連鎖基因座或與之相關(guān)的序列,并且檢測(cè)所得擴(kuò)增子。
[0035]5.項(xiàng)4所述的方法,其中所述的擴(kuò)增包括:
[0036]a)混合擴(kuò)增引物或擴(kuò)增引物對(duì)與分離自所述生物體或生物學(xué)樣品的核酸模板,其中所述的引物或引物對(duì)與鄰近或包含所述的多態(tài)性或連鎖基因座的區(qū)互補(bǔ)或部分互補(bǔ),并且能夠在所述核酸模板上由聚合酶啟動(dòng)核酸聚合;和
[0037]b)使引物或引物對(duì)在包括聚合酶和模板核酸的DNA聚合反應(yīng)中延伸以便生成擴(kuò)增子。
[0038]6.項(xiàng)4所述的方法,其中通過(guò)包括如下一個(gè)或多個(gè)步驟的方法檢測(cè)所述的擴(kuò)增子:使該擴(kuò)增子與陣列雜交;用限制酶消化該擴(kuò)增子;或?qū)崟r(shí)PCR分析。
[0039]7.項(xiàng)4所述的方法,包括對(duì)所述的擴(kuò)增子進(jìn)行部分或完全測(cè)序。
[0040]8.項(xiàng)4所述的方法,其中所述的擴(kuò)增包括進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)或連接酶鏈反應(yīng)(LCR),其中使用分離自所述生物體或生物學(xué)樣品的核酸作為PCR、RT-PCR或LCR中的模板。
[0041]9.項(xiàng)I所述的方法,其中所述的多態(tài)性或連鎖基因座包含單核苷酸多態(tài)性(SNP)。
[0042]10.項(xiàng)I所述的方法,其中所述的多態(tài)性包含選自圖1或2中等位基因的等位基因。
[0043]11.項(xiàng)I所述的方法,其中所述的多態(tài)性為選自下組的單核苷酸多態(tài)性:SNP ID2312116、 SNP ID1622530、 SNP ID3712013、 SNP ID1509710、 SNP ID843029、SNP ID1990126、 SNP ID604819、 SNP ID3025734、 SNP IDl152499、 SNP ID4415909、SNP ID1732681、 SNP ID4281579、 SNP ID4454457、 SNP ID2616199、 SNP ID1720694、SNP ID4077723、 SNP ID3711990、 SNP ID3337858、 SNP ID4093095、 SNP ID4213825、SNP ID3488617、SNP ID3610210、SNP ID3451239、SNP ID1582533、SNP ID3488150、SNPID2770052、SNP ID4141351、SNP ID1335030、SNP ID2211665和 SNP ID4538418。
[0044]12.項(xiàng)I所述的方法,其中所述的多態(tài)性在選自下組的基因或基因座中:FGFR2、A2BP1、TNRC9、H19、FSTL5、LSPU L0C388927、UNQ9391、HCNl、L0C441192、TNRC9、NR3C2、KIAA0826、FLJ31033、AACS、FRMD4A 和 SEC31L2。
[0045]13.項(xiàng)12所述的方法,其中該方法包括檢測(cè)在多個(gè)所述基因中的多個(gè)多態(tài)性或連鎖基因座。
[0046]14.項(xiàng)12所述的方法,其中該方法包括檢測(cè)在FGFR2、A2BP1、TNRC9、H19和FSTL5每種中的至少一個(gè)多態(tài)性。
[0047]15.項(xiàng)12所述的方法,其中該方法包括檢測(cè)SNP ID2312116、SNP ID1622530、SNPID3712013、SNP ID1509710 和 SNP ID843029 每種的至少一個(gè)多態(tài)性。
[0048]16.項(xiàng)12所述的方法,其中該方法包括檢測(cè)如下每種的至少一個(gè)多態(tài)性:SNP ID2312116、 SNP ID1622530、 SNP ID3712013、 SNP ID1509710、 SNP ID843029、SNP ID1990126、 SNP ID604819、 SNP ID3025734、 SNP IDl152499、 SNP ID4415909、SNP ID1732681、 SNP ID4281579、 SNP ID4454457、 SNP ID2616199、 SNP ID1720694、SNP ID4077723、 SNP ID3711990、 SNP ID3337858、 SNP ID4093095、 SNP ID4213825、SNP ID3488617、SNP ID3610210、SNP ID3451239、SNP ID1582533、SNP ID3488150、SNPID2770052.SNP ID414135USNP ID1335030.SNP ID2211665和SNP ID4538418 ;或如下每種中的至少一個(gè)多態(tài)性:FGFR2、A2BP1、TNRC9、H19、FSTL5、LSP1、L0C388927、UNQ9391、HCN1、L0C441192、TNRC9、NR3C2、KIAA0826、FLJ31033、AACS、FRMD4A 和 SEC31L2。
[0049]17.項(xiàng)I所述的方法,其中所述的連鎖基因座為距離所述多態(tài)性約5cM或5cM以下的緊密連鎖基因座。
[0050]18.項(xiàng)I所述的方法,其中將所述多態(tài)性或連鎖基因座與所述乳腺癌表型建立相關(guān)性包括參閱查閱表,該查閱表包含所述多態(tài)性或連鎖基因座的等位基因與所述乳腺癌表型的相關(guān)性的信息。
[0051]19.組合物,包含多個(gè)標(biāo)志物探針或擴(kuò)增引物,該標(biāo)志物探針或擴(kuò)增引物用于檢測(cè)或擴(kuò)增多個(gè)選自下組的多態(tài)性:SNP ID2312116、SNP ID1622530、SNP ID3712013、SNPID1509710.SNP ID843029、SNP ID1990126、SNP ID604819、SNP ID3025734、SNP ID1152499、SNP ID4415909、 SNP ID1732681、 SNP ID4281579、 SNP ID4454457、 SNP ID2616199、SNP ID1720694、 SNP ID4077723、 SNP ID3711990、 SNP ID3337858、 SNP ID4093095、SNP ID4213825、SNP ID3488617、SNP ID3610210、SNP ID3451239、SNP ID1582533、SNPID3488150、SNP ID2770052、SNP ID4141351、SNP ID1335030、SNP ID2211665 和 SNPID4538418。
[0052]20.項(xiàng)19所述的組合物,其中所述的標(biāo)志物探針或擴(kuò)增引物在溶液中游離。
[0053]21.鑒定乳腺癌表型的調(diào)控劑的方法,該方法包括:
[0054]使?jié)撛诘恼{(diào)控劑接觸基因或基因產(chǎn)物,其中所述的基因或基因產(chǎn)物包含選自下組的多態(tài)性或與之緊密連鎖:SNP ID2312116、SNP ID1622530、SNPID3712013、SNPID1509710、SNP ID843029、SNP ID1990126、SNP ID604819、SNP ID3025734、SNP ID1152499、SNP ID4415909、 SNP ID1732681、 SNP ID4281579、 SNP ID4454457、 SNP ID2616199、SNP ID1720694、 SNP ID4077723、 SNP ID3711990、 SNP ID3337858、 SNP ID4093095、SNP ID4213825、SNP ID3488617、SNP ID3610210、SNP ID3451239、SNP ID1582533、SNPID3488150、SNP ID2770052、SNP ID4141351、SNP ID1335030、SNP ID2211665 和 SNPID4538418 ;并且
[0055]檢測(cè)該潛在的調(diào)控劑對(duì)所述基因或基因產(chǎn)物的作用,由此鑒定該潛在的調(diào)控劑是否調(diào)控所述的表型。
[0056]22.項(xiàng)21所述的方法,其中所述的基因或基因產(chǎn)物包含選自下組的多態(tài)性:SNP ID2312116、 SNP ID1622530、 SNP ID3712013、 SNP ID1509710、 SNP ID843029、SNP ID1990126、 SNP ID604819、 SNP ID3025734、 SNP IDl152499、 SNP ID4415909、SNP ID1732681、 SNP ID4281579、 SNP ID4454457、 SNP ID2616199、 SNP ID1720694、SNP ID4077723、 SNP ID3711990、 SNP ID3337858、 SNP ID4093095、 SNP ID4213825、SNP ID3488617、SNP ID3610210、SNP ID3451239、SNP ID1582533、SNP ID3488150、SNPID2770052、SNP ID4141351、SNP ID1335030、SNP ID2211665 和 SNP ID4538418。
[0057]23.項(xiàng)21所述的方法,其中所述的作用選自:
[0058](a)在有所述調(diào)控劑存在下所述基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)升高或降低;
[0059](b)在有所述調(diào)控劑存在下所述基因產(chǎn)物的活性;和升高或降低
[0060](c)在有所述調(diào)控劑存在下所述基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)圖式改變。 [0061]24.治療乳腺癌表型的試劑盒,該試劑盒包含通過(guò)項(xiàng)21所述方法鑒定的調(diào)控劑和將該調(diào)控劑施用于患者以便治療所述表型的說(shuō)明書(shū)。
[0062]25.對(duì)生物體或其衍生的生物學(xué)樣品鑒定乳腺癌表型的系統(tǒng),該系統(tǒng)包含:
[0063]a) 一組標(biāo)志物探針或引物,設(shè)置用于檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)多態(tài)性或連鎖基因座的至少一個(gè)等位基因,其中所述的多態(tài)性選自SNP ID2312116.SNP ID1622530.SNP ID3712013、SNPID1509710、SNP ID843029、SNP ID1990126、SNP ID604819、SNP ID3025734、SNP ID1152499、SNP ID4415909、 SNP ID1732681、 SNP ID4281579、 SNP ID4454457、 SNP ID2616199、SNP ID1720694、 SNP ID4077723、 SNP ID3711990、 SNP ID3337858、 SNP ID4093095、SNP ID4213825、SNP ID3488617、SNP ID3610210、SNP ID3451239、SNP ID1582533、SNPID3488150、SNP ID2770052、SNP ID4141351、SNP ID1335030、SNP ID2211665 和 SNPID4538418 ;
[0064]b)檢測(cè)器,設(shè)置用于檢測(cè)來(lái)自該組標(biāo)志物探針或引物的一種或多種信號(hào)輸出或由該組標(biāo)志物探針或引物產(chǎn)生的擴(kuò)增子,由此鑒定所述等位基因的存在與否;和
[0065]c)系統(tǒng)指令,其將所述等位基因的存在與否與預(yù)測(cè)的表型建立相關(guān)性。
[0066]26.項(xiàng)25所述的系統(tǒng),其中該組標(biāo)志物探針或引物檢測(cè)選自下組的基因中的多態(tài)性:FGFR2、A2BP1、TNRC9、H19、FSTL5、LSP1、L0C388927、UNQ939 UHCNU L0C441192、TNRC9、NR3C2、KIAA0826、FLJ31033、AACS、FRMD4A 和 SEC31L2。
[0067]27.項(xiàng)25所述的系統(tǒng),其中該組標(biāo)志物探針或引物檢測(cè)多個(gè)所述基因或遺傳基因座中的多個(gè)多態(tài)性。
[0068]28.項(xiàng)25所述的系統(tǒng),其中該組標(biāo)志物探針或引物檢測(cè)FGFR2、A2BP1、TNRC9、H19和FSTL5每種中的至少一個(gè)多態(tài)性。
[0069]29.項(xiàng)25所述的系統(tǒng),其中該組標(biāo)志物探針或引物檢測(cè)選自SNP ID2312116、SNPID1622530、SNP ID3712013、SNP ID1509710 和 SNP ID843029 多態(tài)性的至少一個(gè)多態(tài)性。[0070]30.項(xiàng)25所述的系統(tǒng),其中所述的檢測(cè)器檢測(cè)一種或多種光發(fā)射,其中所述的光發(fā)射指示所述等位基因的存在與否。
[0071]31.項(xiàng)25所述的系統(tǒng),其中所述的指令包含至少一種查閱表,該查閱表包括所述等位基因的存在與否與所述表型之間的相關(guān)性。
[0072]32.項(xiàng)25所述的系統(tǒng),其中該系統(tǒng)包含樣品。
[0073]33.項(xiàng)32所述的系統(tǒng),其中所述的樣品包含基因組DNA、擴(kuò)增的基因組DNA、cDNA、擴(kuò)增的cDNA、RNA或擴(kuò)增的RNA。
[0074]34.項(xiàng)32所述的系統(tǒng),其中所述的樣品衍生自哺乳動(dòng)物。
[0075]附圖簡(jiǎn)述
[0076]圖1為優(yōu)選多態(tài)性、基因和與乳腺癌相關(guān)的多態(tài)性的相關(guān)信息的表。
[0077]圖2為優(yōu)選多態(tài)性、基因和與乳腺癌相關(guān)的多態(tài)性的相關(guān)信息的表。
[0078]定義
[0079]應(yīng)理解本發(fā)明并不限于特定的實(shí)施方案,其當(dāng)然可以改變。還應(yīng)理解本文所用術(shù)語(yǔ)的目的僅在于描述特定的實(shí)施方案,但并非旨在限制。除非上下文中另有明確的描述,否則作為本說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求中所用的單數(shù)和單數(shù)形式的術(shù)語(yǔ)例如"一個(gè)/ 一種(a,an)〃和〃所述的(the) 〃任選包括復(fù)數(shù)指示物。因此,例如,提到〃 一種探針〃任選包括多個(gè)探針?lè)肿?;?lèi)似地,根據(jù)上下文的不同,應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)"一種核酸"作為實(shí)用物質(zhì)任選包括該核酸分子的許多拷貝。對(duì)基因或蛋白質(zhì)的字母命名根據(jù)上下文的不同可以指基因形式和/或蛋白質(zhì)形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員完全能夠通過(guò)參比本文的序列、已知的序列和遺傳密碼聯(lián)系相關(guān)生物學(xué)分子的核酸和氨基酸形式。
[0080]除非另作陳述,否則核酸從左到右以5’ 一 3’方向書(shū)寫(xiě)。本說(shuō)明書(shū)中引述的數(shù)值范圍包括確定范圍的數(shù)值并且包括該定義范圍的每個(gè)整數(shù)或任何非整數(shù)的分?jǐn)?shù)。除非另作陳述,否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。盡管與本文所述那些類(lèi)似或相當(dāng)?shù)娜魏畏椒ê臀镔|(zhì)可以用于實(shí)施本發(fā)明的測(cè)試,但是優(yōu)選的物質(zhì)和方法如本文所述。在描述和請(qǐng)求保護(hù)本發(fā)明中,按照如下列出的定義使用下列術(shù)語(yǔ)。
[0081]"表型"為在個(gè)體或群體中可觀察到的性狀或性狀集合。該性狀可以為定量的(數(shù)量性狀或QTL)或定性的。例如,對(duì)乳腺癌的易感性為可以按照本文的方法、組合物、試劑盒和系統(tǒng)監(jiān)測(cè)的表型
[0082]〃乳腺癌易感性表型〃為展示出個(gè)體對(duì)發(fā)生乳腺癌的惡病質(zhì)(predisposition)的表型。展示出對(duì)乳腺癌的惡病質(zhì)的表型可以例如表現(xiàn)出癌癥在具有該表型的個(gè)體中發(fā)生的可能性高于在指定的一組環(huán)境條件(膳食、體力活動(dòng)方案、地理位置等)下的相關(guān)一般群體中的成員。
[0083]"多態(tài)性"為可變的基因座;即在群體內(nèi)多態(tài)性處的核苷酸序列具有一種以上形式或等位基因。術(shù)語(yǔ)"等位基因"意指出現(xiàn)在特定基因座上或在其上編碼的兩種或多種不同核苷酸序列或由這類(lèi)基因座編碼的兩種或多種不同多肽序列之一。例如,第一種等位基因可以出現(xiàn)在一條染色體上,而第二種等位基因出現(xiàn)在第二條同源染色體上,例如,正如對(duì)雜合個(gè)體的不同染色體或群體中的不同純合或雜合個(gè)體之間的不同染色體出現(xiàn)的。多態(tài)性的一個(gè)實(shí)例為"單核苷酸多態(tài)性"(SNP),其為在基因組中的單一核苷酸位置上的多態(tài)性(在特定位置上的核苷酸在個(gè)體或群體之間可變)。
[0084]在等位基因與性狀連鎖且在等位基因的存在為性狀或性狀形式會(huì)在包含該等位基因的個(gè)體中出現(xiàn)的指示物時(shí),該等位基因與該性狀“正”相關(guān)。在等位基因與性狀連鎖且在等位基因的存在為性狀或性狀形式不會(huì)在包含該等位基因的個(gè)體中出現(xiàn)的指示物時(shí),該等位基因與該性狀“負(fù)”相關(guān)。
[0085]在標(biāo)志物多態(tài)性或等位基因可以在統(tǒng)計(jì)學(xué)上(正的或負(fù)的)與特定表型關(guān)聯(lián)時(shí),該標(biāo)志物多態(tài)性或等位基因與該表型(乳腺癌易感性等)"關(guān)聯(lián)"或"相關(guān)"。即特定多態(tài)性與對(duì)照群體(例如,不具有乳腺癌的個(gè)體)相比更常見(jiàn)于病例群體(例如,乳腺癌患者)。通常將這種相關(guān)性推斷為實(shí)際上是致病原因,但不一定一與表型潛在的性狀的基因座的簡(jiǎn)單遺傳連鎖(與之相關(guān))足以使關(guān)聯(lián)/相關(guān)性出現(xiàn)。
[0086]〃有利的等位基因〃為與期望表型,例如乳腺癌抗性正相關(guān)的特定基因座上的等位基因,例如,與乳腺癌惡病質(zhì)負(fù)相關(guān)的等位基因。連鎖標(biāo)志物的有利等位基因?yàn)榕c有利等位基因分離的標(biāo)志物等位基因。染色體區(qū)段的有利等位基因形式為如下染色體區(qū)段,它包括與不利表型正相關(guān)或與物理上位于染色體區(qū)段上的一個(gè)或多個(gè)遺傳基因座上的不利表型負(fù)相關(guān)的核苷酸序列。
[0087]〃不利的等位基因〃為與期望表型負(fù)相關(guān)或與不利表型正相關(guān),例如與乳腺癌易感性正相關(guān)的特定基因座上的等位基因。連鎖標(biāo)志物的不利等位基因?yàn)榕c不利等位基因分離的標(biāo)志物等位基因。染 色體區(qū)段的不利等位基因形式為如下染色體片段,它包括與期望表型負(fù)相關(guān)或與物理上位于該染色體區(qū)段上的一個(gè)或多個(gè)遺傳基因座上的不利表型正相關(guān)的核苷酸序列。
[0088]〃等位基因頻率〃意指等位基因存在于個(gè)體、品系或品系群體內(nèi)基因座上的頻率(比例或百分比)。例如,就等位基因〃A〃而言,基因型〃AA〃、〃Aa〃或〃aa〃的二倍體個(gè)體具有的等位基因頻率分別為1.0,0.5或0.0。可以估計(jì)品系或群體(例如病例或?qū)φ?內(nèi)的等位基因頻率,通過(guò)取來(lái)自該品系或群體的個(gè)體樣品的等位基因頻率的平均值來(lái)進(jìn)行。類(lèi)似地,可以通過(guò)取構(gòu)成所述群體的品系的等位基因頻率的平均值來(lái)計(jì)算等位基因頻率。
[0089]若個(gè)體在指定基因座上僅具有一種類(lèi)型的等位基因(例如,二倍體個(gè)體在兩條同源染色體各自的基因座上具有相同的等位基因拷貝),則該個(gè)體為"純合"的。若一種以上的等位基因類(lèi)型存在于指定基因座上(例如,具有兩種不同等位基因各自的一種拷貝的二倍體個(gè)體),則該個(gè)體為"雜合"的。術(shù)語(yǔ)"同質(zhì)性"表示組中的成員在一個(gè)或多個(gè)特定基因座上具有相同基因型。相反,術(shù)語(yǔ)"異質(zhì)性"用于表示組中的個(gè)體在一個(gè)或多個(gè)特定基因座上的基因型不同。
[0090]〃基因座〃為染色體位置或區(qū)域。例如,多態(tài)基因座為多態(tài)核酸、性狀決定子、基因或標(biāo)志物定位的位置或區(qū)域。在另一個(gè)實(shí)例中,"基因的基因座"為可以發(fā)現(xiàn)特定基因的物種基因組中的特定染色體位置(區(qū)域)。類(lèi)似地,術(shù)語(yǔ)"數(shù)量性狀基因座"或"QTL"意指具有至少兩種等位基因的基因座,所述的兩種等位基因在至少一種遺傳背景中例如在至少一種群體或子代中有差別地影響數(shù)量或連續(xù)表型性狀的表達(dá)或改變數(shù)量或連續(xù)表型性狀的變化形式。
[0091]〃標(biāo)志物",〃分子標(biāo)志物〃或〃標(biāo)志物核酸〃意指在鑒定基因座或連鎖基因座時(shí)用作參比點(diǎn)的核苷酸序列或其編碼的產(chǎn)物(例如蛋白質(zhì))。標(biāo)志物可以衍生自基因組核苷酸序列或表達(dá)的核苷酸序列(例如,衍生自RNA、nRNA、mRNA、cDNA等)或編碼的多肽。該術(shù)語(yǔ)還意指與標(biāo)志物序列互補(bǔ)或位于其側(cè)翼的核酸序列,諸如用作能夠擴(kuò)增該標(biāo)志物序列的探針或引物對(duì)的核酸?!?biāo)志物探針〃為可以用于鑒定標(biāo)志物基因座的存在的核酸序列或分子,例如與標(biāo)志物基因座序列互補(bǔ)的核酸探針。若例如核酸按照沃森-克里克堿基配對(duì)原則在溶液中特異性雜交,則該核酸為〃互補(bǔ)的"?!?biāo)志物基因座〃為可以用于示蹤第二種連鎖基因座的存在的基因座,例如,編碼或促成表型性狀的群體變異的連鎖或相關(guān)基因座。例如,標(biāo)志物基因座可以用于監(jiān)測(cè)在基因座,諸如QTL上的等位基因的分離,這些等位基因在遺傳或物理上與標(biāo)志物基因座連鎖。因此,〃標(biāo)志物等位基因〃,或者〃標(biāo)志物基因座的等位基因",為在對(duì)該標(biāo)志物基因座而目多態(tài)性的群體中的標(biāo)志物基因座上發(fā)現(xiàn)的多個(gè)多態(tài)性核苷酸序列之一。本發(fā)明在一個(gè)方面中提供了與所關(guān)注的表型,例如乳腺癌易感性/抗性相關(guān)的標(biāo)志物基因座。預(yù)計(jì)鑒定的標(biāo)志物各自與促成相關(guān)表型的遺傳元件,例如QTL具有緊密的物理和遺傳鄰近性(導(dǎo)致物理和/或遺傳連鎖)。可以通過(guò)本領(lǐng)域完全確立的方法檢測(cè)群體成員之間對(duì)應(yīng)于遺傳多態(tài)性的標(biāo)志物。這些方法包括,例如,基于PCR的序列特異性擴(kuò)增法、檢測(cè)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、檢測(cè)同工酶標(biāo)志物、檢測(cè)等位基因特異性雜交(ASH)、檢測(cè)單核苷酸延伸、檢測(cè)基因組的擴(kuò)增可變序列、檢測(cè)自維持序列復(fù)制、檢測(cè)單一序列重復(fù)(SSR)、檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)或檢測(cè)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)。
[0092]〃遺傳圖〃 一般以圖或表形式描述指定物種中一條或多條染色體(或連鎖群)上的基因座中的遺傳連鎖(或關(guān)聯(lián))相關(guān)性。"作圖"為通過(guò)使用遺傳標(biāo)志物、標(biāo)志物的群體分離和重組頻率的標(biāo)準(zhǔn)遺傳原理定義基因座連鎖相關(guān)性的過(guò)程。"圖定位"為遺傳圖上相對(duì)于連鎖遺傳標(biāo)志物的指定位置,其中可以在指定物種中發(fā)現(xiàn)特定標(biāo)志物。術(shù)語(yǔ)〃染色體區(qū)段〃指居留在單一染色體上的基因組DNA的連續(xù)的線性跨度。類(lèi)似地,〃單倍型〃為在個(gè)體或群體的可遺傳物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的一組遺傳基因座(該組可以為連續(xù)的或不連續(xù)的)。在本發(fā)明的上下文中,遺傳元件諸如本文的一種或多種等位基因和一種或多種連鎖標(biāo)志物等位基因可以位于染色體區(qū)段內(nèi),且因而是遺傳連鎖的,特定遺傳重組距離小于或等于20厘摩(CM)或20cM以下,例如15cM或15cM以下,通常為IOcM或IOcM以下,例如,約9、8、7、6、5、
`4、3、2、1、0.75,0.5,0.25或0.1CM或以下。即單一染色體區(qū)段內(nèi)兩種緊密連鎖的遺傳元件在減數(shù)分裂過(guò)程中以小于或等于約20%、例如約19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.75%,0.5%、0.25%或0.1%或以下的頻率彼此重組。一旦例如通過(guò)比較病例和對(duì)照的基因座統(tǒng)計(jì)頻率鑒定出表型(例如,乳腺癌惡病質(zhì))與多態(tài)基因座之間的相關(guān)性/關(guān)聯(lián)性,則與相關(guān)基因座連鎖的任何多態(tài)性可以用作相關(guān)基因座的替代標(biāo)志物。
[0093]〃遺傳重組頻率〃為兩個(gè)遺傳基因座之間重組事件的頻率。可以通過(guò)跟蹤減數(shù)分裂過(guò)程中標(biāo)志物和/或性狀的分離來(lái)觀察重組頻率。在本發(fā)明的上下文中,若相關(guān)基因座因染色體物理關(guān)聯(lián)而為相同連鎖群的組成部分且連鎖不平衡(linkage disequilibrium)時(shí),則該標(biāo)志物基因座與另一標(biāo)志物基因座或某些其它基因座(例如,乳腺癌易感性基因座)"有關(guān)聯(lián)"。這一情況在發(fā)現(xiàn)標(biāo)志物基因座和連鎖基因座一起在子代中比基因座隨機(jī)分離更頻繁時(shí)發(fā)生。類(lèi)似地,標(biāo)志物基因座還可以與性狀相關(guān),例如,若標(biāo)志物基因座與性狀連鎖不平衡中(例如,當(dāng)發(fā)現(xiàn)標(biāo)志物在病例中比在對(duì)照群體中更常見(jiàn)時(shí),可以檢測(cè)到這一結(jié)果),則可以說(shuō)標(biāo)志物基因座與指定性狀(乳腺癌抗性或易感性)"相關(guān)"。術(shù)語(yǔ)"連鎖不平衡"意指遺傳基因座或性狀(或它們兩者)的非隨機(jī)分離。在每一情況中,連鎖不平衡意指相關(guān)基因座位于沿染色體長(zhǎng)度的足夠物理接近內(nèi),使得它們以大于隨機(jī)的頻率彼此分離(就共分離性狀而言,性狀潛在的基因座彼此有足夠的接近性)。連鎖基因座共分離50%以上的機(jī)會(huì),例如,約51% —約100%的機(jī)會(huì)。有利的是,兩個(gè)基因座彼此緊密鄰近定位,使得同源染色體對(duì)之間的重組以高頻率在減數(shù)分裂過(guò)程中在兩個(gè)基因座之間不發(fā)生,例如,使得緊密連鎖的基因座共分離至少約80%的機(jī)會(huì),更優(yōu)選至少約85%的機(jī)會(huì),更優(yōu)選至少 90% 的機(jī)會(huì),例如,91%,92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.75% 或 99.90%或以上的機(jī)會(huì)。
