乳腺癌相關(guān)基因的捕獲及其探針的制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種乳腺癌相關(guān)基因的捕獲方法，其以依據(jù)乳腺癌相關(guān)基因捕獲探針文庫的構(gòu)建方法獲得探針對待測樣本中含有待捕獲的靶標(biāo)基因組區(qū)域DNA模板雜交。捕獲得到的片段經(jīng)高通量測序后，再基于乳腺癌致病基因的已知信息，利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，從而獲得待測樣本中核酸序列的遺傳變異情況。本發(fā)明提供的各種方法及其獲得文庫（或克隆庫），因可以調(diào)整相對捕獲效率從而確保了在所有靶標(biāo)基因上的一致性捕獲，解決了目前文獻(xiàn)報道的芯片捕獲中的不均一性和高成本而極大阻礙了NGS測序平臺的使用效率。
【專利說明】乳腺癌相關(guān)基因的捕獲及其探針的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于檢測與癌癥相關(guān)的核苷酸組合物，具體涉及一種基于捕獲探針集(特異雜交靶基因片段)制備的方法而實現(xiàn)從生物樣品中選擇性捕獲和擴增特定的外顯子或靶標(biāo)基因組區(qū)域。
【背景技術(shù)】 [0002]乳腺癌是乳腺上皮細(xì)胞在多種致癌因子作用下，發(fā)生了基因突變，致使細(xì)胞增生失控之后發(fā)生的。據(jù)統(tǒng)計，美國2010年確診的乳腺癌新發(fā)病例有209060例，死于乳腺癌的患者有40230例。
[0003]據(jù)統(tǒng)計，近年來，在乳腺癌發(fā)病率持續(xù)上升的同時，歐美等發(fā)達(dá)國家的乳腺癌死亡率卻呈下降趨勢。廣泛開展的乳腺癌普查與不斷提高的早期發(fā)現(xiàn)率被認(rèn)為是其死亡率下降的主要原因。近十幾年來我國乳腺癌發(fā)病率逐年上升，乳腺癌已居女性惡性腫瘤的首位，是僅次于肺癌的第二位癌癥死亡原因，而且發(fā)病年齡趨于年輕，已嚴(yán)重威脅我國婦女的健康。在美國，新發(fā)乳腺癌病例中80%以上是早期。而在我國超過半數(shù)的患者在發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)是晚期。乳腺的原位癌是幾乎可以100%治愈的，I期乳腺癌5生存率是97%.1I期乳腺癌是75.9%，III期僅為45%。顯而易見，乳腺癌的早期診斷是提高乳腺癌患者生存率和生存質(zhì)量、提高乳腺癌治愈率、降低死亡率的關(guān)鍵，基于此共識已經(jīng)吸引了眾多學(xué)者將研究熱點投向乳腺癌的早期診斷。目前，隨著轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，不少以基因檢測技術(shù)為主的研究項目已取得了標(biāo)志性的階段成果，使得該技術(shù)越來越受關(guān)注。
[0004]傳統(tǒng)的乳腺癌檢測方法主要包括:X線診斷、超聲顯像檢查、細(xì)胞學(xué)及組織學(xué)診斷等，這些方法雖然在乳腺癌的常規(guī)檢測中起了重要作用，但大都不適用于在真正意義上對乳腺癌進(jìn)行準(zhǔn)確地早期診斷。隨著分子生