[0094]本申請(qǐng)中的術(shù)語(yǔ)〃緊密連鎖〃意指兩個(gè)連鎖的基因座(例如,SNP,諸如圖1或2中鑒定的(例如,通過(guò)比較病例和對(duì)照群體得出與乳腺癌表型相關(guān))和第二種連鎖多態(tài)性)之間重組以等于或小于約20%的頻率發(fā)生。換言之,緊密(或〃緊固〃)連鎖的基因座共分離至少80%的機(jī)會(huì)。標(biāo)志物基因座在它們與靶基因座(例如,乳腺癌的QTL,或單純的其它乳腺癌標(biāo)志物基因座)緊密連鎖時(shí)對(duì)本發(fā)明尤其有用。標(biāo)志物與靶基因座連鎖得越緊密,則該標(biāo)志物為靶基因座指示物越好。因此,在一個(gè)實(shí)施方案中,緊密連鎖的基因座,諸如標(biāo)志物基因座和第二種基因座展示出約20%或以下,例如,15%或以下,例如,10%或以下,優(yōu)選約9%或以下,更優(yōu)選約8%或以下,更優(yōu)選約7%或以下,更優(yōu)選約6%或以下,更優(yōu)選約5%或以下,更優(yōu)選約4%或以下,更優(yōu)選約3%或以下且更優(yōu)選約2%或以下的基因座間重組頻率。在高度優(yōu)選的實(shí)施方案中,相關(guān)基因座(例如,標(biāo)志物基因座和靶基因座,諸如QTL)展示出約1%或以下,例如,約0.75%或以下,更優(yōu)選約0.5%或以下、或更優(yōu)選約0.25%或以下、或更優(yōu)選約0.1%或以下的重組頻率。還認(rèn)為對(duì)于位于同一染色體上的兩個(gè)基因座并且在兩個(gè)基因座之間以小于約20%,例如15%,更優(yōu)選10%(例如,約9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%,0.75%, 0.5%, 0.25%, 0.1%或以下)的頻率發(fā)生重組的這類(lèi)距離上,兩個(gè)基因座為彼此〃鄰近的"。當(dāng)提到兩個(gè)連鎖遺傳元件,諸如促成性狀的遺傳元件和鄰近標(biāo)志物的相關(guān)性時(shí),"偶聯(lián)〃相連鎖表示位于性狀基因座上的〃有利〃等位基因以物理方式結(jié)合在與相應(yīng)連鎖標(biāo)志物基因座的"有利"等位基因相同的染色體鏈上的狀態(tài)。在偶聯(lián)相中,兩種有利的等位基因一起通過(guò)遺傳該染色體鏈的子代遺傳。在"排斥"相連鎖中,在所關(guān)注的基因座(例如,乳腺癌易感性的QTL)上的〃有利〃等位基因以物理方式結(jié)合在與鄰近標(biāo)志物基因座上〃不利"等位基因相同的染色體鏈上,并且兩個(gè)"有利"的等位基因不一起遺傳(即兩個(gè)基因座彼此〃異相〃)。
[0095]在有關(guān)核酸擴(kuò)增的上下文中術(shù)語(yǔ)"擴(kuò)增"為產(chǎn)生所選核酸(或其轉(zhuǎn)錄形式)的額外拷貝的任何過(guò)程。典型的擴(kuò)增方法包括基于各種聚合酶的復(fù)制方法,包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶介導(dǎo)的方法諸如連接酶鏈反應(yīng)(LCR)和基于RNA聚合酶的擴(kuò)增(例如,通過(guò)轉(zhuǎn)錄)法。"擴(kuò)增子"為擴(kuò)增得到的核酸,例如通過(guò)用任何可利用的擴(kuò)增方法(例如,PCR、LCR、轉(zhuǎn)錄等)擴(kuò)增模板核酸產(chǎn)生的核酸。
[0096]〃基因組核酸〃為序列上對(duì)應(yīng)于細(xì)胞中可遺傳核酸的核酸。常見(jiàn)的實(shí)例包括核基因組DNA及其擴(kuò)增子。在某些情況中,基因組核酸不同于剪接RNA或相應(yīng)cDNA,即剪接的RNA或cDNA例如被剪接機(jī)制加工以除去內(nèi)含子。基因組核酸任選包含不轉(zhuǎn)錄(例如,染色體結(jié)構(gòu)序列、啟動(dòng)子區(qū)、增強(qiáng)子區(qū)等)和/或不翻譯的序列(例如內(nèi)含子),而剪接的RNA/cDNA—般不具有內(nèi)含子。"模板基因組核酸"為用作擴(kuò)增反應(yīng)(例如,基于聚合酶的擴(kuò)增反應(yīng),諸如PCR ;連接酶介導(dǎo)的擴(kuò)增反應(yīng),諸如LCR ;轉(zhuǎn)錄反應(yīng)等)中的模板的基因組核酸。
[0097]〃外源性核酸〃為對(duì)特定系統(tǒng)(例如,種質(zhì)、細(xì)胞、個(gè)體等)而言在序列、基因組位置或它們兩者方面非天然的核酸。本文作為應(yīng)用于多核苷酸或多肽所用的術(shù)語(yǔ)"外源性"或"異源性"一般意指以人工方式提供給生物系統(tǒng)(例如,細(xì)胞、個(gè)體等)并且對(duì)特定生物學(xué)系統(tǒng)而言為非天然的分子。該術(shù)語(yǔ)可以表示該相關(guān)物資源自非天然存在來(lái)源的來(lái)源,或可以指具有部分非天然構(gòu)造、遺傳位置或排列的分子。
[0098]術(shù)語(yǔ)〃導(dǎo)入〃在指將異源性或外源性核酸轉(zhuǎn)移入細(xì)胞時(shí)意指使用任何方法將核酸摻入細(xì)胞。該術(shù)語(yǔ)涵蓋諸如〃轉(zhuǎn)染〃、〃轉(zhuǎn)化〃和〃轉(zhuǎn)導(dǎo)〃這類(lèi)核酸導(dǎo)入方法。
[0099]本文所用的術(shù)語(yǔ)〃載體〃用于指將核酸區(qū)段轉(zhuǎn)入細(xì)胞的多核苷酸或其它分子。術(shù)語(yǔ)〃媒介(vehicle) 〃有時(shí)與〃載體(vector) 〃可以互換使用。載體任選包含介導(dǎo)載體維持并且能夠?qū)崿F(xiàn)指定應(yīng)用的部分(例如,復(fù)制必需序列、傳遞藥物或抗生素抗性的基因、多克隆位點(diǎn)、能夠表達(dá)所克隆基因的可操作連接的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件等)。載體通常衍生自質(zhì)粒、噬菌體、或植物或動(dòng)物病毒。〃克隆載體〃或〃穿梭載體〃或〃亞克隆載體〃包含有利于亞克隆步驟的可操作連接的部分(例如,包含多個(gè)限制性?xún)?nèi)切核酸酶位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn))。
[0100]本文所用的術(shù)語(yǔ)〃表達(dá)載體〃意指包含有利于特定宿主生物體中編碼序列表達(dá)的可操作連接的多核苷酸序列(例如,細(xì)菌表達(dá)載體或哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體)。有利于原核細(xì)胞中表達(dá)的多核苷酸序列一般包括,例如,啟動(dòng)子、操縱基因(任選)和核糖體結(jié)合位點(diǎn),通常還有其它序列。真核細(xì) 胞可以使用啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止和聚腺苷酸化信號(hào)、和一般不同于原核細(xì)胞所用的其它序列。在一個(gè)任選的實(shí)施方案中,將對(duì)應(yīng)于本文基因座的基因克隆入表達(dá)載體并且表達(dá),其中將基因產(chǎn)物用于本文的方法和系統(tǒng)以便進(jìn)行調(diào)控劑鑒定。
[0101]若特定的核酸是使用指定的核酸序列構(gòu)建的,或者特定的核酸是使用指定的核酸構(gòu)建的,則該特定的核酸〃衍生自〃該指定的核酸。
[0102]〃基因〃為基因組中一起編碼一種或多種表達(dá)分子,例如RNA或多肽的一種或多種核苷酸序列?;蚩梢园ㄞD(zhuǎn)錄成RNA、隨后可翻譯成多肽序列的編碼序列,并且可以包括有助于基因復(fù)制或表達(dá)的相關(guān)結(jié)構(gòu)序列或調(diào)控序列。本發(fā)明中所關(guān)注的基因包括包含圖1和/或2的基因座或與之緊密連鎖的那些。
[0103]〃基因型〃為一個(gè)或多個(gè)遺傳基因座上單個(gè)(單個(gè)成組)的遺傳組成。基因型由個(gè)體的一個(gè)或多個(gè)已知基因座的等位基因確定,一般為從其親代遺傳的等位基因的匯編。"單倍型"為個(gè)體在單一 DNA鏈上的多個(gè)遺傳基因座的基因型。一般而言,由單倍型描述的遺傳基因座在物理和遺傳上連鎖,即在相同染色體鏈上。
[0104]標(biāo)志物或探針〃組〃意指標(biāo)志物或探針的集合或組,或其衍生的數(shù)據(jù),它們用于常用目的,例如鑒定具有特定表型(例如,乳腺癌抗性或易感性)的個(gè)體。通常將對(duì)應(yīng)于標(biāo)志物或探針或衍生自其應(yīng)用的數(shù)據(jù)儲(chǔ)存在電子介質(zhì)中。盡管一組中的成員各自具有在特定目的方面的應(yīng)用,但是選自該組和亞組(其包括某些,但并非所有的標(biāo)志物)的各個(gè)標(biāo)志物也有效地實(shí)現(xiàn)特定目的。
[0105]〃查閱表〃為使一種數(shù)據(jù)形式與另一種數(shù)據(jù)形式或使一種或多種數(shù)據(jù)形式與該數(shù)據(jù)相關(guān)的預(yù)測(cè)結(jié)果建立相關(guān)性的表。例如,查閱表可以包括等位基因數(shù)據(jù)與包含一種或多種指定等位基因的個(gè)體有可能展示出的預(yù)測(cè)性狀之間的相關(guān)性。這些表可以并且一般為多維的,例如同時(shí)考慮多個(gè)等位基因,并且還任選考慮其它因素,諸如遺傳背景,例如在進(jìn)行性狀預(yù)測(cè)時(shí)。
[0106]"計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)"為可通過(guò)使用可利用或定制界面的計(jì)算機(jī)讀取的信息儲(chǔ)存介質(zhì)。實(shí)例包括內(nèi)存(例如ROM或RAM、閃存等)、光存儲(chǔ)介質(zhì)(例如,CD-ROM)、磁存儲(chǔ)介質(zhì)(計(jì)算機(jī)硬驅(qū)、軟盤(pán)等)、穿孔卡片和可商購(gòu)的許多其它介質(zhì)。信息可以在所關(guān)注的系統(tǒng)與計(jì)算機(jī)之間傳輸,傳輸出入計(jì)算機(jī)或出入計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)以?xún)?chǔ)存或讀取所存儲(chǔ)的信息。這種傳輸可以為電子傳輸,或可以通過(guò)其它可利用的方法,諸如IR鏈接、無(wú)線連接等進(jìn)行。
[0107]"系統(tǒng)指令"為可以由系統(tǒng)部分或完全執(zhí)行的指令集。一般而言,該指令集作為系統(tǒng)軟件存在。
[0108]〃翻譯產(chǎn)物〃為作為核酸翻譯結(jié)果產(chǎn)生的產(chǎn)物(一般為多肽)?!ㄞD(zhuǎn)錄產(chǎn)物〃為作為核酸(例如,DNA)轉(zhuǎn)錄結(jié)果產(chǎn)生的產(chǎn)物(例如,RNA,任選包括mRNA,或例如催化性或生物學(xué)活性RNA)。
[0109]〃陣列〃為元件集合。該集合可以為空間排序的(〃樣式陣列〃)或混亂的(〃隨機(jī)樣式"陣列)。陣列可以形成或包含一種或多種功能性元件(例如,微陣列上的探針區(qū))或它可以為非功能性的。
[0110]本文所用的術(shù)語(yǔ)"SNP"或〃單核苷酸多態(tài)性〃意指?jìng)€(gè)體之間的遺傳變異;例如,可變的生物體DNA中的單一含氮堿基位置。本文所用的〃SNPs〃為SNP的復(fù)數(shù)。當(dāng)然,當(dāng)意指本文的DNA時(shí),這類(lèi)參比物可以包括DNA的衍生物,諸如擴(kuò)增子、其RNA轉(zhuǎn)錄物等。
[0111]發(fā)明詳述
[0112]鐘述
[0113]本發(fā)明包括圖1和2的多態(tài)性(和包括多態(tài)性或與之鄰近的基因)與乳腺癌惡病質(zhì)之間的新相關(guān)性。在這些基因或基因產(chǎn)物中及與之連鎖的某些等位基因可預(yù)測(cè)具有相關(guān)等位基因的個(gè)體發(fā)生乳腺癌的可能性。因此,通過(guò)任何可利用的方法檢測(cè)這些等位基因可以用于診斷目的,諸如對(duì)乳腺癌易感性的早期診斷、具有乳腺癌的患者的預(yù)后和有助于診斷,例如,當(dāng)目前的標(biāo)準(zhǔn)不足以確定診斷時(shí)。
[0114]圖1或2的多態(tài)性、基因或基因產(chǎn)物與乳腺癌表型相關(guān)的鑒定還提供了用于篩選乳腺癌病癥的潛在調(diào)控劑的平臺(tái)。預(yù)計(jì)對(duì)應(yīng)于圖1和2的多態(tài)性的任何基因或編碼蛋白質(zhì)的活性的調(diào)控劑對(duì)乳腺癌有作用。因此,篩選方法、篩選系統(tǒng)等為本發(fā)明的特征。通過(guò)這些篩選手段鑒定的調(diào)控劑也為本發(fā)明的特征。
[0115]例如包括鑒定相關(guān)等位基因的探針、包裝材料和使相關(guān)等位基因的檢測(cè)與乳腺癌建立相關(guān)性的說(shuō)明書(shū)的乳腺癌診斷和治療試劑盒也為本發(fā)明的特征。這些試劑盒還可以包括乳腺癌調(diào)控劑和/或關(guān)于使用常規(guī)方法治療患者的說(shuō)明書(shū)。
[0116]鑒定乳腺癌惡病質(zhì)的方法
[0117]正如所述的,本發(fā)明提供了圖1和2的某些基因或其它基因座與乳腺癌表型連鎖的發(fā)現(xiàn)。因此,通過(guò)檢測(cè)與相關(guān)表型正或負(fù)相關(guān)的標(biāo)志物(例如,圖1或2中的SNP與之緊密連鎖的基因座),可以確定個(gè)體或群體是否可能包含這些表型。這為鑒定處于乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)中的患者提供了增強(qiáng)的早期檢測(cè)選擇,從而在某些情況中有可能例如通過(guò)采取早期預(yù)防行動(dòng)(例如,任何現(xiàn)有的療法,包括預(yù)防性手術(shù)、膳食、鍛煉、可利用的藥物等)預(yù)防癌癥的實(shí)際發(fā)生。此外,各種本文標(biāo)志物的應(yīng)用還為現(xiàn)存的鑒定患者是否患有特定形式乳腺癌的診斷技術(shù)增加了確定性。此外,是否存在該病的分子基礎(chǔ)的知識(shí)也可有助于例如通過(guò)提供患者對(duì)乳腺癌常規(guī)療法有響應(yīng)的可能性如何的指征來(lái)確定患者的預(yù)后。還可以基于患者展示出何種類(lèi)型的分子病癥來(lái)靶向疾病的治療。
[0118]用于檢測(cè)相關(guān)等位基因的檢測(cè)方法可以包括任何可利用的方法,例如,擴(kuò)增技術(shù)。例如,檢測(cè)可以包括擴(kuò)增多態(tài)性或與之相關(guān)的序列并且檢測(cè)所得擴(kuò)增子。例如,該方法可以包括混合擴(kuò)增引物或擴(kuò)增引物對(duì)與分離自生物體或生物學(xué)樣品(例如包含SNP或其它多態(tài)性)的核酸模板,其中所述的引物或引物對(duì)與基因或緊密連鎖的多態(tài)性的至少一部分或與之鄰近的序列互補(bǔ)或部分互補(bǔ)。引物一般能夠啟動(dòng)聚合酶在核酸模板上的核酸聚合。所述的引物或引物對(duì)例如在包含聚合酶和模板核酸的DNA聚合反應(yīng)(PCR、RT-PCR等)中延伸而生成擴(kuò)增子。通過(guò)可利用的檢測(cè)方法,例如測(cè)序、使擴(kuò)增子與陣列雜交(或使擴(kuò)增子附著在陣列上并且使探針與之雜交)、用限制酶消化擴(kuò)增子(例如,RFLP)、實(shí)時(shí)PCR分析、單核苷酸延伸、等位基因特異性雜交等來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增子。
[0119]可以通過(guò)可鑒定等位基因與表型之間相關(guān)性的任何方法形成所檢測(cè)的多態(tài)性與性狀之間的相關(guān)性。最一般的情況是,這些方法包括參照包含多態(tài)性的等位基因與表型之間相關(guān)性的查閱表。該表可以包括多種等位基因-表型相關(guān)性的數(shù)據(jù)并且可以考慮到多種等位基因-表型相關(guān)性的疊加或其它高級(jí)作用,例如,通過(guò)使用統(tǒng)計(jì)學(xué)工具,諸如主要成分分析、啟發(fā)式算法等。
[0120]在這些方法的內(nèi)容中,下列討論首先集中在標(biāo)志物與等位基因如何連鎖和該現(xiàn)象如何應(yīng)用于鑒定乳腺癌表型的方法的內(nèi)容中,然后集中在標(biāo)志物檢測(cè)方法。下面的別的部分討論了數(shù)據(jù)分析。
[0121] fa志物、連鎖和等位基因
[0122]在傳統(tǒng)的連鎖(或關(guān)聯(lián))分析中,無(wú)需染色體上基因的物理相關(guān)性的直接知識(shí)。孟德?tīng)柕谝环▌t為成對(duì)特征的因素是分離的,意味著二倍體性狀的等位基因分離成兩個(gè)配子且然后分離成不同的子代。經(jīng)典的連鎖分析可以視為對(duì)不同性狀的共分離的相對(duì)頻率的統(tǒng)計(jì)學(xué)描述。連鎖分析為性狀如何基于它們一起分離的頻率一起分組的充分表征的描述框架。即,如果兩個(gè)非等位基因的性狀以高于隨機(jī)的頻率一起遺傳,那么就說(shuō)它們是"連鎖的〃。性狀一起遺傳的頻率為性狀如何緊密連鎖的主要度量,即以較高頻率一起遺傳的性狀比以較低(但仍然高于隨機(jī))頻率一起遺傳的性狀更緊密連鎖。性狀連鎖是因?yàn)樾誀顫撛诘幕虮舜私咏匚挥谕蝗旧w上。基因所在的染色體上的間隔越大,則它們一起分離的可能性越低,因?yàn)橥慈旧w在減數(shù)分裂過(guò)程中重組。因此,基因所在的染色體上的間隔越大,則在減數(shù)分裂過(guò)程中有重組事件的可能性越大,所述的重組會(huì)導(dǎo)致兩種基因彼此分離而進(jìn)入子代。
[0123]連鎖(或關(guān)聯(lián))的常見(jiàn)度量為性狀共分離的頻率??梢詫⒋吮硎鰹楣卜蛛x百分比(重組頻率),或同樣常用的以厘摩(CM)表示,它們實(shí)際上為重組頻率的倒數(shù)單位。CM以開(kāi)拓性遺傳學(xué)家Thomas Hunt Morgan命名并且為遺傳重組頻率的度量單位。I個(gè)cM等于因單代(single generation)中的重組,一個(gè)遺傳基因座上的性狀與另一基因座上的性狀分離的機(jī)會(huì)為1% (這意味著這些性狀99%的機(jī)會(huì)一起分離)。因?yàn)槿旧w距離與性狀間重組事件頻率大致成正比,所以存在與重組頻率相關(guān)的近似物理距離。例如,在人體中,IcM平均與約I百萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)(IMbp)相關(guān)。[0124]標(biāo)志物基因座自身為性狀并且可以按照標(biāo)準(zhǔn)連鎖分析,通過(guò)在分離過(guò)程中示蹤標(biāo)志物基因座來(lái)評(píng)價(jià)。因此,在本發(fā)明的上下文中,I CM等于因單代中的重組,標(biāo)志物基因座與另一基因座(可以為任何其它性狀,例如另一種標(biāo)志物基因座,或編碼乳腺癌QTL的另一種性狀基因座)分離的機(jī)會(huì)為1%。本文的標(biāo)志物,例如,圖1和2中所列的那些,可以與乳腺癌相關(guān)。這意味著所述的標(biāo)志物包含乳腺癌的QTL或與之足夠鄰近,即它們自身可以用作性狀的預(yù)測(cè)物。這在疾病診斷方面極為有用。
[0125]已經(jīng)在病例(乳腺癌患者)與對(duì)照群體中將圖1和2的多態(tài)性鑒定為更普遍的。與所關(guān)注的性狀基因座連鎖的任何標(biāo)志物(例如,在目前情況中為乳腺癌的QTL或鑒定的連鎖標(biāo)志物基因座,例如,如在圖1和2中)可以用作該性狀的標(biāo)志物。因此,在圖1和2中注意到的外,與這些圖中詳細(xì)列舉的標(biāo)志物緊密連鎖的其它標(biāo)志物也可以有用地預(yù)測(cè)圖中所不的標(biāo)志物等位基因(和由此的相關(guān)表型性狀)的存在。在它們足夠鄰近指定基因座,使得它們展示出與指定基因座的低重組頻率時(shí),這類(lèi)連鎖的標(biāo)志物特別有用,。在本發(fā)明中,這類(lèi)緊密連鎖的標(biāo)志物為本發(fā)明的特征。緊密連鎖的基因座展示出與指定標(biāo)志物的重組頻率為約20%或以下(指定基因在指定標(biāo)志物的20cM內(nèi))。換言之,緊密連鎖的基因座至少80%的機(jī)會(huì)共分離。更優(yōu)選重組頻率為10%或以下,例如,9%,8%,7%,6%,5%,4%,3%,2%,1%, 0.5%, 0.25%或0.1%或以下。在一種典型類(lèi)型的實(shí)施方案中,緊密連鎖的基因座彼此在5cM或以下內(nèi)。
[0126]正如本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到的,重組頻率(和作為結(jié)果的圖位置)可以根據(jù)所用圖(和圖上的標(biāo)志物)而改變。與圖1和2中鑒定的標(biāo)志物緊密連鎖的(例如,在約20cM內(nèi),更優(yōu)選在約IOcM內(nèi),更優(yōu)選在5cM內(nèi))別的標(biāo)志物易于用于鑒定乳腺癌惡病質(zhì)的QTL。 [0127]在標(biāo)志物基因座與靶基因座(例如,乳腺癌表型的QTL,或可選擇地,自身與這類(lèi)QTL連鎖的其它標(biāo)志物基因座)(所述標(biāo)志物基因座作為所述靶基因的標(biāo)志物)緊密連鎖時(shí),該標(biāo)志物基因座尤其可用于本發(fā)明。標(biāo)志物與編碼或影響表型性狀的靶基因座連鎖得越緊密,則該標(biāo)志物作為靶基因座的指示物越好(因靶基因座與標(biāo)志物之間的交叉(cross-over)頻率下降)。因此,在一個(gè)實(shí)施方案中,緊密連鎖的基因座諸如標(biāo)志物基因座和第二種基因座(例如圖1和2的指定標(biāo)志物基因座和別的第二種基因座)展示出約20%或以下,例如15%或以下,優(yōu)選10%或以下,更優(yōu)選約9%或以下,更優(yōu)選約8%或以下,更優(yōu)選約7%或以下,更優(yōu)選約6%或以下,更優(yōu)選約5%或以下,更優(yōu)選約4%或以下,更優(yōu)選約3%或以下且更優(yōu)選約2%或以下的基因座間交叉頻率。在非常優(yōu)選的實(shí)施方案中,相關(guān)基因座(例如,標(biāo)志物基因座和靶基因座諸如QTL)展示出約1%或以下,例如約0.75%或以下,更優(yōu)選約0.5%或以下,或更優(yōu)選約0.25%或0.1%或以下的重組頻率。因此,基因座相距約 20cM, 19cM, 18cM,17cM,16cM,15cM,14cM,13cM,12cM,IlcM,IOcM,9cM,8cM,7cM,6cM,5cM,4cM,3cM,2cM,lcM,0.75cM,0.5cM,0.25cM,0或0.1cM以下。換言之,認(rèn)為位于相同染色體上并且在兩個(gè)基因座之間的重組以低于20%(例如,約19%,18%,17%,16%,15%,14%,13%,12%,11%,10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%,0.75%, 0.5%, 0.25%, 0.1% 或以下)的頻率出現(xiàn)的這類(lèi)距離上的兩個(gè)基因座彼此〃鄰近〃。在一個(gè)方面中,連鎖標(biāo)志物彼此在IOOkb內(nèi)(在人體中對(duì)應(yīng)于約0.lcM,這取決于局部重組率),例如,50kb,乃至20kb或以下。
[0128]當(dāng)涉及兩種遺傳元件,諸如促成乳腺癌的遺傳元件與鄰近標(biāo)志物之間的相關(guān)性時(shí),〃偶聯(lián)〃相連鎖表示位于基因座上的〃有利〃等位基因以物理方式結(jié)合在與相應(yīng)的連鎖標(biāo)志物基因座的"有利"等位基因相同的染色體鏈上的狀態(tài)。在偶聯(lián)相中,兩種有利的等位基因一起通過(guò)遺傳該染色體鏈的子代遺傳。在"排斥"相連鎖中,在所關(guān)注的基因座(例如,乳腺癌的QTL)上的〃有利〃等位基因以物理方式與位于鄰近標(biāo)志物基因座上的〃不利〃等位基因連鎖,并且兩個(gè)〃有利〃的等位基因不一起遺傳(即兩個(gè)基因座彼此〃異相")。[0129]在示蹤基因組和相應(yīng)表達(dá)的核酸和多肽中的SNP和其它多態(tài)性外,個(gè)體或群體之間的mRNA或蛋白質(zhì)形式的圖1和2基因產(chǎn)物的表達(dá)水平差異也與乳腺癌相關(guān)。因此,本發(fā)明的標(biāo)志物可以包括如下的任意種,例如:基因組基因座、轉(zhuǎn)錄的核酸、剪接的核酸、表達(dá)的蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄的核酸的水平、剪接的核酸的水平和表達(dá)的蛋白質(zhì)的水平。
[0130]標(biāo)志物擴(kuò)增策略
[0131]用于擴(kuò)增標(biāo)志物(例如,標(biāo)志物基因座)的擴(kuò)增引物和用于檢測(cè)這類(lèi)標(biāo)志物或?qū)悠吩诙喾N標(biāo)志物等位基因方面進(jìn)行基因分型合適探針為本發(fā)明的特征。在圖1和2中,提供了用于擴(kuò)增的特定基因座及這類(lèi)引物設(shè)計(jì)中已知的側(cè)翼序列。例如,用于遠(yuǎn)程PCR的引物選擇描述在2002年I月9日提交的USSN10/042,406和2002年9月5日提交的USSN10/236, 480中;就近程PCR而言,2003年I月14日提交的USSN10/341,832中提供了有關(guān)引物選擇的指導(dǎo)原則。此外,存在公眾可用于進(jìn)行引物設(shè)計(jì)的程序,諸如"Oligo"。使用這類(lèi)可利用的引物選擇和設(shè)計(jì)軟件、圖1和2中提供的公眾可利用的人類(lèi)基因組序列和多態(tài)性位置,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以構(gòu)建引物以便擴(kuò)增本發(fā)明的SNP。此外,可以理解用于檢測(cè)包含SNP的核酸(例如,包含SNP的擴(kuò)增子)的精確探針可以改變,例如,可以鑒定所檢測(cè)的標(biāo)志物擴(kuò)增子區(qū)的任何探針可以與本發(fā)明結(jié)合使用。此外,檢測(cè)探針的構(gòu)造當(dāng)然可以改變。因此,本發(fā)明并不限于本文所述的序列。
[0132]實(shí)際上,可以理解擴(kuò)增并非標(biāo)志物檢測(cè)所要求的-例如,可以單純通過(guò)對(duì)基因組DNA樣品進(jìn)行Southern印跡來(lái)直接檢測(cè)未擴(kuò)增的基因組DNA。用于進(jìn)行Southern印跡、標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增(PCR、LCR等)和許多其它核酸檢測(cè)方法的規(guī)程為充分確立的并且例如教導(dǎo)在下列文獻(xiàn)中:Sambrook 等,Molecular Cloning-A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York,2000(〃Sambrook〃);Current Protocols in Molecular Biology, F.M.Ausubel 等,eds., Current Protocols,Greene Publishing Associates, Inc.和 John ffiley&Sons, Inc.的合作項(xiàng)目,(增補(bǔ)至2002) ("Ausubel"))和 PCRProtocols A Guide to Methods and Applications(Innis 等eds)Academic Press Inc.San Diego, CA(1990)(Innis).[0133]在擴(kuò)增/檢測(cè)方法中,例如,還可以通過(guò)進(jìn)行檢測(cè)產(chǎn)物形成的實(shí)時(shí)擴(kuò)增反應(yīng)來(lái)省略單獨(dú)的檢測(cè)探針,其中在摻入產(chǎn)物時(shí)修飾相關(guān)擴(kuò)增引物,將標(biāo)記的核苷酸摻入擴(kuò)增子,或監(jiān)測(cè)與未擴(kuò)增的前體相比擴(kuò)增子的分子旋轉(zhuǎn)特性的改變(例如,通過(guò)熒光偏振)。
[0134]一般而言,通過(guò)本領(lǐng)域中任何可利用的確立的方法檢測(cè)分子標(biāo)志物,包括,但不限于等位基因特異性雜交(ASH)、檢測(cè)單核苷酸延伸、陣列雜交(任選包括ASH)或其它檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)的方法、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)檢測(cè)、擴(kuò)增可變序列檢測(cè)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)檢測(cè)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)檢測(cè)、自維持序列復(fù)制檢測(cè)、單一序列重復(fù)(SSR)檢測(cè)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)檢測(cè)、同工酶標(biāo)志物檢測(cè)、Northern分析(其中將表達(dá)水平用作標(biāo)志物)、mRNA或cDNA的定量擴(kuò)增等。盡管圖中提供的例示性標(biāo)志物為SNP標(biāo)志物,但是上述任何標(biāo)志物類(lèi)型均可以用于本發(fā)明的上下文中,以便鑒定與乳腺癌表型相關(guān)的連鎖基因座。
[0135]用于標(biāo)志物檢測(cè)的例示技術(shù)
[0136]本發(fā)明提供了包含乳腺癌表型的QTL或與之連鎖的分子標(biāo)志物。這些標(biāo)志物應(yīng)用于疾病惡病質(zhì)診斷、預(yù)后、治療等。并非意圖將本發(fā)明限于用于檢測(cè)這些標(biāo)志物的任何特定方法。
[0137]可以通過(guò)大量本領(lǐng)域中充分確立的方法來(lái)檢測(cè)對(duì)應(yīng)于群體成員之間的遺傳多態(tài)性的標(biāo)志物(例如,基于PCR的序列特異性擴(kuò)增、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、同工酶標(biāo)志物、Northern分析、等位基因特異性雜交(ASH)、基于陣列的雜交、擴(kuò)增可變基因組序列、自維持序列復(fù)制、單一序列重復(fù)(SSR)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA("RAPD")或擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP))。在另一個(gè)實(shí)施方案中,單純通過(guò)測(cè)定多態(tài)性標(biāo)志物區(qū)的核苷酸序列來(lái)確定分子標(biāo)志物的存在與否。任何這些方法均易于適合于高通量分析。
[0138]用于檢測(cè)遺傳標(biāo)志物的某些技術(shù)利用探針核酸與對(duì)應(yīng)于遺傳標(biāo)志物的核酸(例如,使用基因組DNA作為模板產(chǎn)生的擴(kuò)增的核酸)的雜交。雜交方式,包括,但不限于:溶液相、固相、混合相或原位雜交測(cè)定法,可用于等位基因檢測(cè)。應(yīng)用于核酸雜交的廣泛指導(dǎo)原則見(jiàn) Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes Elsevier,New York 以及 Sambrook,Berger 和 Ausubel。
[0139]例如,包含限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)的標(biāo)志物例如通過(guò)使一般為待檢測(cè)核酸的亞片段(或?qū)?yīng)于亞片段的寡核苷酸)的探針與限制性消化基因組DNA雜交來(lái)檢測(cè)。選擇限制酶以便提供在不同個(gè)體或群體中有至少兩種可選擇的(或多態(tài)性)長(zhǎng)度的限制片段。確定對(duì)標(biāo)志物各等位基因`產(chǎn)生有用片段的一種或多種限制酶為本領(lǐng)域眾所周知的簡(jiǎn)便規(guī)程。在根據(jù)長(zhǎng)度在適當(dāng)基質(zhì)(例如,瓊脂糖或聚丙烯酰胺)中分離并且轉(zhuǎn)至膜(例如,硝化纖維素、尼龍等)后,在導(dǎo)致探針與靶物平衡結(jié)合的條件下雜交標(biāo)記的探針,隨后通過(guò)洗漆除去過(guò)量的探針。
[0140]可以克隆和/或合成用于標(biāo)志物基因座的核酸探針。任何合適的標(biāo)記物均可以與本發(fā)明的探針聯(lián)用。適用于核酸探針的可檢測(cè)標(biāo)記物包括,例如,可通過(guò)分光光度法、放射性同位素、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電、光學(xué)或化學(xué)方式檢測(cè)的任何組合物。有用的標(biāo)記物包括使用標(biāo)記的鏈霉親合素綴合物染色的生物素、磁珠、熒光染料、放射性標(biāo)記物、酶、和比色標(biāo)記物。其它標(biāo)記物包括結(jié)合用熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光劑和酶標(biāo)記的抗體的配體。探針還可以構(gòu)成用于產(chǎn)生放射性標(biāo)記的擴(kuò)增子的放射性標(biāo)記的PCR引物。用于標(biāo)記核酸的標(biāo)記策略和相應(yīng)的檢測(cè)策略可以見(jiàn)例如Haugland(2003) Handbook of Fluorescent Probes andResearch Chemicals Ninth Edition, Molecular Probes, Inc.(Eugene OR)。有關(guān)標(biāo)志物檢測(cè)策略的其它細(xì)節(jié)可以在下文中找到。
[0141]基于擴(kuò)增的檢測(cè)方法
[0142]PCR、RT-PCR和LCR特別廣泛地用作擴(kuò)增所關(guān)注的核酸(例如,包含標(biāo)志物基因座的那些)的擴(kuò)增和擴(kuò)增-檢測(cè)方法,從而有利于檢測(cè)所關(guān)注的核酸。有關(guān)這些和其它擴(kuò)增方法的詳細(xì)描述可以在任何多種標(biāo)準(zhǔn)教科書(shū)中找到,包括,例如,Sambrook, Ausubel和Berger0許多可利用的生物學(xué)教科書(shū)還擴(kuò)展了有關(guān)PCR和相關(guān)擴(kuò)增方法的討論。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解基本上可以將任何RNA轉(zhuǎn)化成適合于限制性消化、PCR延伸、和使用逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶測(cè)序(〃逆轉(zhuǎn)錄-PCR或〃RT-PCR")的雙鏈DNA。另外參見(jiàn)上述的Ausubel,Sambrook和Berger。這些方法還可以用于定量擴(kuò)增mRNA或相應(yīng)的cDNA,從而提供個(gè)體中對(duì)應(yīng)于基因產(chǎn)物的mRNA表達(dá)水平的指示,所述的基因產(chǎn)物對(duì)應(yīng)于圖1和2的基因或基因產(chǎn)物。個(gè)體、家族、品系和/或群體之間的這些基因的表達(dá)水平差異可以用作乳腺癌表型的標(biāo)志物。
[0143]實(shí)時(shí)擴(kuò)增/檢測(cè)方法
[0144]在一個(gè)方面中,例如,使用分子信標(biāo)或TaqMan?探針對(duì)本文所述的擴(kuò)增混合物進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR或LCR。分子信標(biāo)(MB)為在適當(dāng)雜交條件下自雜交而形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的寡核苷酸或PNA。MB在寡核苷酸或PNA末端上具有標(biāo)記物和猝滅劑;由此在允許分子內(nèi)雜交的條件下,標(biāo)記物一般被猝滅劑猝滅(或至少在其熒光方面發(fā)生改變)。在MB未展示出分子內(nèi)雜交的條件下(例如在擴(kuò)增過(guò)程中當(dāng)結(jié)合靶核酸,例如擴(kuò)增子區(qū)時(shí)),MB標(biāo)記物未猝滅。有關(guān)制備和使用MB的標(biāo)準(zhǔn)方法的詳細(xì)描述在文獻(xiàn)中充分確立,并且MB可購(gòu)自許多商品試劑來(lái)源。另外,參見(jiàn)例如,Leone 等(1995) "Molecular beacon probes combined withamplification by NASBA enable homogenous real-time detection of RNA."NucleicAcids Res.26:2150-2155 ;Tyagi 和 Kramer (1996)"Molecular beacons: probesthat fluoresce upon hybridization〃Nature Biotechnology14:303-308 ;Blok和 Kramer(1997) "Amplifiable hybridization probes containing a molecularswitch"Mol Cell Probesl1: 187-194 ;Hsuih 等(1997)"Novel,ligation-dependentPCR assay for detection of hepatitis C in serum〃J Clin Microbiol34:501-507 ;Kostrikis 等(1998)"Molecular beacons: spectral genotyping of humanalleles"Science279:1228-1229 ;Sokol 等(1998)"Real time detection of DNA:RNAhybridization in living cells〃Proc.Natl.Acad.Sd.U.S.A.95:11538-11543 ;Tyagi等(1998)"Multicolor molecular beacons for allele discrimination"NatureBiotechnologyl6:49-53:Bonnet 等(1999)"Thermodynamic basis of the chemicalspecificity of structured DNA probes〃Proc.Natl.Acad.Sd.U.S.A.96:6171-6176 ;Fang 等(1999)"Designing a novel molecular beacon for surface-1mmobilized DNAhybridization studies〃J.Am.Chem.Soc.121:2921-2922:Marras 等(1999)"Multiplexdetection of single-nucleotide variation using molecular beacons〃Genet.Anal.Biomo1.Eng.14: 151-156;和 Vet 等(1999)"Multiplex detection of fourpathogenic retroviruses using molecular beacons〃Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.96:6394-6399。有關(guān)MB構(gòu)建和應(yīng)用的額外詳細(xì)描述可以在專(zhuān)利文獻(xiàn)中找到,例如,Tyagi等的 USP5,925,517 (1999 年 7 月 20 日),標(biāo)題為"Detectably labeled dual conformationoligonucleotide probes, assays and kits" ;Tyagi 等的 USP6,150,097(2000 年 11 月21 日),標(biāo)題為"Nucleic acid detection probes having non-FRET fluorescencequenching and kits and assays including such probes〃 和 Tyagi 等的USP6,037,130(2000 年 3 月 14 日),標(biāo)題為"Wavelength-shifting probes and primersand their use in a ssays and kits〃。[0145]還可以按照本發(fā)明使用通常稱(chēng)作"TaqMan?"探針的雙重標(biāo)記的熒光寡脫氧核苷酸探針進(jìn)行PCR檢測(cè)和定量。這些探針由使用兩種不同熒光染料標(biāo)記的短(例如,20-25個(gè)堿基)寡核苷酸組成。在每個(gè)探針的5’端上為報(bào)道染料,并且在每個(gè)探針的3’端上發(fā)現(xiàn)猝滅染料。寡核苷酸探針序列與存在于PCR擴(kuò)增子中的內(nèi)部靶序列互補(bǔ)。當(dāng)該探針完整時(shí),在兩個(gè)熒光團(tuán)之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移并且由猝滅劑通過(guò)FRET猝滅來(lái)自報(bào)道分子的發(fā)射。在PCR的延伸期過(guò)程中,探針因用于反應(yīng)的聚合酶的5’核酸酶活性而裂解,由此從寡核苷酸-猝滅劑中釋放報(bào)道分子并且產(chǎn)生報(bào)道分子發(fā)射強(qiáng)度的增加。因此,TaqMan?探針為具有標(biāo)記物和猝滅劑的寡核苷酸,其中標(biāo)記物在擴(kuò)增過(guò)程中通過(guò)擴(kuò)增所用聚合物的外切核酸酶作用而釋放。這在合成過(guò)程中提供了對(duì)擴(kuò)增的實(shí)時(shí)測(cè)量。各種TaqMan?試劑為商購(gòu)的,例如購(gòu)自 Applied Biosystems (Division Headquarters, Foster City, CA)并且購(gòu)自各種專(zhuān)業(yè)供應(yīng)商,諸如Biosearch Technologies (例如,黑洞粹滅劑探針)。有關(guān)雙重標(biāo)記物探針策略的額外詳細(xì)描述可以在例如W092/02638中找到。
[0146]其它類(lèi)似的方法包括,例如,使用例如U.S.6,174,670中所述的〃 LightCycler?
"形式的兩個(gè)相鄰雜交探針之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移。
[0147]基于陣列的標(biāo)志物檢測(cè)
[0148]可以使用商購(gòu)陣列,例如購(gòu)自Affymetrix(Santa Clara, CA)或其它制造商的陣列進(jìn)行基于陣列的檢測(cè)。有關(guān)核酸陣列操作的綜述包括Sapolsky等(1999) ^High-throughput polymorphism screening and genotyping with high-densityoligonucleotide arrays"Genetic Analysis:Biomolecular EngineeringI4:187-192 ;Lockhart (1998 )"Mutant yeast on drugs"Nature Medicine4: 1235-1236 ;Fodor (1997)"Genes,Chips and the Human Genome"FASEB Journal 11:A879 ;Fodor (1997) "Massively Parallel Genomics.^Science.277:393-395 ;和 Chee 等(1996)"Accessing Genetic Information with High-Density DNA Arrays〃Science274:610-614。基于陣列的檢測(cè)因基于陣列的檢測(cè)的固有高流通量性質(zhì)而成為用于鑒定樣品中本發(fā)明標(biāo)志物的優(yōu)選方法。
[0149]各種探針陣列已經(jīng)描述在文獻(xiàn)中并且可以用于本發(fā)明上下文中檢測(cè)可能與本文所述表型相關(guān)的標(biāo)志物。例如,DNA探針陣列芯片或較大的DNA探針陣列晶片(否則,可以通過(guò)打斷晶片而獲得各個(gè)體芯片)用于本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案。DNA探針陣列晶片一般包含玻璃晶片,其上放置了高密度DNA探針(短DNA片段)陣列。這些晶片各自可以保持例如約6000萬(wàn)個(gè)用于識(shí)別較長(zhǎng)樣品DNA序列(例如,來(lái)自個(gè)體或群體,例如,包含所關(guān)注的標(biāo)志物)的DNA探針。用玻璃晶片上的DNA探針組識(shí)別樣品DNA通過(guò)DNA雜交進(jìn)行。當(dāng)DNA樣品與DNA探針陣列雜交時(shí),樣品結(jié)合與樣品DNA序列互補(bǔ)的那些探針。通過(guò)評(píng)價(jià)個(gè)體樣品DNA與那些探針更穩(wěn)固地雜交,有可能確定已知的核酸序列是否存在于樣品中,由此確定核酸中發(fā)現(xiàn)的標(biāo)志物是否存在。還可以使用這一手段通過(guò)控制雜交條件以允許區(qū)別單一核苷酸,例如,用于SNP鑒定和一種或多種SNP的樣品基因分型來(lái)進(jìn)行ASH。陣列提供了一種同時(shí)(或串連)檢測(cè)多個(gè)多態(tài)性標(biāo)志物的便利性實(shí)施方案。例如,可以構(gòu)建乳腺癌易感性檢測(cè)陣列,其中同時(shí)檢測(cè)任何或所有本文所述的多態(tài)性(或與之連鎖的多態(tài)性)以便指定乳腺癌易感性表型。當(dāng)然,可以類(lèi)似地使用任何檢測(cè)技術(shù)(PCR、LCR、實(shí)時(shí)PCR等),例如,使用多重?cái)U(kuò)增/檢測(cè)反應(yīng)或單純通過(guò)運(yùn)行幾個(gè)單獨(dú)的反應(yīng),例如,同時(shí)的或串連的。[0150]DNA探針陣列在獲得等位基因信息中的應(yīng)用一般包括下列一般步驟:設(shè)計(jì)和制備DNA探針陣列,制備樣品,使樣品DNA與陣列雜交,檢測(cè)雜交事件和數(shù)據(jù)分析以便測(cè)定序列。使用來(lái)自半導(dǎo)體生產(chǎn)的改良方法制備優(yōu)選的晶片以便獲得成本效率和高質(zhì)量并且可購(gòu)自例如 Affymetrix, Inc (Santa Clara, California)。
[0151]例如,可以通過(guò)光定向的化學(xué)合成方法制備探針陣列,所述的光定向的化學(xué)合成方法合并了固相化學(xué)合成與半導(dǎo)體工業(yè)所采用的光刻制造技術(shù)。由于使用一系列光刻罩來(lái)限定芯片暴露點(diǎn),隨后進(jìn)行特定的化學(xué)合成步驟,所以該方法構(gòu)建了高密度寡核苷酸陣列,在該陣列中每個(gè)探針位于預(yù)定的位置??梢栽诖蟛AЬ贤瑫r(shí)合成多個(gè)探針陣列。這種平行方法提高了再現(xiàn)性并且有助于實(shí)現(xiàn)規(guī)?;?jīng)濟(jì)。
[0152]一旦制成,DNA探針陣列就可以用于獲得有關(guān)所關(guān)注標(biāo)志物的存在和/或表達(dá)水平的數(shù)據(jù)??梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)生化方法用生物素和/或熒光報(bào)道基團(tuán)標(biāo)記DNA樣品。將標(biāo)記的樣品與陣列一起孵育,并且使樣品的區(qū)段與陣列上的互補(bǔ)序列結(jié)合或雜交??梢韵礈旌?或染色陣列以便產(chǎn)生雜交模式。然后掃描該陣列并且根據(jù)從熒光報(bào)道基團(tuán)中發(fā)射的光檢測(cè)雜交模式。有關(guān)這些規(guī)程的額外詳細(xì)描述可以在下文的實(shí)施例中找到。因?yàn)橐阎嚵猩厦總€(gè)探針的身份和位置,所以可以確定應(yīng)用于陣列的樣品中的DNA序列的性質(zhì)。當(dāng)這些陣列用于基因分型實(shí)驗(yàn)時(shí),它們可以稱(chēng)作基因分型陣列。如上所述,可以檢測(cè)例如圖1和/或圖2中本文所述的任何或所有多態(tài)性的基因型,例如以便指定乳腺癌惡病質(zhì)表型。
[0153]將待分析的核酸樣品分離,擴(kuò)增且一般用生物素和/或熒光報(bào)道基團(tuán)標(biāo)記。然后使用流控技術(shù)站和分子雜交儀將標(biāo)記的核酸樣品與陣列一起孵育。可以根據(jù)檢測(cè)方法的需要對(duì)陣列進(jìn)行洗滌和/或染色或復(fù)染。在雜交、洗滌和染色后,將陣列插入檢測(cè)雜交模式的掃描儀。將雜交數(shù)據(jù)采集為發(fā)射自熒光報(bào)道基團(tuán)的光,所述的熒光報(bào)道基團(tuán)已經(jīng)摻入現(xiàn)在與探針陣列結(jié)合的標(biāo)記核酸。最明顯地與標(biāo)記核酸匹配的探針產(chǎn)生強(qiáng)于具有錯(cuò)配的那些的信號(hào)。由于已知陣列上每個(gè)探針的序列和位置,所以可以根據(jù)互補(bǔ)性鑒定應(yīng)用于探針陣列的核酸的身份。
[0154]在一個(gè)實(shí)施方案中,可以差別標(biāo)記兩種DNA樣品并且使其與單組設(shè)計(jì)的基因分型陣列雜交。在這種方式中,可以從相同的物理陣列中獲得兩組數(shù)據(jù)。可以使用的標(biāo)記物包括,但不限于cychrome、熒光素或生物素(隨后在雜交后用藻紅蛋白-鏈霉親合素染色)。雙色標(biāo)記描述在美國(guó)專(zhuān)利No,6,342,355中,將該文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考??梢話呙杳總€(gè)陣列,使得同時(shí)檢測(cè)來(lái)自?xún)煞N標(biāo)記物的信號(hào)或?qū)⑺鼈儝呙鑳纱我员惴謩e檢測(cè)每個(gè)信號(hào)。
[0155]對(duì)測(cè)試標(biāo)志物存在的各個(gè)體用掃描儀采集所有標(biāo)志物的強(qiáng)度數(shù)據(jù)。測(cè)得的強(qiáng)度為指示存在于指定個(gè)體的樣品中特定標(biāo)志物的量的度量(存在于個(gè)體中的等位基因的表達(dá)水平和/或拷貝數(shù),取決于是分析基因組核酸還是表達(dá)的核酸)。這可以用于確定個(gè)體在左關(guān)注的標(biāo)志物方面是純合型的還是雜合型的。處理強(qiáng)度數(shù)據(jù)以便提供有關(guān)各種強(qiáng)度的相應(yīng)標(biāo)志物信息。
[0156]有關(guān)擴(kuò)增的可奪序列、SSR、AFLP、ASH、SNP和同工酶標(biāo)志物的別的細(xì)節(jié)
[0157]擴(kuò)增的可變序列意指在同一物種成員之間表現(xiàn)出高度核酸殘基變異性的基因組的擴(kuò)增序列。所有生物體均具有可變基因組序列且每種生物體(除克隆,例如克隆的細(xì)胞外)均具有不同組的可變序列。一旦鑒定,則特定可變序列的存在可以用于預(yù)測(cè)表型性狀。優(yōu)選的,來(lái)自基因組的DNA用作使用位于DNA可變序列側(cè)翼的引物擴(kuò)增的模板。擴(kuò)增可變序列且然后測(cè)序。
[0158]可選擇地,自維持序列復(fù)制可以用于鑒定遺傳標(biāo)志物。自維持序列復(fù)制意指使用靶核酸序列進(jìn)行核酸擴(kuò)增的方法,所述的靶核酸序列在體外基本上等溫條件下通過(guò)使用三種涉及逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制的酶活性呈指數(shù)復(fù)制:(I)逆轉(zhuǎn)錄酶,(2) RNA酶H和(3) DNA-依賴(lài)性RNA 聚合酶(Guatelli 等(1990)Proc Natl Acad Sci USA87:1874)。通過(guò)模擬經(jīng) cDNA 中間體的RNA復(fù)制的逆轉(zhuǎn)錄病毒策略,該反應(yīng)累積了原始靶標(biāo)的cDNA和RNA拷貝。
[0159]擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)也可以用作遺傳標(biāo)志物(Vos等(1995)迦過(guò)AcidsRes23:4407)。術(shù)語(yǔ)〃擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性〃意指在用限制性?xún)?nèi)切核酸酶切割之前或之后擴(kuò)增的所選限制性片段。擴(kuò)增步驟容許易于檢測(cè)特定限制片段。AFLP容許檢測(cè)大量的多態(tài)性標(biāo)志物并且已經(jīng)用于遺傳作圖(Becker等(1995) Mol Gen Genet249:65;和Meksem等(1995)Mol Gen Genet249:74)。
[0160]等位基因特異性雜交(ASH)可以用于鑒定本發(fā)明的遺傳標(biāo)志物。ASH技術(shù)基于短的單鏈寡核苷酸探針與完全互補(bǔ)單鏈靶核酸的穩(wěn)定退火。可以用附著于探針的同位素或非同位素標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)。
[0161]就每種多態(tài)性而言,設(shè)計(jì)兩種或多種不同的ASH探針,它們具有相同的DNA序列,但不包括多態(tài)性核苷酸上的序列。每個(gè)探針具有與一種等位基因序列確切的同源性,使得該探針系列可以區(qū)分所有已知的可選等位基因序列。每種探針與靶DNA雜交。使用適當(dāng)?shù)奶结樤O(shè)計(jì)和雜交條件,探針與靶DNA之間的單堿基錯(cuò)配會(huì)防止雜交。按照這種方式,僅可選探針之一與對(duì)等位基因而言純合或均質(zhì)的靶樣品雜交。對(duì)兩種等位基因而言雜合或異質(zhì)的樣品與兩種可選探針均雜交。
[0162]ASH標(biāo)志物用作顯性標(biāo)志物,其中根據(jù)僅有一種探針雜交或不雜交確定僅一種等位基因的存在與否??梢愿鶕?jù)無(wú)雜交推斷可選的等位基因。ASH探針和靶分子任選為RNA或DNA ;靶分子為超過(guò)與探針互補(bǔ)序列的任何核苷酸長(zhǎng)度;設(shè)計(jì)所述探針以便與DNA靶標(biāo)的任一鏈雜交;探針的大小范圍與各種嚴(yán)格雜交條件一致等。
[0163]PCR容許在相對(duì)小體積中由低濃度的核酸擴(kuò)增ASH的靶序列。否則,用限制性?xún)?nèi)切核酸酶消化來(lái)自基因組DNA的靶序列并且通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行大小分離。雜交一般如美國(guó)專(zhuān)利5,468,613中所述與結(jié)合至膜表面的靶序列進(jìn)行,ASH探針序列可以與膜結(jié)合。
[0164]在一個(gè)實(shí)施方案中,一般如下獲得ASH數(shù)據(jù),即使用PCR由基因組DNA擴(kuò)增核酸片段(擴(kuò)增子),按照斑點(diǎn)印跡形式將該擴(kuò)增子靶DNA轉(zhuǎn)至膜上,使標(biāo)記的寡核苷酸探針與擴(kuò)增子靶標(biāo)雜交,并且通過(guò)放射自顯影術(shù)觀察雜交斑點(diǎn)。
[0165]單核苷酸多態(tài)性(SNP)為由基于單核苷酸區(qū)分的共有序列組成的標(biāo)志物。一般而言,通過(guò)包含SNP的擴(kuò)增子在例如丙烯酰胺凝膠上的差別遷移模式來(lái)檢測(cè)這一差別。然而,可選的檢測(cè)方式,諸如雜交,例如,ASH或RFLP分析或基于陣列的檢測(cè)也是合適的。 [0166]例如,可以將同工酶標(biāo)志物用作遺傳標(biāo)志物,以便示蹤與本文所述標(biāo)志物連鎖的同工酶標(biāo)志物。同工酶為彼此在其氨基酸和由此的其核酸序列方面不同的酶的多種形式。某些同工酶為包含略微不同亞基的多聚體酶。其它同工酶為多聚體的或單體的,但已經(jīng)在氨基酸序列的不同位點(diǎn)上從酶原中裂解??梢栽诘鞍踪|(zhì)水平上表征和分析同工酶,或者,可以確定在核酸水平上不同的同工酶。在這類(lèi)情況中,本文所述任何基于核酸的方法可用于分析同工酶標(biāo)志物。
[0167]有關(guān)核酸擴(kuò)增的別的細(xì)節(jié)
[0168]正如注意到的,核酸擴(kuò)增技術(shù),諸如PCR和LCR為本領(lǐng)域眾所周知的并且可以應(yīng)用于本發(fā)明,以便擴(kuò)增和/或檢測(cè)所關(guān)注的核酸,諸如包含標(biāo)志物基因座的核酸。在上述參考文獻(xiàn)例如Innis, Sambrook, Ausubel和Berger中可以找到足以指導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)這類(lèi)體外方法的技術(shù)的實(shí)例,包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、Q3-復(fù)制酶擴(kuò)增和其它RNA聚合酶介導(dǎo)的技術(shù)(例如NASBA)。額外的詳細(xì)描述在如下文獻(xiàn)中找到=Mullis 等(1987)美國(guó)專(zhuān)利 N0.4,683,202 ;Arnheim&Levinson(1990 年10 月 I 日)C&EN36~47:The Tournal Of NIH Research(1991)3,81-94:Kwoh 等(1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86,1173 ;Guatelli 等(1990) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87,1874 ;Lomell 等(1989)T.Clin.Chem35,1826 ;Landegren 等(1988)Science241,1077-1080 ;VanBrunt(1990)Biotechnology8, 291-294 ;ffu 和 Wallace(1989)Gene4, 560 ;Barringer 等(1990)Gene89,117 和 Sooknanan 和 Malek(1995)Biotechnology13:563-564。Cheng 等(1994)Nature369:684及其中的參考文獻(xiàn)中進(jìn)一步概括了通過(guò)PCR擴(kuò)增大核酸的改進(jìn)方法,其中生成達(dá)40kb的PCR擴(kuò)增子,它可用于與本文多態(tài)性(圖1和/或2)連鎖的基因的定位克隆的情況中。例如,在下列文獻(xiàn)中披露了遠(yuǎn)程PCR方法:2002年I月9日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)N0.10/042,406,標(biāo)題為"Algorithms for Selection of Primer Pairs" ;2002年9月9曰提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)N0.10/236,480,標(biāo)題為〃Methods for Amplification ofNucleic Acids";和2004年 5 月 25 日授權(quán)的美國(guó)專(zhuān)利N0.6,740,510,標(biāo)題為〃Methods forAmplification of Nucleic Acids"。USSN10/341, 832 (1/14/03 提交)中還提供了有關(guān)進(jìn)行近程PCR的引物挑取法的詳細(xì)描述。
_9] 蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)
[0170]蛋白質(zhì),諸如圖1和/或2中注意到的基因編碼的那些由核酸,包括包含與本文關(guān)注的表型相關(guān)的標(biāo)志物的那些編碼。關(guān)于分子生物學(xué)的基本范例的說(shuō)明,包括DNA表達(dá)(轉(zhuǎn)錄和/或翻譯)成RNA,進(jìn)而成蛋白質(zhì),參見(jiàn)Alberts等(2002)Molecular Biologyof the Cell, 4th Edition Taylor 和 Francis, Inc., ISBN:0815332181 ("Alberts")和 Lodish 等(1999)Molecular Cell Biology, ^Edition W H Freeman&Co, ISBN:071673706X(〃LOdish〃)。因此,例如,可以通過(guò)檢測(cè)個(gè)體或群體之間的不同蛋白質(zhì)同種型或通過(guò)檢測(cè)這類(lèi)所關(guān)注的蛋白質(zhì)(例如,圖1和/或2的基因產(chǎn)物)的差別存在、不存在或表達(dá)水平,將對(duì)應(yīng)于圖1和/或2中的基因的蛋白質(zhì)作為標(biāo)志物來(lái)檢測(cè)。
[0171]已知各種蛋白質(zhì)檢測(cè)方法并且可以用于區(qū)分標(biāo)志物。除上文的各種參考文獻(xiàn)外,各種蛋白質(zhì)操作和檢測(cè)方法也為本領(lǐng)域中公知的,包括,例如,下列文獻(xiàn)中所述的那些:R.Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.(1982) ;Deutscher,Methods in Enzymology Vol.182:Guide to Protein Purification, Academic Press,Inc.N.Y.(1990):Sandana (1997)Bioseparation of Proteins, Academic Press,Inc.;Bollag 等(1996)Protein Methods,2th Edition ffiley-Liss, NY ;ffalker (1996)The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ;Harris 和 Angal (1990)ProteinPurification Applications:A Practical Approach IRL Press, Oxford, Oxford,England ;Harris 和 Angal Protein Purification Methods:A Practical ApproachIRL Press, Oxford, Oxford, England:Scopes (1993)Protein Purification!Principlesand Practices111 Edition Springer Verlag, NY ; Janson 和 Ryden (1998) ProteinPurification!Principles,High Resolution Methods and Applications, SecondEdition ffiley-VCH, NY;和 Walker(1998)Protein Protocols on CD-ROM Humana Press,NJ ;和其中引述的參考文獻(xiàn)。有關(guān)蛋白質(zhì)純化和檢測(cè)方法的額外詳細(xì)描述可以在SatinderAhuja ed., Handbook of Bioseparations, Academic Press (2000)中找至丨J。[0172]描述了同時(shí)檢測(cè)許多蛋白質(zhì)的〃蛋白質(zhì)組〃檢測(cè)方法。它們可以包括各種多維電泳方法(例如,2-d凝膠電泳)、基于質(zhì)譜的方法(例如,SELD1、MALD1、電噴射等)或表面等離振子共振法。例如,在MALDI中,通常將樣品與適當(dāng)?shù)幕|(zhì)混合,置于探針表面上,并通過(guò)激光解吸/電離檢驗(yàn)。MALDI的技術(shù)為本領(lǐng)域眾所周知的。例如,參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,045,694 (Beavis等),美國(guó)專(zhuān)利5,202,561 (Gleissmann等)和美國(guó)專(zhuān)利6,111,251 (Hillenkamp)。類(lèi)似地,就SELDI而言,使第一個(gè)等分試樣接觸固相支持體結(jié)合的(例如,基質(zhì)結(jié)合的)吸附劑?;|(zhì)一般為可以使用氣相離子分光光度計(jì)以可查詢(xún)的關(guān)系定位的探針(例如,生物芯片)。SELDI也為眾所周知的技術(shù)并且已經(jīng)應(yīng)用于診斷蛋白質(zhì)組學(xué)。例如,參見(jiàn) Issaq 等(2003) 〃SELDI_T0F MS for Diagnostic Proteomics^AnalyticalChemistry75:149A_155A。
[0173]一般而言,上述方法可以用于檢測(cè)蛋白質(zhì)的不同形式(等位基因)和/或可以用于檢測(cè)個(gè)體、家族、品系、群體等之間的蛋白質(zhì)的不同表達(dá)水平(可能是因?yàn)榈任换虿町?。即使所編碼的差異表達(dá)的蛋白質(zhì)自身相同,但是受環(huán)境因素控制的(when controlledfor environment factors)表達(dá)水平的差異可以指示位于所關(guān)注基因的QTL上的不同等位基因。例如,如果在非編碼區(qū),例如諸如控制基因表達(dá)的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子這類(lèi)區(qū)中存在基因的多種等位基因形式,那么上述情況發(fā)生。因此,可以將檢測(cè)差異表達(dá)水平用作檢測(cè)等位基因差異的方法。
[0174]在本發(fā)明的其它方面中,包含與乳腺癌表型相關(guān)的核酸的、與該核酸連鎖不平衡的、或在該核酸控制下的基因可以表現(xiàn)出差異等位基因表達(dá)。本文所用的〃差異等位基因表達(dá)"意指存在于細(xì)胞中的單一基因的多個(gè)等位基因的等位基因表達(dá)上的定性和定量差另IJ。照此,展示出差異等位基因表達(dá)的基因可以具有與相同細(xì)胞/組織中第二種等位基因相比以不同時(shí)間或水平表達(dá)的一種等位基因。例如,盡管兩者均為相同基因的等位基因并且存在于相同細(xì)胞/組織中,但是與乳腺癌表型相關(guān)的等位基因可以以高于或低于與乳腺癌表型無(wú)關(guān)的等位基因的水平得到表達(dá)。差異等位基因表達(dá)和分析方法詳細(xì)披露在2003年5月13日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0/438,184和2004年5月12日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?10/845,316 中,二者標(biāo)題均為〃Allele-specific expression patterns"。與乳腺癌表型相關(guān)的一種或多種核酸或其片段、衍生物、多態(tài)性、變體或互補(bǔ)物的差異等位基因表達(dá)模式的檢測(cè)對(duì)于乳腺癌易感性/抗性是預(yù)后性的和診斷性的;同樣,檢測(cè)與乳腺癌表型相關(guān)的一種或多種核酸或其片段、衍生物、多態(tài)性、變體或互補(bǔ)物的差異等位基因表達(dá)模式對(duì)于乳腺癌和乳腺癌治療效果是預(yù)后性的和診斷性的。
[0175]有關(guān)適合于篩選的標(biāo)志物類(lèi)型的別的細(xì)節(jié)
[0176]為與本文的表型的相關(guān)性篩選的生物學(xué)標(biāo)志物可以為可以通過(guò)篩選檢測(cè)的任何那些類(lèi)型的標(biāo)志物,例如,遺傳標(biāo)志物,諸如遺傳基因座的等位基因變體(例如,像在SNP中)、表達(dá)標(biāo)志物(例如,mRNA和/或蛋白質(zhì)的存在或其數(shù)量)、諸如此類(lèi)。
[0177]在本發(fā)明方法中待擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄、翻譯和/或檢測(cè)的所關(guān)注的核酸基本上可以為任何核酸,不過(guò),衍生自人體來(lái)源的核酸尤其與檢測(cè)涉及疾病診斷和臨床應(yīng)用的標(biāo)志物相關(guān)??傻玫皆S多核酸和氨基酸(核酸序列可以通過(guò)逆翻譯由其推導(dǎo))的序列,包括圖1和/或2的基因/蛋白質(zhì)。已知核酸的公用序列全集包括GenBank? EMBL、DDBJ和NCBI。其它全集易于通過(guò)搜索互聯(lián)網(wǎng)鑒定。待擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄、翻譯和/或檢測(cè)的核酸可以為RNA(例如,其中擴(kuò)增包括RT-PCR或LCR、Van-GeIder Eberwine反應(yīng)或Ribo-SPIA)或DNA (例如,擴(kuò)增的DNA、cDNA或基因組DNA)乃至任何其類(lèi)似物(例如,用于檢測(cè)合成的核酸或其類(lèi)似物,例如,其中所關(guān)注的樣品包括人工核酸或用于衍生或合成人工核酸)??梢詫€(gè)體或群體之間核酸序列或表達(dá)水平中的任何變異作為標(biāo)志物來(lái)檢測(cè),例如,突變、多態(tài)性、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、等位基因、同種型、RNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)等。可以檢測(cè)序列、表達(dá)水平或基因拷貝數(shù)的變異作為可能與乳腺癌表型相關(guān)的標(biāo)志物來(lái)檢測(cè)。
[0178]例如,本發(fā)明的方法可用于對(duì)衍生自患者的樣品篩選所關(guān)注的標(biāo)志物核酸,例如,所述的樣品來(lái)自患者的體液(血液、唾液、尿液等)、活檢、組織、和/或廢物。因此,可通過(guò)本發(fā)明的方法對(duì)組織活檢、糞便、痰、唾液、血液、淋巴、淚液、汗液、尿液、陰道分泌物、射精的流體等容易的篩選核酸,因?yàn)樗P(guān)注的任何組織基本上均包含適當(dāng)?shù)暮怂?。這些樣品一般在知情許可后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室方法取自患者。
[0179]在擴(kuò)增和/或檢測(cè)包含標(biāo)志物的核酸前,任選通過(guò)任何可利用的方法從樣品中純化核酸,所述的方法例如在如下文獻(xiàn)中教導(dǎo)的:Berger和Kimmel, Guide to MolecularCloning Techniques, Methods in Enzymology volumeI52Academic Press, Inc., SanDiego, CA(Berger) ;Sambrook 等,Molecular Cloning ~A Laboratory Manual (3rdEd.), Vol.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York,2001 ("Sambrook");和 / 或 Current Protocols in Molecular Biology, F.M.Ausubel 等,eds., Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc.與 John ffiley&Sons,Inc.的合作項(xiàng)目(增補(bǔ)至2002) ("Ausubel"))。在商業(yè)上還可以利用多種試劑盒從細(xì)胞或其它樣品中純化核酸(例如,參見(jiàn)EasyPrep?、FlexiPrep?,均來(lái)自Pharmacia Biotech ;StrataClean?,來(lái)自Stratagene ;和QIAprep?,來(lái)自Qiagen)。可選擇地,例如,可以在等分和/或稀釋后使樣品單純的直接進(jìn)行擴(kuò)增或檢測(cè)。
[0180]標(biāo)志物的實(shí)例可以包括多態(tài)性、單核苷酸多態(tài)性、樣品中一種或多種核酸的存在、樣品中一種或多種核酸的缺失、一種或多種基因組DNA序列的存在、一種或多種基因組DNA序列的缺失、一種或多種mRNA的存在、一種或多種mRNA的缺失、一種或多種mRNA的表達(dá)水平、一種或多種蛋白質(zhì)的存在、一種或多種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、和/或衍生自任何上述的數(shù)據(jù)或其組合。基本上可以使用可利用的方法,例如使用提供高密度、高通量標(biāo)志物作圖的陣列技術(shù)檢測(cè)任何數(shù)目的標(biāo)志物。因此,可以在第一種和/或第二種群體中同時(shí)或以連續(xù)方式(或其組合)對(duì)至少約10、100、1,000、10,000乃至100,000或以上個(gè)遺傳標(biāo)志物測(cè)試與相關(guān)表型的相關(guān)性。例如,可能還想測(cè)試標(biāo)志物的組合,以便鑒定群體中與表型相關(guān)的遺傳組合或表達(dá)模式的組合。
[0181]正如注意到的,待檢測(cè)的生物學(xué)標(biāo)志物可以為任何可檢測(cè)的生物學(xué)成分。通常檢測(cè)的標(biāo)志物包括遺傳標(biāo)志物(例如,存在于基因組DNA中的DNA序列標(biāo)志物或其表達(dá)產(chǎn)物)和表達(dá)標(biāo)志物(可以反映出遺傳編碼因素、環(huán)境因素或它們兩者)。如果標(biāo)志物為表達(dá)標(biāo)志物,那么方法可以包括測(cè)定第一種個(gè)體或群體的第一種表達(dá)譜(例如,一種或多種表達(dá)的標(biāo)志物,例如一組表達(dá)的標(biāo)志物)并且比較第一種表達(dá)譜與第二種個(gè)體或群體的第二種表達(dá)譜。在該實(shí)例中,使表達(dá)標(biāo)志物與特定表型建立相關(guān)性可以包括使第一種或第二種表達(dá)譜與所關(guān)注的表型建立相關(guān)性。
[0182]探針/引物合成方法
[0183]一般而言,用于制備寡核苷酸,包括探針、引物、分子信標(biāo)、PNA、LNA(鎖定核酸)等的合適方法為眾所周知的。例如,可以如Needham-VanDevanter等(1984)Nucleic AcidsRes.12:6159-6168所述,使用商購(gòu)的自動(dòng)化合成儀,按照Beaucage和Caruthers (1981)Tetrahedron Letts., 22 (20): 1859-1862 中所述的固相亞憐酸胺(phosphoramidtie)三酯方法,以化學(xué)方式合成寡核苷酸。還可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的各種商業(yè)來(lái)源定購(gòu)寡核苷酸,包括修飾的寡核苷酸。存在許多寡核苷酸合成服務(wù)的商業(yè)供應(yīng)商且由此這是一項(xiàng)廣泛可取得的技術(shù)??梢詮母鞣N商業(yè)來(lái)源定購(gòu)任何核酸,諸如The Midland CertifiedReagent Company(mcrcioligos.com)> The Great American Gene Company (www.genc0.com)、ExpressGen Inc.(www.expressgen.com)、Operon Technologies Inc.(Alameda,CA)等。類(lèi)似地,可以從任何各種來(lái)源,諸如PeptidoGenic (pkimiccnet.com)、HTIBio-products, Inc.(htibi0.com) > BMA Biomedicals Ltd(U.K.) > Bio-Synthesis,Inc.等定購(gòu)PNA。
[0184]計(jì)算本幾(In Silico)標(biāo)志物檢泖I
[0185]在某些實(shí)施方案中,計(jì)算機(jī)(in silico)方法可以用于檢測(cè)所關(guān)注的標(biāo)志物基因座。例如,可以將包含所關(guān)注的標(biāo)志物基因座的核酸序列儲(chǔ)存在計(jì)算機(jī)中??梢允褂糜衫?,諸如BLAST這類(lèi)易于得到的程序乃至簡(jiǎn)單的文字處理器提供的適當(dāng)核酸搜索算法來(lái)鑒定所需標(biāo)志物基因座序列或其同`系物。已經(jīng)對(duì)完整人類(lèi)基因組進(jìn)行了測(cè)序且由此可將序列信息用于鑒定標(biāo)志物區(qū)、側(cè)翼核酸等。
_6] 用于標(biāo)志物檢測(cè)的擴(kuò)增引物
[0187]在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中,使用合適的基于PCR的檢測(cè)方法檢測(cè)本發(fā)明的分子標(biāo)志物,其中PCR擴(kuò)增子的大小或序列指示所述標(biāo)志物(例如,特定的標(biāo)志物等位基因)的存在與否。在這些類(lèi)型的方法中,PCR引物與位于多態(tài)標(biāo)志物區(qū)側(cè)翼的保守區(qū)雜交。
[0188]可以使用任何合適的方法設(shè)計(jì)用于本發(fā)明的合適的引物。并非意圖將本發(fā)明限于任何特定的引物或引物對(duì)。例如,可以使用任何合適的軟件程序,諸如LASERGENE?,例如考慮到公眾可利用的序列信息來(lái)設(shè)計(jì)引物。本文鑒定的多態(tài)性的側(cè)翼序列為公眾可得到的;因此,可以基于充分理解的堿基配對(duì)原則構(gòu)建合適的擴(kuò)增引物。正如上述已經(jīng)進(jìn)行了討論,例如可以通過(guò)雜交、陣列雜交、PCR、實(shí)時(shí)PCR、LCR等進(jìn)行任何擴(kuò)增子的序列。
[0189]在某些實(shí)施方案中,可以通過(guò)任何合適的手段(例如,使用非放射性熒光標(biāo)簽)放射性標(biāo)記或標(biāo)記本發(fā)明的引物,以便能夠在不添加任何額外的標(biāo)記步驟或顯現(xiàn)步驟的擴(kuò)增反應(yīng)后使不同大小的擴(kuò)增子快速顯現(xiàn)。在某些實(shí)施方案中,不標(biāo)記引物并且在其大小解析后,例如在瓊脂糖或丙烯酰胺凝膠電泳后使擴(kuò)增子顯現(xiàn)。在某些實(shí)施方案中,在大小解析后對(duì)PCR擴(kuò)增子進(jìn)行溴化乙錠染色能夠使不同大小的擴(kuò)增子顯現(xiàn)。
[0190]并非意圖將本發(fā)明的引物限于產(chǎn)生任何特定大小的擴(kuò)增子。例如,用于擴(kuò)增本文的標(biāo)志物基因座和等位基因的引物并不限于擴(kuò)增相關(guān)基因座的完整區(qū)或其任何子區(qū)。該引物可以產(chǎn)生任何適當(dāng)長(zhǎng)度的擴(kuò)增子用于檢測(cè)。在某些實(shí)施方案中,標(biāo)志物擴(kuò)增產(chǎn)生了至少20個(gè)核苷酸長(zhǎng)度,或可選擇地,至少50個(gè)核苷酸長(zhǎng)度,或可選擇地,至少100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度,或可選擇地,至少200個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的擴(kuò)增子??梢允褂帽疚呐兜母鞣N技術(shù)檢測(cè)任何大小的擴(kuò)增子??梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)方法,諸如電泳檢測(cè)堿基組成或大小的差別。
[0191]用于定位克隆的標(biāo)志物的檢測(cè)
[0192]在某些實(shí)施方案中,核酸探針用于檢測(cè)包含標(biāo)志物序列的核酸。例如,除測(cè)定乳腺癌表型中的作用外,這類(lèi)探針還可以用于定位克隆以便分離與標(biāo)志物核苷酸序列連接的核苷酸序列。并非意圖將本發(fā)明的核酸探針限于任何特定的大小。在某些實(shí)施方案中,核酸探針至少為20個(gè)核苷酸長(zhǎng)度,或可選擇地,至少50個(gè)核苷酸長(zhǎng)度,或可選擇地,至少100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度,或可選擇地,至少200個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。
[0193]例如,根據(jù)待檢測(cè)的標(biāo)記物的不同,使用放射自顯影術(shù)、熒光照相術(shù)或其它類(lèi)似檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)雜交的探針。特異性雜交方案的實(shí)例為本領(lǐng)域中廣泛可利用的,例如參見(jiàn)Berger, Sambrook 和 Ausubel,均在本文中。
[0194]轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的產(chǎn)生
[0195]本發(fā)明還提供了用依照本發(fā)明鑒定的QTL所對(duì)應(yīng)的核酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。例如,這類(lèi)核酸包括編碼對(duì)應(yīng)于乳腺癌表型的QTL或與乳腺癌表型的QTL連鎖的基因的cDNA、0RF、基因、和/或染色體間隔(例如,基因組片段)。另外,本發(fā)明提供了影響乳腺癌表型的多肽的生產(chǎn)方法。例如,它可用于影響乳腺癌和產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。這些細(xì)胞提供了具有影響相關(guān)表型的確定基因的商業(yè)上有用的細(xì)胞系,由此提供了篩選表型的潛在調(diào)控劑的平臺(tái)以及針對(duì)所關(guān)注基因各自作用機(jī)理的基礎(chǔ)研究。此外,基因療法可以用于將期望基因?qū)肫鋫€(gè)體或群體。這類(lèi)基因療法可以用于提供治療由個(gè)體表現(xiàn)出的病癥的方法或可以用作預(yù)防處于風(fēng)險(xiǎn)中的個(gè)體發(fā)生這類(lèi)病癥的預(yù)防措施。
[0196]描述用于克隆和操作核酸和生產(chǎn)所編碼的多肽的分子生物學(xué)技術(shù)的一般教科書(shū)包括Berger矛口KimmeI,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymologyvolumel52Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger) ;Sambrook 等,MolecularCloning-A Laboratory Manual(3rd Ed.), Vol.1~3, Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, New York,2001(〃Sambrook〃)和 Current Protocols in MolecularBiology, F.M.Ausubel 等,eds., Current Protocols, Greene Publishing Associates,Inc.與John ffiley&Sons, Inc.的合作項(xiàng)目(增補(bǔ)至2004或以后)(〃Ausubel〃))。這些教科書(shū)描述了誘變,載體,啟動(dòng)子和許多其它與例如產(chǎn)生包含所關(guān)注的核酸的克隆相關(guān)的主題的應(yīng)用,例如,基因、標(biāo)志物基因座、標(biāo)志物探針、與標(biāo)志物基因座分離的QTL等。
[0197]宿主細(xì)胞用本發(fā)明載體(例如,載體,諸如包含衍生自QTL或與之相關(guān)的基因或ORF的表達(dá)載體)遺傳改造(例如,轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化的等),所述本發(fā)明的載體可以為,例如克隆載體、穿梭載體或表達(dá)載體。這類(lèi)載體為,例如質(zhì)粒、曬菌粒、農(nóng)桿菌(agrobacterium)、病毒、裸多核苷酸(線性或環(huán)狀)、或偶聯(lián)多核苷酸的形式??梢詫⑤d體導(dǎo)入細(xì)菌,尤其是為了增殖和擴(kuò)增的目的。有關(guān)核酸導(dǎo)入方法的額外詳細(xì)描述可以在下文的Sambrook,Berger和Ausubel中找到。將本發(fā)明的核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法對(duì)本發(fā)明而言并不關(guān)鍵,并且并非意圖將本發(fā)明限于任何將外源性遺傳物質(zhì)導(dǎo)入宿主細(xì)胞的特定方法。因此,可以使用任何合適的方法并且應(yīng)用于本發(fā)明,例如,包括,但不限于本文提供的方法,這些方法提供了將核酸有效導(dǎo)入細(xì)胞或原生質(zhì)體。
[0198]可以在根據(jù)諸如,例如活化啟動(dòng)子或選擇轉(zhuǎn)化體這類(lèi)活動(dòng)的需要而改良的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)改造后的宿主細(xì)胞。除全部在下文中的Sambrook, Berger和Ausubel外,Atlas 和 Parks(eds)The Handbook of MicrobiologicalMedia(1993) CRC Press,Boca Raton, FL 和可得至Ij 的商業(yè)文獻(xiàn),諸如 Life Science Research Cell CultureCatalogue (2004) Sigma-Aldrich, Inc (St Louis,MO) ("Sigma-LSRCCC")提供了額外的詳細(xì)描述。
[0199]使標(biāo)志物與表型建立相關(guān)性
[0200]本發(fā)明的一個(gè)方面在于描述圖1和/或2中注意到的多態(tài)性與乳腺癌表型之間的相關(guān)性。對(duì)這些相關(guān)性的理解可以用于本發(fā)明,以便建立有關(guān)一組確定個(gè)體或樣品所具有的多態(tài)性的信息與他們有可能展示的表型之間的相關(guān)性。此外,考慮了一種或多種不同基因中的等位基因組合的高級(jí)相關(guān)性也可以用于評(píng)價(jià)與表型的相關(guān)性。
[0201]可以通過(guò)任何方法建立這些相關(guān)性,所述的方法可以鑒定等位基因與表型或等位基因組合與表型組合之間的相關(guān)性。例如,圖1和/或2中的基因或基因座中的等位基因可以與一種或多種乳腺癌表型相關(guān)。最一般的情況是,這些方法包括參照查閱表,該表包含多態(tài)性的等位基因與表型之間的相關(guān)性。該表可以包括多個(gè)等位基因-表型相關(guān)性的數(shù)據(jù)并且例如,通過(guò)使用統(tǒng)計(jì)學(xué)工具,諸如主要成分分析、啟發(fā)算法等考慮到了多個(gè)等位基因-表型相關(guān)性的疊加或其它高級(jí)作用。
[0202]標(biāo)志物與表型的相關(guān)性任選包括對(duì)相關(guān)性進(jìn)行一種或多種統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。許多統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)為已知的且大部分為計(jì)算機(jī)執(zhí)行的以便于分析。測(cè)定表型性狀與生物學(xué)標(biāo)志物之間的關(guān)聯(lián)性/相關(guān)性的各種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為公知的并且可以應(yīng)用于本發(fā)明。關(guān)于該主題的介紹,參見(jiàn) Hartl (1981) A Primer of Population Genetics Washington University,Saint Louis Sinauer Associates, Inc.Sunderland, MA ISBN:0-087893-271_2。各種適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)模型描述在 Lynch 和 Walsh (1998) Genetics and Analysis of QuantitativeTraits, Sinauer Associates, Inc.Sunderland MA ISBN0-87893-481-2。例如,這些模型可以提供基因型與表型值之間的相關(guān)性,表征基因座對(duì)表型的影響,分類(lèi)環(huán)境與基因型之間的相關(guān)性,測(cè)定基因的顯性或外顯率,測(cè)定母體和其它后生效應(yīng),測(cè)定分析中的主要成分(通過(guò)主要成分分析或〃PCA")等。這些教科書(shū)中引述的參考文獻(xiàn)提供了有關(guān)使標(biāo)志物與表型建立相關(guān)性的統(tǒng)計(jì)學(xué)模型的大量額外詳細(xì)描述。
[0203]除用于測(cè)定相關(guān)性的標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法外,通過(guò)模式識(shí)別和訓(xùn)練,諸如使用遺傳算法測(cè)定相關(guān)性的其它方法也可以用于測(cè)定標(biāo)志物與表型之間的相關(guān)性。這在鑒定多個(gè)等位基因與多個(gè)表型之間的高級(jí)相關(guān)性時(shí)特別有用。為了解釋?zhuān)梢詫⑸窠?jīng)網(wǎng)絡(luò)法與遺傳算法型編程結(jié)合應(yīng)用于啟發(fā)式開(kāi)發(fā)結(jié)構(gòu)-功能數(shù)據(jù)空間模型,該模型測(cè)定遺傳信息與表型結(jié)果之間的相關(guān)性。例如,NNUGA(Neural Network Using Genetic Algorithms)為可利用的程序(例如,在環(huán)球網(wǎng)cs.bgu.ac.1l/~omri/NNUGA上,它結(jié)合了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法。例如,可以在 Kevin Gurney, An Introduction to Neural Networks, UCL Press (1999)和環(huán)球網(wǎng) shef.ac.uk/psychology/gurney/notes/index, html 上找到有關(guān)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的介紹。額外有用的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的參考書(shū)包括上述有關(guān)遺傳算法的那些,并且例如有Bishop,NeuralNetworks for Pattern Recognition, Oxford University Press (1995)和 Ripley 等,Pattern Recognition and Neural Networks, Cambridge University Press (1995)。顯不例示性數(shù)據(jù)集,包括某些統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的兩個(gè)表如圖1和/或2中所示。
[0204]可用于理解利用和建立相關(guān)性的數(shù)據(jù)分析應(yīng)用、分析的主要成分、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模等的額外參考書(shū)包括,例如,Hinchliffe, Modeling Molecular Structures, John Wileyand Sons (1996):Gibas和.Tambeck, BioinformaticsComputer Skills, 0’Reilly(2001);Pevzner, Computational Molecular Biology and Algorithmic Approach, The MITPress (2000) ;Durbin 等,Biological Sequence Analysis!Probabilistic Models ofProteins and Nucleic acids, Cambridge University Press (1998);和 Rashidi 和Buehler, Bioinformatic Basics:Applications in Biological Science and Medicine.CRC Press LLC(2000)。
[0205]在任何情況下,任何統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)基本上均可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)編程法或使用任何各種〃架外〃軟件包應(yīng)用于計(jì)算機(jī)執(zhí)行的模型,所述的〃架外〃軟件包執(zhí)行這類(lèi)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,包括,例如,上述那些和商購(gòu)的那些,例如,來(lái)自Partek Incorporated (St.Peters, Missouri ;www.partek.com),例如,其提供用于模式識(shí)別的軟件(例如,提供Partek Pro2000PatternRecognition Software),它可以應(yīng)用于遺傳算法以便進(jìn)行多變量數(shù)據(jù)分析、交互式顯現(xiàn)、可變選擇、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和統(tǒng)計(jì)學(xué)建模等。例如,可以通過(guò)主要成分分析(PCA)作圖的散點(diǎn)圖和雙點(diǎn)圖(biplot)、多維標(biāo)定(Mult1-Dimensional Scaling, MDS)、多維標(biāo)定(MDS)作圖的散點(diǎn)圖、星狀圖等分析相關(guān)性。用于進(jìn)行相關(guān)性分析的可利用的軟件包括SAS、R和MathLab。
[0206]標(biāo)志物無(wú)論是多態(tài)性還是表達(dá)模式均可以用于任何不同的遺傳分析。例如,一旦鑒定出標(biāo)志物,正如本例中的那樣,就可以將它們用于相關(guān)研究的許多不同測(cè)定法。例如,可以為查詢(xún)這些標(biāo)志物而設(shè)計(jì)微陣列的探針。其它例示性測(cè)定法包括,例如,Taqman測(cè)定法和上文所述的分子信標(biāo)測(cè)定法以及常規(guī)的PCR和/或測(cè)序技術(shù)。
`[0207]有關(guān)相關(guān)性研究的額外詳細(xì)描述可以在如下文獻(xiàn)中找到:2002年3月26日提交的 10/106,097,標(biāo)題為"Methods for Genomic Analysis" ;2002 年 I 月 7 日提交的10/042, 819,標(biāo)題為"Genetic Analysis Systems and Methods" ;2002 年 10 月 31 日提交的 10/286,417,標(biāo)題為"Methods for Genome Analysis" ;2004 年 I 月 30 日提交的 10/768, 788,標(biāo)題為"Apparatus and Methods for Analyzing and CharacterizingNucleic Acids Sequences" ;2003 年 5 月 28 日提交的 10/447,685,標(biāo)題為〃Liver RelatedDisease Compositions and Methods" ;2004 年 10 月 20 日提交的 10/970,761,標(biāo)題為"Improved Analysis Methods and Apparatus for Individual Genotyping〃(用于個(gè)體基因分型的方法);2004年9月30日提交的10/956,224,標(biāo)題為〃Methods for GeneticAnalysis'
[0208]在某些實(shí)施方案中,標(biāo)志物數(shù)據(jù)用于進(jìn)行相關(guān)性研究以便顯示標(biāo)志物與表型之間的相關(guān)性。這可以通過(guò)測(cè)定具有所關(guān)注表型的個(gè)體(即,展示出所關(guān)注表型的個(gè)體或群體)中的標(biāo)志物特征并且比較這些個(gè)體中標(biāo)志物的等位基因頻率或其它特征(表達(dá)水平等)與對(duì)照組個(gè)體中等位基因頻率或其它特征來(lái)進(jìn)行??梢曰谌蚪M進(jìn)行這類(lèi)標(biāo)志物測(cè)定或可以將這類(lèi)標(biāo)志物測(cè)定集中于基因組的特定區(qū)(例如,所關(guān)注的單倍型段)。在一個(gè)實(shí)施方案中,對(duì)與圖1和/或2中基因或基因座連鎖的標(biāo)志物評(píng)價(jià)與一種或多種特定乳腺癌惡病質(zhì)表型的相關(guān)性。
[0209]除本文披露的本發(fā)明方法的其它實(shí)施方案外,所述的方法還能夠"切開(kāi)"表型。即特定的表型可以(并且一般確實(shí))由兩種或多種不同遺傳堿基產(chǎn)生。例如,在一種個(gè)體中的易感性表型可能是圖1和/或2中的基因中的"缺陷"(或單純是特定等位基因一在易感性表型方面的"缺陷"是語(yǔ)境依賴(lài)性的,例如,表型在指定環(huán)境中是個(gè)體需要的還是不需要的)的結(jié)果,而在不同個(gè)體中相同的基礎(chǔ)表型可能是圖1和/或2中多個(gè)基因中的多個(gè)〃缺陷〃的結(jié)果。如此,掃描多個(gè)標(biāo)志物(例如,作為在基因組或單倍型段掃描中)能夠切開(kāi)類(lèi)似(或分級(jí)的(graduated))表型的不同遺傳堿基。
[0210]如上述段落中所述,進(jìn)行相關(guān)性研究的一種方法在于比較具有所關(guān)注表型的個(gè)體("病例組")中的等位基因頻率(或表達(dá)水平)與對(duì)照組個(gè)體中的等位基因頻率。在一種方法中,信息SNP用于進(jìn)行SNP單倍型模式比較(〃信息SNP"為遺傳SNP標(biāo)志物,諸如基因組或單倍型段中趨向于區(qū)分一種SNP、基因組或單倍型模式與其它SNP、基因組或單倍型模式的SNP或SNP子集(一種以上))。使用信息SNP的方法具有勝過(guò)本領(lǐng)域中知道的其它全基因組掃描或基因分型方法的優(yōu)點(diǎn),以便代替讀取每一個(gè)體基因組的所有30億個(gè)堿基一或乃至讀取可能發(fā)現(xiàn)的3-4百萬(wàn)個(gè)常見(jiàn)SNP —僅來(lái)自樣品群的信息SNP需要檢測(cè)。讀取這些特定信息SNP提供了足夠的信息以便能夠如上所述從特定實(shí)驗(yàn)群體中提取統(tǒng)計(jì)學(xué)上精確的相關(guān)性數(shù)據(jù)。
[0211 ] 如此,在測(cè)定遺傳相關(guān)性的一種方法的實(shí)施方案中,對(duì)未展不出表型的對(duì)照群體的基因組測(cè)定信息SNP的等位基因頻率。還對(duì)確實(shí)展示出表型的群體的基因組測(cè)定了信息SNP的等位基因頻率。比較信 息SNP等位基因頻率。例如,可以通過(guò)測(cè)定每一群體中各信息SNP位置上的等位基因頻率(群體中特定等位基因的實(shí)例數(shù)除以等位基因總數(shù))并且比較這些等位基因頻率進(jìn)行等位基因頻率比較。選擇展示出對(duì)照與病例群體/組中的等位基因出現(xiàn)頻率之間差異的信息SNP用于分析。一旦選擇了信息SNP,就鑒定包含信息SNP的SNP單倍型段,繼而鑒定與表型相關(guān)的所關(guān)注的基因組區(qū)。例如,可以通過(guò)本領(lǐng)域中公知的遺傳或任何生物學(xué)方法分析基因組區(qū),以便用作藥物研發(fā)靶標(biāo)或診斷標(biāo)志物。
[0212]用于鑒定乳腺癌表型的系統(tǒng)
[0213]執(zhí)行上述相關(guān)性建立的系統(tǒng)也為本發(fā)明的特征。一般而言,該系統(tǒng)包括使等位基因的存在與否(例如,無(wú)論是直接檢測(cè)的還是通過(guò)表達(dá)水平檢測(cè)的)與預(yù)測(cè)表型建立相關(guān)性的系統(tǒng)指令。該系統(tǒng)指令可以比較有關(guān)等位基因序列或表達(dá)水平的檢測(cè)信息與包括等位基因與相關(guān)表型之間相關(guān)性的數(shù)據(jù)庫(kù)。如上所述,該數(shù)據(jù)庫(kù)可以為多維的,由此包括等位基因組合與相關(guān)表型之間的高級(jí)相關(guān)性??梢詫⑦@些相關(guān)性?xún)?chǔ)存在任何數(shù)目的查閱表中,例如,采用電子數(shù)據(jù)表形式(例如,Excel?電子數(shù)據(jù)表)或數(shù)據(jù)庫(kù),諸如Access?、SQL?、Oracle?, Paradox?或類(lèi)似數(shù)據(jù)庫(kù)。該系統(tǒng)包括用于例如通過(guò)自動(dòng)化或用戶界面輸入有關(guān)等位基因檢測(cè)信息的樣品特異性信息并且用于比較該信息與查閱表的條款。
[0214]任選該系統(tǒng)指令還可以包括接受與任何檢測(cè)的等位基因信息相關(guān)的診斷信息,例如,具有相關(guān)等位基因的受試者具有特定表型的診斷的軟件。該軟件本質(zhì)上可以為啟發(fā)式的,使用這類(lèi)輸入的相關(guān)性來(lái)改善查閱表的準(zhǔn)確性和/或由該系統(tǒng)解讀查閱表。各種這類(lèi)方法,包括神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、馬爾可夫建模和其它統(tǒng)計(jì)學(xué)分析如上所述。
[0215]本發(fā)明提供了用于檢測(cè)一種或多種可檢測(cè)遺傳標(biāo)志物的數(shù)據(jù)采集模塊(例如,包含一種或多種生物分子探針的一種或多種陣列、檢測(cè)器、流體處理器等)。這類(lèi)數(shù)據(jù)采集模塊的生物分子探針可以包括適合于檢測(cè)生物學(xué)標(biāo)志物,例如寡核苷酸探針、蛋白質(zhì)、適體、抗體等的任意種。它們可以包括樣品處理器(例如,流體處理器)、機(jī)器人、微流體系統(tǒng)、核酸或蛋白質(zhì)純化模塊、陣列(例如,核酸陣列)、檢測(cè)器、熱循環(huán)儀或其組合,例如,用于獲取樣品、稀釋或等分樣品、純化標(biāo)志物材料(例如,核酸或蛋白質(zhì))、擴(kuò)增標(biāo)志物核酸、檢測(cè)擴(kuò)增的標(biāo)志物核酸等。
[0216]例如,可以并入所述系統(tǒng)的自動(dòng)化裝置用于評(píng)價(jià)各種生物現(xiàn)象,包括,例如基因應(yīng)答所選刺激物的表達(dá)水平(Service (1998) "Microchips Arrays Put DNA on theSpot^Science282:396-399)、高通量 DNA 基因分型(Zhang 等(1999) "Automated andIntegrated System for High-Throughput DNA Genotyping Directly from Blood"Anal.Chem.71:1138-1145)等。類(lèi)似地,還可利用進(jìn)行混合實(shí)驗(yàn)、DNA擴(kuò)增、DNA測(cè)序等的集成系統(tǒng)。例如,參見(jiàn) Service (1998) "Coming Soon:the Pocket DNA Sequencer//Science282:399-401 o例如,各種自動(dòng)化系統(tǒng)部件可購(gòu)自Caliper Technologies (Hopkinton,MA),其使用各種Zymate系統(tǒng),它們一般包括,例如機(jī)器人和流體處理模塊。類(lèi)似地,用于各種實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng),例如,用于微量滴定托盤(pán)操作的常用ORCA?機(jī)器人也可商購(gòu),例如,購(gòu)自BeckmanCoulter, Inc.(Fullerton, CA)。類(lèi)似地,可以用作本發(fā)明系統(tǒng)部件的商購(gòu)微流體系統(tǒng)包括來(lái)自Agilent technologies和Caliper Technologies的那些。此外,專(zhuān)利和技術(shù)文獻(xiàn)包括微流體系統(tǒng)的大量實(shí)例,包括可以直接與微孔板相連以進(jìn)行自動(dòng)化流體操作的那些。
[0217]任何各種液體處理和/或陣列結(jié)構(gòu)可以用于本文的系統(tǒng)。一種用于本文系統(tǒng)的常用形式是微量滴定板,其中陣列或液體處理器包括微量滴定托盤(pán)。這類(lèi)托盤(pán)為商購(gòu)的并且可以按照各種孔大小和每個(gè)托盤(pán)的孔數(shù)目定購(gòu),以及各種功能化表面,用于測(cè)定法或陣列成分的結(jié)合。常用的托盤(pán)包括普遍的96孔板,還有常用的384和1536孔板??梢栽谶@類(lèi)托盤(pán)上處理樣品,其中所有處理步驟在所述托盤(pán)上進(jìn)行。還可以在微流體設(shè)備或微量滴定和微流體設(shè)備的組合中處理樣品。
[0218]除液相陣列外,還`可以將成分儲(chǔ)存在固相陣列中或在固相陣列上進(jìn)行分析。這些陣列以空間可及的模式(例如,行和列柵格)將物質(zhì)固定在固相基質(zhì),諸如膜(例如尼龍或硝化纖維素)、聚合物或陶瓷表面、玻璃或改性二氧化硅表面、金屬表面等上。例如,可以通過(guò)雜交、通過(guò)局部再水化(例如使用移液管或其它流體處理部件)和流體轉(zhuǎn)移、或通過(guò)刮取陣列或切下陣列上所關(guān)注的位置評(píng)價(jià)成分。
[0219]所述的系統(tǒng)還可以包括使用本文所述的任何方法檢測(cè)等位基因信息的檢測(cè)儀器。例如,可以將為檢測(cè)實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物配置的檢測(cè)器(例如,光學(xué)檢測(cè)器,諸如熒光檢測(cè)器)或陣列讀取器并入該系統(tǒng)。例如,可以為檢測(cè)來(lái)自包含所關(guān)注的等位基因的雜交或擴(kuò)增反應(yīng)的光發(fā)射配置檢測(cè)器,其中所述的光發(fā)射指示所述等位基因的存在與否。任選提供檢測(cè)器與包含上述系統(tǒng)指令的計(jì)算機(jī)之間的可操作連接,從而能夠向計(jì)算機(jī)自動(dòng)輸入檢測(cè)到的等位基因特異性信息,例如,計(jì)算機(jī)可以?xún)?chǔ)存數(shù)據(jù)庫(kù)信息和/或執(zhí)行系統(tǒng)指令以便比較檢測(cè)到的等位基因特異性信息與查閱表。
[0220]還可以將用于產(chǎn)生由檢測(cè)器檢測(cè)的信息的探針與任何其它硬件或軟件一起并入系統(tǒng),以便使用該探針檢測(cè)擴(kuò)增子。它們可以包括熱循環(huán)儀部件(例如,用于進(jìn)行所述探針檢測(cè)的等位基因的PCR或LCR擴(kuò)增)、探針在其上排成陣列和/或雜交的陣列等。用于處理樣品的上述流體處理部件可以用于移動(dòng)樣品材料(例如,待檢測(cè)的模板核酸和/或蛋白質(zhì))、引物、探針、擴(kuò)增子等從而彼此接觸。例如,該系統(tǒng)可以包括一組為檢測(cè)一種或多種與表型相關(guān)的基因或連鎖基因座中的至少一種等位基因而配置的標(biāo)志物探針或引物,其中所述的基因編碼圖1和/或2中的多態(tài)性。配置檢測(cè)器組件是為了檢測(cè)從該組標(biāo)志物探針或引物輸出的一種或多種信號(hào)或由該組標(biāo)志物探針或引物產(chǎn)生的擴(kuò)增子,由此鑒定等位基因的存在與否。[0221]所分析的樣品任選為系統(tǒng)的組成部分或可以考慮與其分開(kāi)。樣品任選包括,例如,如本文所述的基因組DNA、擴(kuò)增的基因組DNA、cDNA、擴(kuò)增的cDNA、RNA、擴(kuò)增的RNA、蛋白質(zhì)等。在一個(gè)方面中,樣品衍生自哺乳動(dòng)物,諸如人類(lèi)患者。
[0222]任選提供用于與用戶形成界面的系統(tǒng)部件。例如,該系統(tǒng)可以包括顯示計(jì)算機(jī)執(zhí)行的系統(tǒng)指令的輸出的用戶可視顯示器、用于輸入用戶命令和激活該系統(tǒng)的用戶輸入裝置(例如,鍵盤(pán)或點(diǎn)擊裝置,諸如鼠標(biāo))等。一般而言,所關(guān)注的系統(tǒng)包括計(jì)算機(jī),其中各種計(jì)算機(jī)執(zhí)行的系統(tǒng)指令在計(jì)算機(jī)軟件中具體實(shí)施,例如,儲(chǔ)存在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上的。
[0223]標(biāo)準(zhǔn)臺(tái)式應(yīng)用軟件,諸如文字處理軟件(例如Microsoft Word?或CorelWordPerfect?)和數(shù)據(jù)庫(kù)軟件(例如電子數(shù)據(jù)表軟件,諸如Microsoft Excel?、CorelQuattro Pro? 或數(shù)據(jù)庫(kù)程序,諸如 Microsoft Access? 或 Sequel?、Oracle?、Paradox?)可以通過(guò)輸入對(duì)應(yīng)于本文等位基因或等位基因與表型之間相關(guān)性的字符串而適合于本發(fā)明。例如,系統(tǒng)可以包括具有適當(dāng)字符串信息的軟件,例如,它與用戶界面(例如,在標(biāo)準(zhǔn)操作系統(tǒng),諸如Windows、Macintosh或LINUX系統(tǒng)中,為⑶I)聯(lián)合以處理字符串。還可以將專(zhuān)用的序列對(duì)比程序,諸如BLAST并入本發(fā)明的系統(tǒng)以便對(duì)核酸或蛋白質(zhì)(或相應(yīng)的字符串)進(jìn)行序列對(duì)比,例如,用于鑒定多個(gè)等位基因并且建立相關(guān)性。
[0224]正如注意到的,系統(tǒng)可以包括具有適當(dāng)數(shù)據(jù)庫(kù)和本發(fā)明等位基因序列或相關(guān)性的計(jì)算機(jī)。用于對(duì)序列以及輸入軟件系統(tǒng)的、包含任何本文序列的數(shù)據(jù)集進(jìn)行序列對(duì)比的軟件可以為本發(fā)明的特征。計(jì)算機(jī)可以為,例如,PC(基于Intel X86或奔騰芯片兼容DOS?、0S2?、IND0WS?, WINDOWS NT?, WIND0WS95?, WIND0WS98?, WIND0WS2000, WINDOffSME 或 LINUX的機(jī)器,MACINTOSH?,Power PC或基于UNIX的(例如,SUN?工作站或基于LINUX的機(jī)器)或其它商購(gòu)的本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常用計(jì)算機(jī)。用于輸入并且對(duì)比或以其它方式操作序列的軟件可得到,例如,BLASTP和BLASTN,或易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用標(biāo)準(zhǔn)編程語(yǔ)言,諸如 Visualbasic、Fortran、Basic、Java 等構(gòu)建。
[0225]鑒定調(diào)控劑的方法
[0226]除提供用于鑒定乳腺癌惡病質(zhì)等的各種診斷和預(yù)后標(biāo)志物外,本發(fā)明還提供了鑒定乳腺癌表型調(diào)控劑的方法。在這些方法中,使?jié)撛诘恼{(diào)控劑接觸對(duì)應(yīng)于圖1和/或2中的基因座的相關(guān)蛋白質(zhì)或接觸編碼這類(lèi)蛋白質(zhì)的核酸。檢測(cè)潛在調(diào)控劑對(duì)基因或基因產(chǎn)物的作用,由此鑒定潛在調(diào)控劑是否調(diào)控表型潛在的分子基礎(chǔ)。
[0227]此外,所述的方法可以包括,例如,將一種或多種推定的調(diào)控劑施用于展示出相關(guān)表型的個(gè)體并且測(cè)定該推定的調(diào)控劑是否例如在臨床試驗(yàn)或治療環(huán)境中調(diào)控個(gè)體中的表型。這繼而測(cè)定了推定的調(diào)控劑是否在臨床上有用。
[0228]調(diào)控劑接觸的基因或基因產(chǎn)物可以包括本文所述的任何等位基因形式。與不良表型正相關(guān)的等位基因形式,無(wú)論是基因還是蛋白質(zhì),為調(diào)控劑篩選的優(yōu)選靶標(biāo)。[0229]可以篩選的所關(guān)注的作用包括:(a)在有調(diào)控劑存在下圖1和/或2中基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)升高或降低;(b)表達(dá)時(shí)間或位置的改變;或(C)在有調(diào)控劑存在下對(duì)應(yīng)于圖1和/或2中基因座的蛋白質(zhì)定位的改變。
[0230]調(diào)控劑篩選的精確形式當(dāng)然根據(jù)檢測(cè)的作用和可利用的設(shè)備的不同而改變。Northern分析、定量RT-PCR和/或基于陣列的檢測(cè)形式可以用于區(qū)分上述基因的表達(dá)水平。還可以使用可利用的方法,諸如Western印跡、ELISA分析、抗體雜交、BIAcore等檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平。任何這些方法均可以用于區(qū)分因潛在調(diào)控劑導(dǎo)致的表達(dá)水平的改變。
[0231]因此,可以對(duì)潛在調(diào)控劑篩選活性或表達(dá)。例如,可以使?jié)撛谡{(diào)控劑(小分子、有機(jī)分子、無(wú)機(jī)分子、蛋白質(zhì)、激素、轉(zhuǎn)錄因子等)接觸包含所關(guān)注的等位基因的細(xì)胞,并且可以在施用潛在表達(dá)調(diào)控劑之前和之后,例如,通過(guò)Northern分析或定量(任選實(shí)時(shí))RT-PCR檢測(cè)對(duì)對(duì)應(yīng)于圖1和/或2中基因座的基因或蛋白質(zhì)活性或表達(dá)(或它們兩者)的作用。類(lèi)似地,可以使不同基因的啟動(dòng)子區(qū)(例如,一般是轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)中的序列,例如,在起始位點(diǎn)的5kb內(nèi),例如,Ikb或以下,例如,在起始位點(diǎn)的500bp或250bp或IOObp內(nèi))與報(bào)道構(gòu)建體(CAT、i3-半乳糖苷酶、螢光素酶或任何其它可利用的報(bào)道分子)偶聯(lián)并且可以類(lèi)似地測(cè)試潛在調(diào)控劑的表達(dá)活性調(diào)控。在任一情況中,按照高通量方式,例如,使用自動(dòng)化流體處理和/或檢測(cè)系統(tǒng)按照順序或平行方式進(jìn)行測(cè)定。類(lèi)似地,可以使用本文的任何活性檢測(cè)方法通過(guò)使?jié)撛谡{(diào)控劑接觸合適的細(xì)胞測(cè)試活性調(diào)控劑,不管檢測(cè)的活性是否為活性調(diào)控、表達(dá)調(diào)控或它們兩者的結(jié)果。 [0232]用于檢測(cè)調(diào)控劑活性檢測(cè)的生物傳感器也為本發(fā)明的特征。它們包括包含對(duì)應(yīng)于圖1和/或2的基因座的基因或基因產(chǎn)物的裝置或系統(tǒng),其與讀出器偶聯(lián),所述的讀出器測(cè)量或展示所述基因或產(chǎn)物的一種或多種活性。如此,可以通過(guò)可操作地偶聯(lián)適當(dāng)?shù)臏y(cè)定部件與讀出器將任何上述測(cè)定部件配置為生物傳感器。該讀出器可以為光學(xué)的(例如,檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)志物或細(xì)胞存活)、電的(例如,與FET、BIAcore或任何各種其它部件偶聯(lián))、光譜的等,并且可以任選包括用戶可視的顯示器(例如,CRT或光學(xué)觀測(cè)站)。該生物傳感器可以與機(jī)器人或其它自動(dòng)化裝置偶聯(lián),例如,微流體系統(tǒng),其使推定的調(diào)控劑直接與本發(fā)明的蛋白質(zhì)接觸,例如,用于對(duì)推定的調(diào)控劑活性進(jìn)行自動(dòng)化高通量分析。可以適用于本發(fā)明的生物傳感器的各種自動(dòng)化系統(tǒng)為商購(gòu)的。例如,可以制造自動(dòng)化系統(tǒng)以便評(píng)價(jià)各種生物現(xiàn)象,包括,例如,基因應(yīng)答所選刺激物的表達(dá)水平(Service (1998) "Microchips Arrays Put DNAon the Spot〃Science282:396-399)。實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)還可以進(jìn)行例如重復(fù)流體處理操作(例如移液),以便將材料轉(zhuǎn)移至或轉(zhuǎn)移出包含陣列的試劑儲(chǔ)存系統(tǒng),諸如微量滴定托盤(pán)或其它芯片托盤(pán),它們用作各種自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)室方法的基礎(chǔ)容器部件。類(lèi)似地,所述的系統(tǒng)操作例如微量滴定托盤(pán)并且控制各種環(huán)境條件,諸如溫度、對(duì)光或空氣的暴露等。許多這類(lèi)自動(dòng)化系統(tǒng)為商購(gòu)的并且在本文中描述,包括上述那些。它們包括各種Zymate系統(tǒng)、ORCA?.機(jī)器人微流體裝置等。例如,Caliper Technologies, Mountain View, CA 的 LabMicrofluidic裝置⑧高通量篩選系統(tǒng)(HTS)可以適用于本發(fā)明以便篩選調(diào)控劑活性。
[0233]一般而言,用于檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)水平和活性的方法和傳感器為可得到的,包括在上述各種參考文獻(xiàn)中教導(dǎo)的那些,包括R.Scopes, Protein Purification,Springer-Verlag, N.Y.(1982) ;Deutscher, Methods in Enzvmology Vol.182:Guide toProtein Purification,Academic Press,Inc.N.Y.(1990):Sandana(1997)Bioseparationof Proteins, Academic Press, Inc.;Bollag 等(1996)Protein Methods,2th Edition,ffiley-Liss, NY:ffalker(1996)The Protein Protocols Handbook, Humana Press, NJ ;Harris 和 Angal(1990)Protein Purification Applications:A Practical Approach,IRL Press, Oxford, Oxford, England ; Harr is 和 Angal Protein Purification Methods:A Practical Approach IRL Press, Oxford, Oxford, England:Scopes (1993)ProteinPurification:Principles 和 PracticeSrd Edition, Springer Verlag, NY ;Janson和 Ryden(1998)Protein Purification:Principles.High Resolution Methods andApplications, Second Edition, ffiley-VCH, NY ; 和 Walker(1998)Protein Protocolson CD-ROM, Humana Press, NJ ;和 Satinder Ahuja ed.,Handbook of Bioseparations,Academic Press (2000) 0描述了同時(shí)檢測(cè)許多蛋白質(zhì)的〃蛋白質(zhì)組〃檢測(cè)方法并且也如上所述,包括各種多維電泳方法(例如,2-d凝膠電泳)、基于質(zhì)譜的方法(例如,SELD1、MALD1、電噴射等)或表面等離振子共振法。它們還可以用于示蹤蛋白質(zhì)活性和/或表達(dá)水平。
[0234]類(lèi)似地,可以使用任何可利用的方法,包括Northern分析、定量RT-PCR等檢測(cè)核酸表達(dá)水平(例如,mRNA)。足以通過(guò)這些方法指導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員的參考文獻(xiàn)易于得到,包括 Ausubel, Sambrook 和 Berger。
[0235]篩選對(duì)表達(dá)和/或活性的作用的潛在調(diào)控劑文庫(kù)是可得到的。這些文庫(kù)可以是隨機(jī)的或可以是靶向的。
[0236]靶向文庫(kù)包括使用任何形式的合理設(shè)計(jì)技術(shù)設(shè)計(jì)的那些,其選擇支架或構(gòu)件來(lái)產(chǎn)生組合文庫(kù)。這些技術(shù)包括用于設(shè)計(jì)和組合合成祀聚焦文庫(kù)(targe-focused librairy)的大量方法,包括用生物等排轉(zhuǎn)化變形(morphing with bioisosteric transformation)、靶標(biāo)特異性特有結(jié)構(gòu)的分析等。一般而言,如果有關(guān)圖1和/或2的結(jié)構(gòu)基因或基因產(chǎn)物的信息可得到,那么,有可能可以使用例如靈活??糠椒?flexible docking approach)等設(shè)計(jì)結(jié)合配偶體。類(lèi)似地,各種基礎(chǔ)化學(xué)支架有隨機(jī)文庫(kù)。在任一情況中,化學(xué)文庫(kù)的數(shù)以千計(jì)的支架和構(gòu)件是可獲得的,包括具有多肽、核酸、碳水化合物和其它骨架的那些。商購(gòu)的文庫(kù)和文庫(kù)設(shè)計(jì)服務(wù)包括 Chemical Diversity (San Diego, CA)、Affymetrix (SantaClara, CA)、Sigma(St.Louis MO)、ChemBridge Research Laboratories(San Diego, CA)、TimTec (Newark, DE)、Nuevolution A/S (Copenhagen, Denmark)等提供的那些。
[0237]用于治療乳腺癌表型的試劑盒可以包括如上所述鑒定的調(diào)控劑和用于將該化合物施用于患者以便治療乳腺癌的說(shuō)明書(shū)。
[0238]調(diào)控某因的某因表汰
[0239]可以使用本領(lǐng)域公知的各種技術(shù)中任意種調(diào)控與圖1和2中多態(tài)性連鎖的任何基因的基因表達(dá)(例如轉(zhuǎn)錄和/或翻譯)。例如,可以使用反義核酸或干擾RNA抑制基因表達(dá)。抑制特定細(xì)胞類(lèi)型中的表達(dá)可以用于進(jìn)一步研究這些基因的體外或體內(nèi)作用和/或作為治療過(guò)表達(dá)連鎖基因?qū)е碌募不己?或治療這類(lèi)基因的特定等位基因?qū)е碌娘@性效應(yīng)的機(jī)理?;虮磉_(dá)調(diào)控劑為一類(lèi)本發(fā)明提供的調(diào)控劑,例如應(yīng)用于調(diào)控乳腺癌表型的調(diào)控劑。
[0240]例如,反義核酸的應(yīng)用為本領(lǐng)域眾所周知的。反義核酸具有與靶核酸,例如,靶基因、mRNA或cDNA互補(bǔ)的區(qū)。一般而言,將包含相對(duì)于內(nèi)源性基因的編碼(有義)序列呈互補(bǔ)、反義方向的核苷酸序列的核酸導(dǎo)入細(xì)胞。反義核酸可以為RNA、DNA、PNA或任何其它合適的分子。雙鏈體可以在反義序列與其互補(bǔ)有義序列之間形成,導(dǎo)致基因失活。反義核酸可以通過(guò)與轉(zhuǎn)錄自基因的RNA形成雙鏈體、通過(guò)與雙鏈體DNA形成三鏈體等抑制基因表達(dá)。例如,對(duì)于編碼序列為已知的或可以通過(guò)許多充分確立的技術(shù)測(cè)定的任何基因,均可以產(chǎn)生反義核酸(例如,反義RNA或寡聚核苷酸(任選包括增加對(duì)降解的抗性或改善細(xì)胞攝取的修飾的核苷酸和/或鍵)的化學(xué)合成或體外轉(zhuǎn)錄)。例如,下列文獻(xiàn)中描述了反義核酸及其應(yīng)用=Haselton和Alexander的USP6,242,258(2001年6月5日),標(biāo)題為"Methods for the selective regulation of DNA and RNA transcriptionand translation by photoactivation" ;USP6,500,615 ;USP6,498,035 ;USP6,395,544 ;USP5,563,050 ;E.Schuch 等(1991)Symp Soc.Exp Biol45:117-127:de Lange 等(1995)Curr Top Microbiol Immunol197:57-75:Hamilton 等(1995)Curr Top MicrobiolImmunol197:77-89 ;Finnegan 等(1996)Proc Natl Acad Sci USA93:8449-8454 ;Uhlmann和 A.Pepan(1990)Chem.Rev.90:543 ;P.D.Cook (1991)Ant1-Cancer Drug Design6:585 ;J.Goodchild,Biocon jugate Chem.1 (1990) 165:和 S.L Beaucage 和 R.P.1yer (1993),Tetrahedron49:6123 ;和 F.Eckstein,Ed.(1991),Oligonucleotides and Analogues-APractical Approach, IRL Press0
[0241]還可以通過(guò)RNA沉默或干擾抑制基因表達(dá)?!≧NA沉默〃意指細(xì)胞中單鏈或一般為雙鏈RNA的存在導(dǎo)致對(duì)靶基因表達(dá)的抑制的任何機(jī)制,所述的靶基因包含與RNA相同或近似相同的序列,包括,但不限于RNA干擾、抑制轉(zhuǎn)錄自靶基因的靶mRNA翻譯但不改變mRNA的穩(wěn)定性、和轉(zhuǎn)錄沉默(例如,導(dǎo)致靶mRNA轉(zhuǎn)錄抑制的組蛋白乙?;彤惾旧|(zhì)形成)。
[0242]術(shù)語(yǔ)"RNA干擾〃 ("RNAi",有時(shí)稱(chēng)作RNA介導(dǎo)的干擾、轉(zhuǎn)錄后基因沉默、或鎮(zhèn)壓(quelling))意指細(xì)胞中RNA,一般為雙鏈RNA的存在導(dǎo)致基因表達(dá)抑制的現(xiàn)象,所述的基因包含與所述雙鏈RNA相同或近似相同的序列。誘導(dǎo)RNAi的雙鏈RNA稱(chēng)作〃干擾RNA"。基因表達(dá)由如下所述的RNAi機(jī)制抑制,其中干擾RNA的存在導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄自基因的mRNA降解且由此mRNA和任何所編碼的蛋白質(zhì)水平降低。
[0243] RNAi機(jī)制已經(jīng)和正在廣泛在大量真核生物體和細(xì)胞類(lèi)型中研究。例如,參見(jiàn)如下綜述:McManus 和 Sharp (2002) 〃Gene silencing in mammals by small interferingRNAs^Nature Reviews Genetics3:737-747 ;Hutvagner 和 Zamore (2002)^RNAi:Natureabhors a double strand^Curr Opin Genet&Dev200:225-232 ;Hannon(2002)"RNAinterference〃Nature418:244-251 ;Agami(2002)〃RNAi and related mechanismsand their potential use for therapy〃Curr Opin Chem Biol6:829-834 ;Tuschl和 Borkhardt(2002)"Small interfering RNAs:A revolutionary tool for theanalysis of gene function and gene therapy^MoIecular Interventions2: 158-167 ;Nishikura(2001)〃A short primer on RNAi:RNA-directed RNA polymerase acts as akey catalyst〃Celll07:415-418 ;和 Zamore(2001) 〃RNA interference !Listening tothe sound of silence〃Nature Structural Biology8:746_750。RNAi 還描述在專(zhuān)利文獻(xiàn)中;例如,參見(jiàn) Kreutzer 和 Li_er 的 CA2359180,標(biāo)題為〃Method and medicament forinhibiting the expression of a given gene" ;Beach等的 W001/68836,標(biāo)題為"Methodsand compositions for RNA interference" ;Graham 等的 W001/70949,標(biāo)題為"Geneticsilencing";和 Tuschl 等的 W001/75164,標(biāo)題為"RNA sequence-specific mediators ofRNA interference"o
[0244]簡(jiǎn)言之,例如,用稱(chēng)作Dicer的RNA酶III樣酶將導(dǎo)入細(xì)胞(例如導(dǎo)入細(xì)胞質(zhì))的雙鏈RNA處理成較短的雙鏈片段,稱(chēng)作小干擾RNA (siRNA,也稱(chēng)作短干擾RNA)。產(chǎn)生的siRNA的長(zhǎng)度和性質(zhì)依賴(lài)于細(xì)胞種類(lèi),不過(guò),一般siRNA為21-25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度(例如,siRNA可以具有19個(gè)堿基對(duì)的雙鏈體部分,在每端上帶有2個(gè)核苷酸的3’懸垂)。類(lèi)似地,可以在體外產(chǎn)生siRNA(例如,通過(guò)化學(xué)合成或體外轉(zhuǎn)錄)并且將其導(dǎo)入細(xì)胞以便誘導(dǎo)RNAi。siRNA與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)結(jié)合。任選發(fā)生siRNA的有義和反義鏈的分離,及siRNA反義鏈與其靶mRNA通過(guò)互補(bǔ)堿基配對(duì)相互作用的相互作用。最終mRNA裂解和降解。
[0245]由此可以通過(guò)將適當(dāng)選擇的雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞特異性抑制靶基因在細(xì)胞中的表達(dá)。用于設(shè)計(jì)合適的干擾RNA的指導(dǎo)原則為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如,一般針對(duì)外顯子序列,而非內(nèi)含子或非翻譯區(qū)設(shè)計(jì)干擾RNA。高效干擾RNA的表征可能因細(xì)胞類(lèi)型而改變。例如,盡管siRNA可能需要3’懸垂和5’磷酸以便最有效地誘導(dǎo)果蠅細(xì)胞中的RNAi,但是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中缺乏5’磷酸的平末端siRNA和/或RNA誘導(dǎo)RNAi可以與有3’懸垂和/或5’憐酸的siRNA誘導(dǎo)RNAi同樣有效(例如,參見(jiàn)Czauderna等(2003) "Structuralvariations and stabilizing modifications of synthetic siRNAs in mammaliancells〃Nucl Acids Res31:2705-2716)。作為另一個(gè)實(shí)例,由于大于30-80個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度的雙鏈RNA活化哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的抗病毒干擾素應(yīng)答并且導(dǎo)致非特異性沉默,所以用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的干擾RNA —般小于30個(gè)堿基對(duì)(例如,Caplen等(2001) "Specificinhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrateand vertebrate systems"Proc.Natl.Acad.Sc1.USA98:9742-9747 ;Elbashir 等(2001)"Duplexes of21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in culturedmammalian cells〃Nature411:494-498 ;和 Elbashir 等(2002)"Analysis of genefunction in somatic mammalian cells using small interfering RNAs〃Methods26:199-213其描述了 21個(gè)核苷酸的siRNA在特異性抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中的基因表達(dá)中的應(yīng)用 JPKim 等(2005) "Synthetic dsRNA Dicer substrates enhance RNAi potency andefficacy〃Nature Biotechnology23:222_226,其描述了 25-30 個(gè)核苷酸雙鏈體的應(yīng)用)。siRNA的有義和反義鏈一般但非一定在siRNA雙鏈區(qū)內(nèi)(不包括任何懸垂)彼此完全互補(bǔ)。反義鏈一般在相同區(qū)內(nèi)與靶mRNA完全互補(bǔ),不過(guò),可以耐受一些核苷酸取代(例如,反義鏈與mRNA之間的一個(gè)或兩個(gè)核苷酸錯(cuò)配仍然可以產(chǎn)生RNAi,不過(guò),效率降低)。雙鏈區(qū)的末端一般比中部更耐受取代;例如,已經(jīng)證實(shí)在具有19bp雙鏈區(qū)的21聚物環(huán)境內(nèi)反義鏈與革巴mRNA之間的互補(bǔ)性小至15bp (堿基對(duì))可產(chǎn)生功能性siRNA(例如,參見(jiàn)Czauderna等(2003)"Structural variations and stabilizing modifications of synthetic siRNAsin mammalian cells〃Nucl Acids Res31:2705-2716)。任何懸垂可以但非一定與革巴 mRNA互補(bǔ);例如,TT (兩個(gè)2’ -脫氧胸苷)懸垂頻繁應(yīng)用于降低合成成本。
[0246]盡管最初認(rèn)為需要雙鏈RNA(例如,雙鏈siRNA)啟動(dòng)RNAi,但是幾個(gè)近期的報(bào)導(dǎo)表明這類(lèi)siRNA的反義鏈足以啟動(dòng)RNAi。單鏈反義siRNA可以通過(guò)與雙鏈siRNA相同的途徑啟動(dòng)RNAi(正如所證實(shí)的,例如,根據(jù)特異性mRNA內(nèi)切核酸降解裂解片段的出現(xiàn))。就雙鏈干擾RNA而言,高效單鏈siRNA的特征可以因細(xì)胞類(lèi)型的不同而改變(例如,在反義鏈上可能需要5’磷酸以便有效誘導(dǎo)某些細(xì)胞類(lèi)型中的RNAi,而游離5’羥基在能夠使羥基磷酸化的其它細(xì)胞類(lèi)型中是足夠的)。例如,參見(jiàn)Martinez等(2002) 〃Single_strandedantisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi^CellllO:563-574 ;Amarzguioui等(2003)"Tolerance for mutations and chemical modifications in a siRNA^Nuc1.Acids Res.31:589-595 ;Holen 等(2003)"Similar behavior of single-strand anddouble-strand siRNAs suggests that they act through a common RNAi pathway^Nuc1.Acids Res.31:2401-2407 ;和 Schwarz 等(2002)Mol.CelllO:537_548。[0247]由于在對(duì)應(yīng)于指定靶mRNA不同區(qū)的siRNA之間的效率差異,所以一般設(shè)計(jì)幾種siRNA并且對(duì)靶mRNA測(cè)試以便確定那種siRNA最為有效。還可以產(chǎn)生小發(fā)夾RNA(shRNA,也稱(chēng)作短發(fā)夾RNA)形式的干擾RNA,它們?cè)诩?xì)胞中被處理成啟動(dòng)RNAi的siRNA樣分子(例如,參見(jiàn) Siolas 等(2005) "Synthetic shRNAs as potent RNAi triggers ^NatureBiotechnology23:227-231)。
[0248]細(xì)胞中RNA,特別是雙鏈RNA的存在可以通過(guò)非RNAi的機(jī)制導(dǎo)致基因表達(dá)抑制,所述的基因包含與RNA相同或接近相同的序列。例如,與靶mRNA部分互補(bǔ)的雙鏈RNA可以抑制mRNA翻譯,但不影響其穩(wěn)定性。作為另一個(gè)實(shí)例,雙鏈RNA可以誘導(dǎo)組蛋白甲基化和異染色質(zhì)形成,從而導(dǎo)致包含與RNA相同或接近相同的序列的基因轉(zhuǎn)錄沉默(例如,參見(jiàn) Schramke 和 Allshire (2003) "Hairpin RNAs and retrotransposonLTRs effect RNAi and chromatin-based gene silencing〃Science301:1069-1074 ;Kawasaki 和 Taira(2004)"Induction of DNA methylation and gene silencingby short interfering RNAs in human cells〃Nature431:211-217 ;和 Morris 等
(2004)^Small interfering RNA-1nduced transcriptional gene silencing in humancells"Science305:1289-1292)。
[0249]已經(jīng)在不同種類(lèi)中鑒定了稱(chēng)作microRNA(miRNA)的短RNA。一般而言,這些內(nèi)源性RNA各自轉(zhuǎn)錄為長(zhǎng)RNA,然后加工成約60-75個(gè)核苷酸的形成有缺陷發(fā)夾(莖-環(huán))結(jié)構(gòu)的前-miRNA。前-miRNA —般隨后例如被Dicer裂解成成熟miRNA。成熟miRNA —般約為21-25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度,但可以改變,例如,約14 一約25或以上個(gè)核苷酸。盡管并非全部,但是已經(jīng)證實(shí)某些miRNA抑制具有部分互補(bǔ)序列的mRNA的翻譯。這類(lèi)miRNA包含一個(gè)或多個(gè)針對(duì)相應(yīng)mRNA的內(nèi)部錯(cuò)配,預(yù)計(jì)它們?cè)趍iRNA反義鏈與mRNA結(jié)合形成的雙鏈體中心產(chǎn)生凸起。miRNA—般與mRNA形成約14-17個(gè)沃森-克里克堿基對(duì);還可以形成額外的擺動(dòng)(wobble)堿基對(duì)。此外,已經(jīng)證實(shí)包含對(duì)相應(yīng)mRNA的中心錯(cuò)配的短合成雙鏈RNA(例如,與siRNA類(lèi)似)抑制mRNA翻譯(但不會(huì)啟動(dòng)降解)。例如,參見(jiàn)Zeng等(2003)"MicroRNAs and small interfering RNAs can inhibit mRNA expression bysimilar mechanisms"Proc.Natl.Acad.Sc1.USA100:9779-9784 ;Doench 等(2003)"siRNAscan function as miRNAs"Genes&Dev.17:438-442 ;Bartel 和 Bartel (2003) "MicroRNAs:At the root of plant development?^?Iant Physiologyl32:709-717 ;Schwarz 和Zamore(2002)"Why do miRNAs live in the miRNP?"Genes&Dev.16:1025-1031 ;Tang 等(2003)〃A biochemical framework for RNA silencing in plants〃Genes&Dev.17:49-63 ;Meister 等(2004)^Sequence-specific inhibition of microRNA-and siRNA-1nducedRNA silencing"RNA10:544-550 ;Nelson 等(2003)"The microRNA world:Small ismighty〃Trends Biochem.Sc1.28:534-540 ;Scacheri 等(2004)^Short interferingRNAs can induce unexpected and divergent changes in the levels of untargetedproteins in mammalian cells〃Proc.Natl.Acad.Sc1.USAlOl: 1892-1897 ;Sempere等(2004)"Expression profiling of mammalian microRNAs uncovers a subset ofbrain-expressed microRNAs with possible roles in murine and human neuronaldifferentiation^Genome Biology5:R13 ;Dykxhoorn 等(2003) "Killing the messenger:Short RNAs that silence gene expression^Nature Reviews Molec.and Cell Biol.4:457-467 ;McManus (2003)"MicroRNAs and cancer"Semin Cancer Biol.13:253-288 ;和Stark 等(2003)"Identification of Drosophila microRNA targets〃PLoS Biol.1:E60o[0250] 涉及部分互補(bǔ)RNA(例如,某些miRNA)對(duì)mRNA翻譯抑制的細(xì)胞機(jī)制似乎與涉及RNAi的部分交疊,不過(guò),正如注意到的,mRNA的翻譯但并非其穩(wěn)定性受到影響,并且mRNA —般不會(huì)降解。
[0251 ] 在RNA的反義鏈結(jié)合mRNA時(shí)形成的凸起的位置和/或大小可以影響RNA抑制mRNA翻譯的能力。類(lèi)似地,RNA自身內(nèi)任何凸起的位置和/或大小也可以影響翻譯抑制效率。例如,參見(jiàn)上述參考文獻(xiàn)。一般而言,翻譯抑制在RNA反義鏈與mRNA3’非翻譯區(qū)(3’UTR)互補(bǔ)時(shí)最為有效。與RNA反義鏈互補(bǔ)的序列的多次重復(fù),例如,串聯(lián)重復(fù)也可以提供更有效的翻譯抑制;例如,被內(nèi)源性miRNA以翻譯方式抑制的某些mRNA在其3’ UTR上包含miRNA結(jié)合序列的7-8個(gè)重復(fù)。值得注意的是翻譯抑制似乎比RNA干擾更依賴(lài)于RNA濃度;認(rèn)為翻譯抑制涉及各自抑制性RNA對(duì)單一 mRNA的結(jié)合,而認(rèn)為RNAi涉及單一 siRNA-RISC復(fù)合物對(duì)mRNA多個(gè)拷貝的切割。
[0252]為抑制指定靶mRNA翻譯而設(shè)計(jì)合適的RNA的指導(dǎo)原則可以在文獻(xiàn)中(例如,上述參考文獻(xiàn)和 Doench 和 Sharp (2004) "Specificity of microRNA target selectionin translational repression〃Genes&Dev.18:504-511 ;Rehmsmeier 等(2004)"Fastand effective prediction of microRNA/target duplexes^RNA10: 1507-1517 ;Robins等(2005)"Incorporati`ng structure to predict microRNA targets〃Proc NatlAcad Sci102:4006-4009 ;和 Mattick 和 Makunin(2005)"Small regulatory RNAs inmammals〃Hum.Mol.Genet.14:R121_R132等)和本文中找到。然而,由于不同結(jié)構(gòu)(例如,凸起大小、序列和/或位置)的RNA與對(duì)應(yīng)于靶mRNA的不同區(qū)的RNA之間翻譯抑制效率的差異,所以任選設(shè)計(jì)幾種RNA并且對(duì)祀mRNA測(cè)試以便確定哪種對(duì)抑制祀mRNA翻譯最為有效。
[0253]針對(duì)基因產(chǎn)物的抗體
[0254]另一類(lèi)調(diào)控劑為結(jié)合與本文基因座連鎖的基因產(chǎn)物的抗體。這些抗體可以用于檢測(cè)和/或純化基因產(chǎn)物,例如在原位監(jiān)測(cè)基因產(chǎn)物。抗體還可以用于在體內(nèi)、原位或體外阻斷基因產(chǎn)物的功能。本文所用的術(shù)語(yǔ)"抗體"包括,但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、人源化或嵌合抗體和生物學(xué)功能性抗體片段,它們?yōu)樽阋允箍贵w片段結(jié)合蛋白質(zhì)的那些片段。
[0255]為了產(chǎn)生針對(duì)相關(guān)基因產(chǎn)物的抗體,可以通過(guò)注射多肽或其部分對(duì)各種宿主動(dòng)物中的任意種免疫接種。舉例而言,這類(lèi)宿主動(dòng)物可以包括,但不限于家兔、小鼠和大鼠。根據(jù)宿主種類(lèi)的不同,各種佐劑可以用于加強(qiáng)免疫應(yīng)答,包括,但不限于弗氏(完全和不完全)佐劑、礦物凝膠諸如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)諸如溶血卵磷脂、Pluronic多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、匙孔蟲(chóng)戚血藍(lán)蛋白、二硝基酚和潛在有用的人佐劑,諸如BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。
[0256]多克隆抗體為衍生自免疫接種了抗原,諸如靶基因產(chǎn)物或其抗原功能性衍生物的動(dòng)物血清的抗體分子的異質(zhì)性群體。為了產(chǎn)生多克隆抗體,可以通過(guò)注射補(bǔ)充了也如上所述的佐劑的所編碼的蛋白質(zhì)或其部分對(duì)諸如上述那些宿主動(dòng)物免疫接種。
[0257]可以通過(guò)任何提供由培養(yǎng)物中連續(xù)細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子的技術(shù)獲得針對(duì)特定抗原的抗體同質(zhì)性群體,即單克隆抗體(mAb)。這些技術(shù)包括,但不限于雜交瘤技術(shù)(Kohler和 Milstein, Nature256:495-497,1975;和美國(guó)專(zhuān)利 US4, 376,110)、人 B 細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor 等,Immunology Today4:72,1983 ;Cole 等,Proc.Nat,I Acad.Sc1.USA80:2026-2030,1983)和 EBV 雜交瘤技術(shù)(Cole 等,Monoclonal Antibodies and CancerTherapy, Alan R.Liss, Inc.,pp.77-96,1985)。這類(lèi)抗體可以屬于任何免疫球蛋白類(lèi)型,包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其任何的亞類(lèi)。可以在體外或體內(nèi)培養(yǎng)產(chǎn)生本發(fā)明mAb的雜交瘤。在體內(nèi)產(chǎn)生高滴度的mAbs使得它成為目前優(yōu)選的生產(chǎn)方法。
[0258]此外,可以使用為通過(guò)剪接來(lái)自具有適當(dāng)抗原特異性的小鼠抗體分子的基因與來(lái)自具有適當(dāng)生物學(xué)活性的人抗體分子的基因生產(chǎn)〃嵌合抗體〃研發(fā)的技術(shù)(Morrison等,Proc.Nat’ 1.Acad.Sc1.USA81:6851-6855,1984 ;Neuberger 等,Nature312:604-608,1984 ;Takeda等,Nature314:452-454,1985)。嵌合抗體為如下分子,其中不同的部分衍生自不同的動(dòng)物種類(lèi),諸如具有衍生自鼠mAb的可變區(qū)或高變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的那些。類(lèi)似地,還可以使用可利用技術(shù)生產(chǎn)人源化抗體。
[0259]可選擇地,為生產(chǎn) 單鏈抗體描述的技術(shù)(美國(guó)專(zhuān)利US4,946,778 ;Bird,Science242:423-426,1988 ;Huston 等,Proc.Nat’ I Acad.Sc1.USA85:5879-5883,1988 ;和Ward等,Nature334:544-546,1989)可以適合于生產(chǎn)差異表達(dá)的基因-單鏈抗體。單鏈抗體如下形成,即經(jīng)氨基酸橋連接Fv區(qū)的重鏈和輕鏈片段,從而產(chǎn)生單鏈多肽。
[0260]在一個(gè)方面中,可用于生產(chǎn)〃人源化抗體〃的技術(shù)可以適合于生產(chǎn)針對(duì)蛋白質(zhì)、其片段或衍生物的抗體。這類(lèi)技術(shù)披露在美國(guó)專(zhuān)利US5, 932,448 ;5,693,762 ;5,693,761 ;5,585,089 ;5,530,101 ;5,569,825 ;5,625,126 ;5,633,425 ;5,789,650 ;5,661,016 ;和5,770,429 中。
[0261]可以通過(guò)公知技術(shù)產(chǎn)生識(shí)別特定表位的抗體片段。例如,這類(lèi)片段包括,但不限于可以通過(guò)對(duì)抗體分子進(jìn)行胃蛋白酶消化產(chǎn)生的F(ab’)2片段和可以通過(guò)還原F(ab’)2片段的二硫鍵產(chǎn)生的Fab片段??蛇x擇地,可以構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)(Huse等,Science246:1275-1281,1989)以便能夠快速和便利地鑒定具有所需特異性的單克隆Fab片段。
[0262]使用上述抗體檢測(cè)和測(cè)定基因產(chǎn)物表達(dá)的方案為本領(lǐng)域眾所周知的。這類(lèi)方法包括,但不限于斑點(diǎn)印跡、Western印跡、競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性蛋白質(zhì)結(jié)合測(cè)定法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、免疫組織化學(xué)、熒光活化細(xì)胞分選(FACS)和其它常用且廣泛描述在科學(xué)和專(zhuān)利文獻(xiàn)中的方法以及許多商業(yè)上使用的方法。
[0263]易于檢測(cè)的一種方法為夾心式ELISA,其存在大量變化形式,所有這些均意圖包括在本發(fā)明內(nèi)。例如,在典型的正向測(cè)定法中,將未標(biāo)記的抗體固定在固相基質(zhì)上并且使測(cè)試樣品接觸所結(jié)合的分子并且孵育足以形成抗體-抗原二元復(fù)合物的時(shí)間。此時(shí),隨之加入使用能夠誘導(dǎo)可檢測(cè)信號(hào)的報(bào)道分子標(biāo)記的第二抗體并且孵育,使得時(shí)間足以形成抗體-抗原-標(biāo)記抗體的三元復(fù)合物。洗去任何未反應(yīng)的物質(zhì)并且通過(guò)觀察信號(hào)確定抗原的存在,或可以通過(guò)與包含已知量抗原的對(duì)照樣品進(jìn)行比較對(duì)抗原進(jìn)行定量。正向測(cè)定法的變化形式包括:同時(shí)測(cè)定法,其中同時(shí)將樣品和抗體加入到所結(jié)合的抗體;或反向測(cè)定法,其中首先合并標(biāo)記抗體和測(cè)試樣品,孵育并加至未標(biāo)記的表面結(jié)合抗體。這些技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的并且微小變化的可能性顯而易見(jiàn)。本文所用的"夾心式測(cè)定法"意圖包括基礎(chǔ)雙位點(diǎn)技術(shù)(basic two-site technique)的所有變化形式。就本發(fā)明的免疫測(cè)定法而言,唯一的限制性因素在于經(jīng)過(guò)標(biāo)記的抗體為對(duì)所關(guān)注的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)具有特異性的抗體。
[0264]在這種類(lèi)測(cè)定法中最常用的報(bào)道分子為酶、含熒光團(tuán)分子或含放射性核素分子。就酶的免疫測(cè)定法而言,通常通過(guò)戊二醛或高碘酸鹽使酶與第二抗體偶聯(lián)。然而,正如易于公認(rèn)的,存在本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的各種不同的連接技術(shù)。常用的酶包括辣根過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶、3 -半乳糖苷酶和堿性磷酸酶等。一般為通過(guò)相應(yīng)酶水解時(shí)產(chǎn)生可檢測(cè)顏色改變而選擇與特定酶一起使用的底物。例如,磷酸對(duì)硝基苯酯適用于堿性磷酸酶偶聯(lián)物;就過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物而言,常用1,2-苯二胺或甲苯胺。還可能使用熒光底物,其產(chǎn)生熒光產(chǎn)物,而非上述顯色底物。然后將包含合適底物的溶液加至所述的三元復(fù)合物。使底物與連接至第二抗體的酶反應(yīng),得到定性可視信號(hào),其通??梢赃M(jìn)一步通過(guò)分光光度法將其定量,以便評(píng)價(jià)存在于血清樣品中PLAB的量。
[0265]可選擇地,可以通過(guò)化學(xué)方式使熒光化合物,諸如熒光素和若丹明與抗體偶聯(lián)而不改變其結(jié)合能力。當(dāng)通過(guò)用特定波長(zhǎng)的光照射活化時(shí),熒光染料標(biāo)記的抗體吸收光能,誘導(dǎo)分子中的激發(fā)態(tài),隨后在較長(zhǎng)的特征性波長(zhǎng)處發(fā)射光。發(fā)射表現(xiàn)為可使用光學(xué)顯微鏡檢測(cè)到的可視特征性顏色。免疫熒光和EIA技術(shù)均為本領(lǐng)域中充分確立的并且為特別優(yōu)選用于本發(fā)明的方法。然而,也可以使用其它報(bào)道分子,諸如放射性同位素、化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光分子。如何改變規(guī)程以適合于所需的應(yīng)用對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
[0266]細(xì)朐挽救(cell rescue)復(fù)蘇和治療件給藥
[0267]本發(fā)明在一個(gè)方面中包括挽救在圖1和/或2的一種或多種內(nèi)源性基因或多肽的功能方面存在缺陷(由此賦予所關(guān)注的相關(guān)表型例如乳腺癌易感性、抗性等)的細(xì)胞。這可以單純通過(guò)將基因(或表達(dá)相關(guān)蛋白質(zhì)的異源性核酸),即具有所需等位基因的基因的新拷貝導(dǎo)入細(xì)胞來(lái)進(jìn)行。還可以實(shí)施其它方法,諸如同源重組以修復(fù)缺陷基因(例如通過(guò)嵌合成形術(shù)(chimeraplasty))。在任何情況下,例如,可以在本文所述的任何測(cè)定法中測(cè)量功能的挽救。實(shí)際上,該方法可以用作在體外對(duì)細(xì)胞篩選圖1和/或2任何基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)或活性的一般方法。因此,體外功能挽救可用于上述大量體外篩選方法的環(huán)境中。挽救的細(xì)胞可以包括培養(yǎng)物(包括來(lái)自患者的原代或繼代細(xì)胞培養(yǎng)物以及充分確立細(xì)胞的培養(yǎng)物)中的細(xì)胞。如果從患者中分離細(xì)胞,那么它具有確立哪種基因或產(chǎn)物在呈現(xiàn)相關(guān)表型的患者中存在缺陷的額外診斷功用。
[0268]在另一個(gè)方面中,細(xì)胞挽救在患者,例如人中發(fā)生,例如以便修補(bǔ)缺陷。因此,本發(fā)明的一個(gè)方面在于修補(bǔ)缺陷的基因療法。在這些應(yīng)用中,任選將本發(fā)明的核酸克隆入適當(dāng)?shù)幕虔煼ㄝd體(和/或單純作為裸核酸或脂質(zhì)體偶聯(lián)的核酸遞送),然后任選與適當(dāng)?shù)妮d體或遞送劑一起遞送。還可以直接遞送蛋白質(zhì),但一般優(yōu)選在需要穩(wěn)定表達(dá)的應(yīng)用中遞送核酸。類(lèi)似地,可以在治療上使用本文方法鑒定的任何缺陷的調(diào)控劑。[0269]例如,給藥組合物包含治療有效量的調(diào)控劑、基因療法載體或其它相關(guān)核素和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類(lèi)載體或賦形劑包括,但不限于鹽水、緩沖鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇、和/或其組合。制備適合于給藥方式的制劑。一般而言,局部應(yīng)用的基因療法載體的給藥方法為本領(lǐng)域眾所周知的并且可以應(yīng)用于給藥本發(fā)明的核酸。
[0270]任選在一種或多種適當(dāng)?shù)捏w外和/或體內(nèi)疾病動(dòng)物模型中測(cè)試包含本發(fā)明一種或多種調(diào)控劑或基因療法核酸的治療性組合物,以便按照本領(lǐng)域眾所周知的方法證實(shí)功效、組織代謝和估算劑量。特別地,最初可以根據(jù)制劑的活性、穩(wěn)定性或其它合適的度量來(lái)確定劑量。
[0271]給藥通過(guò)常用于將分子與細(xì)胞緊密接觸的任何途徑進(jìn)行??梢砸匀魏魏线m的方式,任選使用一種或多種藥學(xué)上可接受的載體給藥調(diào)控劑和/或編碼相關(guān)序列的核酸。對(duì)患者給藥本發(fā)明上下文中的這類(lèi)核酸的合適方法是可得到的,并且盡管可以將一種以上的途徑用于給藥特定的組合物,特定的途徑通常可以提供比另一種途徑更迅速和更有效的作用或反應(yīng)。
[0272]部分根據(jù)給藥的特定組合物以及用于給藥組合物的特定方法來(lái)確定藥學(xué)上可接受的載體。因此,存在極其多種本發(fā)明藥物組合物的合適制劑??梢酝ㄟ^(guò)許多途徑給藥組合物,包括,但不限于:口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、透皮、皮下、表面、舌下或直腸給藥。可通過(guò)脂質(zhì)體(例如,表面的)或通過(guò)裸DNA或病毒載體的表面遞送來(lái)給藥組合物。這類(lèi)給藥途徑和合適的制劑一般為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
[0273]還可以將單獨(dú)的組合物或與其它合適的成分聯(lián)用的組合物制成氣溶膠制劑(即它們可以〃霧化〃)以便通過(guò)吸入給藥。可以將氣溶膠制劑置于加壓可接受的推進(jìn)劑中,諸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。適合于諸如,例如通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)(在關(guān)節(jié)中)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)和皮下途徑進(jìn)行胃腸外給藥的制劑包括:可以包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和賦予該制劑與指定接受者血液等滲的溶質(zhì)的水性和非水性等滲無(wú)菌注射溶液;和可以包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑`、穩(wěn)定劑和防腐劑的水性和非水性無(wú)菌混懸液??梢詫b好的核酸的制劑在單劑或多劑密封容器中提供,諸如安瓿和小瓶。
[0274]在本發(fā)明的上下文中,對(duì)患者的給藥劑量足以隨著時(shí)間的過(guò)去對(duì)患者產(chǎn)生有益治療應(yīng)答。根據(jù)特定載體或其它制劑的功效,表達(dá)的多肽的活性、穩(wěn)定性或血清半衰期,和患者的狀況以及所治療患者的體重或表面積確定劑量。劑量的大小還根據(jù)伴隨患者中特定載體、制劑等給藥的任何不良副作用的存在、性質(zhì)和程度來(lái)確定。在確定在治療疾病時(shí)給藥的載體或制劑的有效量時(shí),醫(yī)師評(píng)價(jià)局部表達(dá)或循環(huán)血漿水平、制劑毒性、相關(guān)疾病的進(jìn)展和/或重要時(shí),針對(duì)多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)的抗體的產(chǎn)生。例如,對(duì)70千克的患者,給藥劑量范圍一般與目前使用的治療性蛋白質(zhì)的劑量相當(dāng),根據(jù)相關(guān)組合物改變的活性或血清半衰期進(jìn)行調(diào)整。本發(fā)明的載體可以通過(guò)任何公知的常規(guī)療法補(bǔ)充治療條件。
[0275]為了給藥,可以以根據(jù)相關(guān)制劑的LD-50和/或本發(fā)明載體在不同濃度下(例如應(yīng)用于大的(mass)或表面遞送區(qū)域)的任何副作用的觀察結(jié)果和患者的總體健康狀況確定的速率給藥本發(fā)明的制劑??梢酝ㄟ^(guò)單劑或分劑進(jìn)行給藥。
[0276]如果進(jìn)行治療的患者發(fā)生發(fā)熱、發(fā)冷或肌痛,那么他/她接受適當(dāng)劑量的阿司匹林、布洛芬、對(duì)乙酰氨基酚或其它疼痛/發(fā)熱控制藥。對(duì)組合物有反應(yīng),諸如發(fā)熱、肌痛和發(fā)冷的患者在輸注前30分鐘進(jìn)行前驅(qū)用藥,即阿司匹林、對(duì)乙酰氨基酚、或例如苯海拉明。哌替啶(meperidine)用于更嚴(yán)重的發(fā)冷和肌痛,這些癥狀對(duì)解熱藥和抗組織藥沒(méi)有快速響應(yīng)。治療根據(jù)反應(yīng)嚴(yán)重性的不同而減緩或中斷。
[0277]診斷和預(yù)后測(cè)定法
[0278]核酸、多肽、抗體和本文的其它組合物可以用作乳腺癌表型易感性或抗性的預(yù)后和診斷試劑(例如,在預(yù)包裝試劑盒中)??梢詫⑦@些方法對(duì)已知具有乳腺癌表型一種或多種癥狀的受試者實(shí)施作為其它疾病的差異診斷或預(yù)后組成部分。這些方法還可以對(duì)具有已知乳腺癌表型易感性的受試者實(shí)施。這類(lèi)個(gè)體的多態(tài)性特征譜可以升高或降低對(duì)易感性的評(píng)價(jià)。例如,已知,具有兩個(gè)乳腺癌同胞的個(gè)體比一般群體對(duì)疾病的易感性增加。發(fā)現(xiàn)有利于易感性的額外因素增加了風(fēng)險(xiǎn),而發(fā)現(xiàn)有利于抗性的因素降低了這種風(fēng)險(xiǎn)。
[0279]本發(fā)明提供了測(cè)定個(gè)體在本發(fā)明一種或多種SNP處的多態(tài)性特征譜的方法。SNP包括圖1和2中所示的那些和與之連鎖不平衡的那些。與之連鎖不平衡的那些通常發(fā)生在相同基因中或相同基因的100或50或20kb內(nèi)。可以通過(guò)單倍型作圖確定與本文圖中SNP連鎖不平衡的SNP??梢酝ㄟ^(guò)融合來(lái)自不同種類(lèi)的二倍體細(xì)胞測(cè)定單倍型。所得細(xì)胞為部分單倍體,從而能夠確定單倍體染色體上的單倍型(例如,參見(jiàn)US20030099964)。可選擇地,可以通過(guò)與下文實(shí)施例中所述類(lèi)似的結(jié)合研究確定與例示SNP連鎖不平衡的SNP。
[0280]多態(tài)性特征譜由占據(jù)個(gè)體各種多態(tài)性位點(diǎn)上的多態(tài)形式構(gòu)成。在二倍體基因組中,兩種多態(tài)形式,彼此相同的或不同的,通常占據(jù)每個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。如此,在位點(diǎn)X和Y處的多態(tài)性特征譜可以表示為X(xl,xl)和Y(yl,y2)形式,其中xl、xl表示占據(jù)位點(diǎn)X的等位基因xl的兩個(gè)拷貝,而yl、y2表不占據(jù)位點(diǎn)Y的雜合等位基因。
[0281]可以通過(guò)與占據(jù)本文圖中所示每一位點(diǎn)處的、與乳腺癌表型抗性或易感性相關(guān)的多態(tài)形式比較對(duì)個(gè)體的多態(tài)性特征譜評(píng)分??梢詫?duì)至少例如,1、2、5、10、25、50或全部多態(tài)位點(diǎn)和任選與之連鎖不平衡的其它位點(diǎn)進(jìn)行比較??梢耘c其它多態(tài)位點(diǎn)組合分析多態(tài)位點(diǎn)。然而,通常分析的多態(tài)位點(diǎn)總數(shù)少于10,000、1000、100、50或25個(gè)并且可以為約10個(gè)或以下、約5個(gè)或以下、或約2個(gè)或以下。
[0282]可以以疊加的方式合并存在于特定個(gè)體中的抗性或易感性等位基因的數(shù)量或形成比例以便提供有關(guān)個(gè)體對(duì)乳腺癌表型遺傳傾向的總體評(píng)價(jià)(參見(jiàn)USSN60,566,302,2004年 4 月 28 日提交;USSN60/590, 534,2004 年 7 月 22 日提交;USSN10/956, 224,2004 年 9 月30日提交;和PCT US05/07375,2005年3月3日提交)??梢匀我鈱⒖剐缘任换蚋髯栽u(píng)分為+1并且將易感性等位基因評(píng)分為-1 (或反之亦然)。例如,如果將個(gè)體對(duì)本發(fā)明的100個(gè)多態(tài)位點(diǎn)分型并且在其所有位點(diǎn)上的抗性而言為純合的,那么可以將他指定為對(duì)乳腺癌表型的抗性的 遺傳傾向得分為100%或?qū)θ橄侔┍硇偷囊赘行缘膬A向?yàn)?%。如果個(gè)體對(duì)所有易感性等位基因而言為純合的,則為相反的結(jié)果。更典型的是,個(gè)體對(duì)某些基因座上的抗性等位基因而言為純合的,對(duì)某些基因座上的易感性等位基因而言為純合的,并且對(duì)其它基因座上的抗性/易感性等位基因而言為雜合的。可以通過(guò)將所有抗性等位基因的評(píng)分指定為+1,并且將所有易感性等位基因的評(píng)分指定為-1 (或反之亦然),并且合并評(píng)分,對(duì)這類(lèi)個(gè)體的乳腺癌表型遺傳傾向進(jìn)行評(píng)分。例如,如果個(gè)體具有102個(gè)抗性等位基因和204個(gè)易感性等位基因,那么可以將該個(gè)體評(píng)分為具有33%的抗性遺傳傾向和67%的易感性遺傳傾向??蛇x擇地,可以將純合抗性等位基因的評(píng)分指定為+1,將雜合等位基因的評(píng)分指定為0,并且將純合易感性等位基因的評(píng)分指定為-1。還可以將抗性等位基因和易感性等位基因的相對(duì)數(shù)目表示為百分比。如此,對(duì)30個(gè)多態(tài)位點(diǎn)處的抗性等位基因而言為純合的、對(duì)60個(gè)多態(tài)位點(diǎn)處的易感性等位基因而言為純合的、且剩余63個(gè)多態(tài)位點(diǎn)處為雜合的個(gè)體指定為33%的抗性遺傳傾向。作為另一種可替代選擇,可以將易感性純合性評(píng)分為+2,雜合性評(píng)分為+1,而抗性純合性評(píng)分為O。
[0283]個(gè)體評(píng)分和多態(tài)性特征譜性質(zhì)可用于個(gè)體對(duì)乳腺癌表型易感性的預(yù)后或診斷。任選可以告知患者通過(guò)遺傳特征譜表示的乳腺癌表型易感性??梢詫?duì)乳腺癌表型的高遺傳傾向的存在作為警告來(lái)對(duì)待,以開(kāi)始預(yù)防性或治療性處理。例如,可以不同地監(jiān)測(cè)具有發(fā)生乳腺癌表型的風(fēng)險(xiǎn)升高的個(gè)體(例如,更頻繁的乳房照相術(shù))或可以預(yù)防性處理(例如,使用一種或多種藥物)。對(duì)乳腺癌表型的高度傾向的存在還指示進(jìn)行第二測(cè)試,諸如活檢的有益性。
[0284]例如,多態(tài)性特征制譜可用于選擇在指定個(gè)體中實(shí)現(xiàn)乳腺癌表型治療或預(yù)防的藥劑劑。具有類(lèi)似多態(tài)性特征譜的個(gè)體有可能以類(lèi)似的方式響應(yīng)藥劑。
[0285]多態(tài)性特征制譜還可用于對(duì)測(cè)試藥劑在治療乳腺癌表型或相關(guān)疾患方面的能力的臨床試驗(yàn)中的個(gè)體進(jìn)行分層。這類(lèi)試驗(yàn)對(duì)具有類(lèi)似或相同多態(tài)性特征譜的治療或?qū)φ杖后w進(jìn)行(參見(jiàn)EP99965095.5),例如,所述多態(tài)性特征譜指示個(gè)體具有發(fā)生乳腺癌表型的風(fēng)險(xiǎn)增加。遺傳匹配的群體的應(yīng)用消除或減少了因遺傳因素導(dǎo)致的治療效果的變異,從而導(dǎo)致對(duì)潛在藥物功效的評(píng)價(jià)更為準(zhǔn)確。計(jì)算機(jī)執(zhí)行的算法可以用于鑒定遺傳上更同質(zhì)的亞群,其中治療或預(yù)防具有顯著作用,不過(guò),治療或預(yù)防在更異質(zhì)的更大群體中無(wú)效。在這類(lèi)方法中,對(duì)具有乳腺癌表型的、用藥劑治療的第一群體和也具有乳腺癌表型、但用安慰劑治療的第二群體提供了數(shù)據(jù)。測(cè)定在選自圖1和/或2中所示基因中的至少一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)或IOOkb或50kb或20kb內(nèi)兩個(gè)群體中個(gè)體的多態(tài)性特征譜。還提供了群體中每位患者是否達(dá)到表示成功治療或預(yù)防的所需終點(diǎn)的數(shù)據(jù)。然后選擇第一和第二群體中的亞群,使得亞群中的個(gè)體彼此具有大于原 始第一和第二群體中個(gè)體的多態(tài)性特征譜相似性。存在可以評(píng)價(jià)相似性的許多標(biāo)準(zhǔn)。例如,一項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)在于要求亞群中的個(gè)體在上述基因的至少10個(gè)上各自具有至少一個(gè)易感性等位基因。另一項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)在于亞群中個(gè)體對(duì)測(cè)定了多態(tài)性特征譜的各多態(tài)位點(diǎn)而言具有至少75%的易感性等位基因。與用于評(píng)價(jià)相似性的標(biāo)準(zhǔn)無(wú)關(guān),比較亞群的終點(diǎn)數(shù)據(jù)以便確定治療或預(yù)防是否在亞群中實(shí)現(xiàn)了統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的結(jié)果。作為計(jì)算機(jī)執(zhí)行的結(jié)果,可以分析億萬(wàn)相似性標(biāo)準(zhǔn)以便鑒定表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的一個(gè)或幾個(gè)亞群。
[0286]多態(tài)性特征制譜還可用于從臨床試驗(yàn)中排除無(wú)乳腺癌表型惡病質(zhì)的個(gè)體。在試驗(yàn)中包括這類(lèi)個(gè)體增加了獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著效果所需的群體的大小??梢酝ㄟ^(guò)如上所述測(cè)定多態(tài)性特征譜中抗性和易感性等位基因的數(shù)目鑒定無(wú)乳腺癌表型惡病質(zhì)的個(gè)體。例如,如果受試者在與乳腺癌表型相關(guān)的本發(fā)明10個(gè)基因的10個(gè)位點(diǎn)上基因分型,那么總計(jì)測(cè)定了20個(gè)等位基因。如果其中超過(guò)50%且優(yōu)選超過(guò)60%或75%為抗性基因,那么該個(gè)體不太可能發(fā)生乳腺癌表型并且可以將他/她從試驗(yàn)中排除。
[0287]在其它實(shí)施方案中,可以使用多態(tài)性特征制譜與其它分層方法的組合進(jìn)行臨床試驗(yàn)中個(gè)體的分層,所述的其它分層方法包括,但不限于家族史、風(fēng)險(xiǎn)模型(例如,Gail得分、Claus模型)、臨床表型(例如,非典型損害和乳腺密度)和特定候選生物標(biāo)志物(例如,IGFU IFG2、IGFBP3、Ki_67和雌二醇)。例如,在包括基于多態(tài)性特征譜的分層的化學(xué)預(yù)防試驗(yàn)中較高風(fēng)險(xiǎn)度的分層可以改善結(jié)果。特別地,與FGFR2連鎖的標(biāo)志物可以用于對(duì)抗VEGF或抗血管發(fā)生療法應(yīng)答的分層,并且與PKHDl連鎖的標(biāo)志物可以用于對(duì)抗EGF療法功效(抗EGF療法在具有多囊腎和肝病的患者中有活性)的分層。
[0288]還可以在完成臨床試驗(yàn)后使用多態(tài)性特征譜來(lái)闡明對(duì)指定治療的響應(yīng)差異。例如,多態(tài)性組可以用于將登記患者分層為疾病亞型或類(lèi)型。還有可能使用多態(tài)性鑒定具有類(lèi)似多態(tài)性特征譜的患者亞組,他們對(duì)治療具有不常見(jiàn)的(高或低)的響應(yīng)或根本無(wú)響應(yīng)(不響應(yīng)者)。在這種方式中,有關(guān)影響對(duì)治療的響應(yīng)的潛在遺傳因素的信息可以用于研發(fā)治療的許多方面(它們從新靶標(biāo)的鑒定到經(jīng)新試驗(yàn)的設(shè)計(jì)到產(chǎn)物標(biāo)記和患者靶向)。另外,多態(tài)性可以用于鑒定牽涉對(duì)治療的不良響應(yīng)(不良事件)的遺傳因素。例如,表現(xiàn)出不良響應(yīng)的患者可能具有比預(yù)計(jì)為偶然的更類(lèi)似的多態(tài)性特征譜。這容許早期鑒定并且從治療中排除這類(lèi)個(gè)體。還提供了可以用于理解不良事件的生物學(xué)原因和改進(jìn)治療以避免這類(lèi)后果的信息。
[0289]多態(tài)性特征譜還可以用于其它目的,包括如US6,525,185中所述的親子鑒定和法醫(yī)分析。在法醫(yī)分析 中,將來(lái)自犯罪現(xiàn)場(chǎng)的樣品的多態(tài)性特征譜與嫌疑人的進(jìn)行比對(duì)。兩者之間的匹配是嫌疑人實(shí)際犯罪的證據(jù),而缺乏匹配就可排除嫌疑人。提出的多態(tài)位點(diǎn)可以用于這類(lèi)方法,正如用于人類(lèi)基因組中的其它多態(tài)位點(diǎn)一樣。
實(shí)施例
[0290]提供下列實(shí)施例是為了例證,并非限制請(qǐng)求保護(hù)的發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)出各種可以在本發(fā)明范圍內(nèi)改變的非關(guān)鍵性參數(shù)。
[0291]實(shí)施例1:鑒定乳腺癌標(biāo)志物的策略
[0292]前言:鑒定常見(jiàn)的遺傳變體
[0293]在鑒定乳腺癌標(biāo)志物等位基因中存在公眾健康的重要應(yīng)用。如果遺傳變異是因許多基因座所致,那么個(gè)體的風(fēng)險(xiǎn)度就會(huì)廣泛變化,這取決于在易感性基因座上遺傳得到的高危等位基因的數(shù)目。我們基于Antoniou等13的模型的分析提示在群體的前、后20%之間可能存在多達(dá)40倍的風(fēng)險(xiǎn)度差異。在相同的模型中,所有乳腺癌中的半數(shù)發(fā)生在12%的最高風(fēng)險(xiǎn)度女性中,并且這些女性在到70歲時(shí)有8位中至少I(mǎi)位的風(fēng)險(xiǎn)度。相反,在50%的最低風(fēng)險(xiǎn)度女性中僅有12%的癌癥,并且個(gè)體風(fēng)險(xiǎn)度低于30位中I位14。鑒定為與乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的基因可以用于評(píng)估相關(guān)的和個(gè)別的風(fēng)險(xiǎn)度。這種風(fēng)險(xiǎn)度評(píng)估的實(shí)際結(jié)果是重要的。
[0294]賦予中度風(fēng)險(xiǎn)的常見(jiàn)遺傳變體在群體水平上各自具有重要的作用。例如,個(gè)體風(fēng)險(xiǎn)度僅增加1.5倍的、具有20%頻率的常見(jiàn)變體占負(fù)載癌癥的群體的15%。與在心血管疾病中血壓或膽固醇中度升高具有相似性。如果該變體指示切實(shí)可行的干預(yù)機(jī)制,那么這也為靶向干預(yù)提供了新的可能性。
[0295]在這些實(shí)際結(jié)果外,癌癥易感性基因的鑒定有助于澄清致癌機(jī)理(正如已經(jīng)發(fā)生的例如BRCAl和BRCA2)。超越已知候選物擴(kuò)展至整個(gè)基因組檢索具有全新機(jī)制出現(xiàn)的巨大優(yōu)點(diǎn)。這些機(jī)制還提供了新的治療靶。
[0296]最終,易感性基因的知識(shí)能夠使我們通過(guò)使用例如EPIC分組調(diào)查法(cohort)研究基因與這些危險(xiǎn)因素的組合的作用來(lái)澄清生活方式危險(xiǎn)因素。
[0297]乳腺癌[0298]盡管對(duì)許多癌癥中的相關(guān)性研究可能存在爭(zhēng)論,但是存在幾個(gè)為何特別適合于在乳腺癌中進(jìn)行研究的原因。它是女性中最常見(jiàn)的癌癥并且其病因?qū)W仍然了解甚少。對(duì)該病遺傳基礎(chǔ)比對(duì)任何其它常見(jiàn)的癌癥研究得更充分。作為結(jié)果,有利于多基因基礎(chǔ)的證據(jù)比對(duì)其它癌癥更清楚。長(zhǎng)期研究組合了足夠大系列的病例以便可靠地鑒定易感性基因座。此外,具有明顯家族史的病例可通過(guò)癌遺傳學(xué)臨床獲得,并且可以在相關(guān)性研究的有效性中提供顯著收獲(參見(jiàn)“Research Proposal") o最終,存在可以對(duì)發(fā)現(xiàn)處于風(fēng)險(xiǎn)度增加的女性提供的干預(yù)。例如,預(yù)防性卵巢切除術(shù)可以明顯降低隨后乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)度15。近期研究提示通過(guò)MRI的篩選可以提供遠(yuǎn)高于乳房X線攝影術(shù)的靈敏度,但成本明顯較高16。
[0299]研究設(shè)計(jì)
[0300]對(duì)一組400個(gè)家族性乳腺癌病例和來(lái)自EPIC組的400個(gè)對(duì)照測(cè)定200,000個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)的基因型;這些SNP中顯示最強(qiáng)相關(guān)性的5%在基于額外群體的4,600個(gè)病例和4,600個(gè)對(duì)照系列中進(jìn)行分析。在額外的大量病例-對(duì)照系列中證實(shí)了這一階段的正相關(guān)性。
[0301]在乳腺癌終點(diǎn)外,許多定量表型可以在對(duì)照組中獲得并且提供遺傳分析的額外數(shù)據(jù)。它們包括與癌癥風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的表型(例如乳房照相圖式、激素水平)。
[0302]收率
[0303]掃描評(píng)價(jià)了重復(fù)序列外全基因組間10%或10%以上頻率(且某些在5-10%的范圍)的單核苷酸多態(tài)性。它在占乳腺癌總體遺傳成分中2%或2%以上的這些區(qū)中具有約80%檢測(cè)任何常見(jiàn)變體的可信度(power)。
[0304]用于尋找常見(jiàn)易感性變體的研究設(shè)計(jì)
[0305]鑒定常見(jiàn)低風(fēng)險(xiǎn)`度等位基因的有效設(shè)計(jì)為病例/對(duì)照研究。與易感性相關(guān)的變體通過(guò)其在癌癥病例中明顯高于為遺傳背景匹配的對(duì)照中的出現(xiàn)頻率來(lái)鑒定。在本研究中,變體為單核苷酸多態(tài)性(SNP)。最常見(jiàn)的是,并不了解可能與疾病易感性相關(guān)的活性或功能性變體,且由此研究依賴(lài)于可以報(bào)告推定的(但未知的)活性變體的一組“標(biāo)簽” SNP。
[0306]病例-對(duì)照相關(guān)性研究方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基于“候選基因”的乳腺癌。先前已經(jīng)以這種方式研究了接近100個(gè)基因的編碼區(qū)和內(nèi)含子中的多態(tài)性。這些基因包括,例如,涉及性類(lèi)固醇激素代謝、細(xì)胞周期控制和DNA修復(fù)的基因。盡管已經(jīng)對(duì)常見(jiàn)變體提示了某些相關(guān)性,但是無(wú)一得到最終確立。迄今為止的結(jié)果提示乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)中的大部分變異并非因可以作為乳腺癌候選物第一選擇的基因的基因內(nèi)DNA中的變體所致。此外,對(duì)候選基因方法存在嚴(yán)重限制。它緩慢并且相對(duì)昂貴,依賴(lài)于基于SNPXSNP的、對(duì)測(cè)試的每一基因開(kāi)發(fā)的測(cè)定法;它甚至對(duì)候選基因的覆蓋不完全,特別是在大部分情況中忽略了潛在的調(diào)控變異;并且它限于對(duì)疾病生物學(xué)目前的知識(shí)。作為對(duì)比,全基因組搜索具有在沒(méi)有任何現(xiàn)有功能或位置知識(shí)的情況下鑒定活性常見(jiàn)變體的潛能。
[0307]某閔纟目掃描SNP
[0308]對(duì)基因組掃描的要求在于確定在報(bào)告基因組間所有其它SNP組時(shí)提供完整性與成本之間最佳折衷的一組SNP。Perlegen Sciences (www.perlegen.com)已經(jīng)通過(guò)對(duì)在人/嚙齒類(lèi)動(dòng)物體細(xì)胞雜合物中分離的20-50個(gè)單倍體基因組中的人基因組的非重復(fù)序列進(jìn)行再測(cè)序鑒定了 110萬(wàn)個(gè)常用SNP標(biāo)志物(密度為每2kb有I個(gè)SNP)。這種SNP搜索基于與在Patil等17報(bào)導(dǎo)的第21條染色體研究中報(bào)導(dǎo)的類(lèi)似的策略。他們由此使用動(dòng)態(tài)編程算法18確定了一組200,000個(gè)標(biāo)簽SNP,它們明確地報(bào)告了超過(guò)80%的由完整組110萬(wàn)個(gè)SNP確定的常見(jiàn)單倍型。在本實(shí)施例中使用的就是該組的200,000個(gè)標(biāo)簽SNP。
[0309]SNP在Affymetrix研發(fā)的高密度寡核苷酸陣列上分型,這些陣列已經(jīng)在常規(guī)應(yīng)用中得到了廣泛驗(yàn)證。簡(jiǎn)言之,陣列設(shè)計(jì)使用80個(gè)特征(25聚物寡核苷酸)以查詢(xún)每一 SNP。80個(gè)特征包含10個(gè)交疊特征組,其中每個(gè)特征組包括對(duì)參比等位基因特異的4個(gè)特征(I個(gè)完全匹配和3個(gè)錯(cuò)配特征)和針對(duì)可選(alternative)等位基因的4個(gè)類(lèi)似特征。通過(guò)比較參比等位基因的完全匹配特征的熒光強(qiáng)度與為可選等位基因的完全匹配的那些,可以區(qū)分三種可能的SNP基因型(常見(jiàn)的純合子、雜合子和罕見(jiàn)純合子)。為了進(jìn)行基因分型測(cè)定,使用多重(78路)短程PCR特異性擴(kuò)增樣品基因組包含所關(guān)注SNP的區(qū)。合并來(lái)自每一個(gè)體的PCR產(chǎn)物并且用生物素標(biāo)記以便生成靶DNA。使靶DNA與SNP分型高密度寡核苷酸陣列雜交。在過(guò)夜雜交后,洗滌陣列,染色并且掃描熒光強(qiáng)度。
[0310]在本實(shí)施例中,將用于對(duì)200,000個(gè)SNP進(jìn)行基因分型的特征排列在一系列6個(gè)高密度陣列上,要求具有約30,000個(gè)SNP的復(fù)雜性的靶DNA用于雜交。這一復(fù)雜性的靶物產(chǎn)生97.3%的呼叫率(call rate)。高密度陣列基因分型技術(shù)與其它技術(shù)(實(shí)時(shí)PCR和熒光極化)的比較顯示了在大約20,000個(gè)基因分型中99%以上的一致索引(concordance),有多至20個(gè)不同的SNP。這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)在使用來(lái)自多個(gè)合作臨床和研究實(shí)驗(yàn)室的DNA時(shí)證實(shí)為確實(shí)的,并且在使用基因組擴(kuò)增的DNA時(shí)良好地起作用。
[0311]在本研究中使用的200,000個(gè)標(biāo)簽SNP的特性在于其“報(bào)告”基因組內(nèi)所有其它SNP變體的能力。就指定的可信度(power)而言,所需的樣本大小與1/r2成正比,其中r為所尋找的功能性變體與最緊密連鎖的標(biāo)簽SNP之間的連鎖不平衡系數(shù)19。
[0312]根據(jù)經(jīng)驗(yàn)通過(guò)對(duì)在28個(gè)無(wú)關(guān)個(gè)體(56條染色體)中基因組DNA的4Mb區(qū)內(nèi)均勻間距的1608個(gè)SNP基因分型測(cè)定非標(biāo)簽SNP與其相應(yīng)標(biāo)簽SNP之間的r2分布:參見(jiàn)表1。對(duì)所有988個(gè)測(cè)試SNP而言(每個(gè)的最低等位基因頻率>10%),平均r2為67%,69%的SNP具有大于0.5的r2。
[0313]復(fù)I
[0314]表1:在不同于用于SNP發(fā)現(xiàn)的那些的28個(gè)個(gè)體的第21條染色體4Mb區(qū)段中測(cè)定的417個(gè)選擇的“標(biāo)簽” SNP與988個(gè)“測(cè)試” SNP之間的r2值分布。整組SNP的15%具有最低等位基因頻率1-10% ;85%具有大于10%的頻率,在10-50%之間均勻分布。所有測(cè)試SNP具有最低等位基因頻率>10%。417個(gè)的標(biāo)簽SNP組的平均間距為每10kb有1個(gè),與用于基因組掃描的200,000個(gè)的SNP組類(lèi)似。
[0315]表1
【權(quán)利要求】
1.用于鑒定SNPID843029處多態(tài)性的探針或引物在制造用于對(duì)人鑒定乳腺癌表型形成風(fēng)險(xiǎn)的組合物或系統(tǒng)中的用途,其中所述的鑒定包括: 檢測(cè)來(lái)自所述人的生物學(xué)樣品中的多態(tài)性或與之緊密連鎖的基因座,所述的多態(tài)性為SNP ID843029,其中所述的多態(tài)性與乳腺癌表型相關(guān);并且 將所述的多態(tài)性或基因座與所述的表型形成風(fēng)險(xiǎn)建立相關(guān)性。
2.權(quán)利要求1所述的用途,其中所述的檢測(cè)包括擴(kuò)增多態(tài)性或連鎖基因座,并且檢測(cè)所得擴(kuò)增子。
3.權(quán)利要求2所述的用途,其中所述的擴(kuò)增包括: i) a)混合擴(kuò)增引物或擴(kuò)增引物對(duì)與分離自所述人的核酸模板,其中所述的引物或引物對(duì)與鄰近或包含所述的多態(tài)性或連鎖基因座的區(qū)互補(bǔ)或部分互補(bǔ),并且能夠在所述核酸模板上由聚合酶啟動(dòng)核酸聚合;和 b)使引物或引物對(duì)在包括聚合酶和模板核酸的DNA聚合反應(yīng)中延伸以便生成擴(kuò)增子;或 ?)進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)或連接酶鏈反應(yīng)(LCR),其中使用所述的核酸作為PCR、RT-PCR或LCR中的模板。
4.權(quán)利要求2或3所述的用途,其中通過(guò)包括如下一個(gè)或多個(gè)步驟的方法檢測(cè)所述的擴(kuò)增子:使該擴(kuò)增子與陣列雜交;用限制酶消化該擴(kuò)增子;或?qū)崟r(shí)PCR分析。
5.權(quán)利要求2或3所述的用途,包括對(duì)所述的擴(kuò)增子進(jìn)行部分或完全測(cè)序。
6.權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的用途,其中所述的鑒定進(jìn)一步包括:` ⑴檢測(cè)在FGFR2、A2BP1、TNRC9、H19和FSTL5每種中的至少一個(gè)多態(tài)性;或 (ii)檢測(cè)SNP ID2312116、SNP ID1622530、SNP ID3712013、和 SNP ID1509710 每種的至少一個(gè)多態(tài)性;或 (iii)檢測(cè)如下每種的至少一個(gè)多態(tài)性:SNPID2312116、SNP ID1622530、SNP ID3712013、 SNP ID1509710、 SNP ID1990126、 SNP ID604819、 SNP ID3025734、SNP ID1152499、 SNP ID4415909、 SNP ID1732681、 SNP ID4281579、 SNP ID4454457、SNP ID2616199、 SNP ID1720694, SNP ID4077723, SNP ID3711990、 SNP ID3337858、SNP ID4093095、 SNP ID4213825、 SNP ID3488617、 SNP ID3610210、 SNP ID3451239、SNP ID1582533、SNP ID3488150、SNP ID2770052、SNP ID4141351、SNP ID1335030、SNPID2211665、和 SNP ID4538418 ;或如下每種中的至少一個(gè)多態(tài)性:FGFR2、A2BP1、TNRC9、H19、FSTL5、LSPU L0C388927、UNQ9391、HCNU L0C441192、TNRC9、NR3C2、KIAA0826、FLJ31033、AACS, FRMD4A 和 SEC31L2。
7.權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的用途,其中所述的連鎖基因座為距離所述多態(tài)性約5cM或5cM以下的緊密連鎖基因座。
8.權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的用途,其中將所述多態(tài)性或連鎖基因座與所述乳腺癌表型形成風(fēng)險(xiǎn)建立相關(guān)性包括參閱查閱表,該查閱表包含所述多態(tài)性或連鎖基因座的等位基因與所述乳腺癌表型形成風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性的信息。
9.用于鑒定SNPID1990126處多態(tài)性的探針或引物在制造用于對(duì)人鑒定乳腺癌表型形成風(fēng)險(xiǎn)的組合物或系統(tǒng)中的用途,其中所述的鑒定包括: 檢測(cè)來(lái)自所述人的生物學(xué)樣品中的多態(tài)性或與之緊密連鎖的基因座,所述的多態(tài)性為SNP ID1990126,其中所述的多態(tài)性與乳腺癌表型相關(guān);并且 將所述的多態(tài)性或基因座與所述的表型形成風(fēng)險(xiǎn)建立相關(guān)性。
10.用于鑒定SNP ID1152499處多態(tài)性的探針或引物在制造用于對(duì)人鑒定乳腺癌表型形成風(fēng)險(xiǎn)的組合物或系統(tǒng)中的用途,其中所述的鑒定包括: 檢測(cè)來(lái)自所述人的生物學(xué)樣品中的多態(tài)性或與之緊密連鎖的基因座,所述的多態(tài)性為SNP ID1152499,其中所述的多態(tài)性與乳腺癌表型相關(guān);并且 將所述的多態(tài)性或基因 座與所述的表型形成風(fēng)險(xiǎn)建立相關(guān)性。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103710428SQ201310524765
【公開(kāi)日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2006年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2005年11月29日
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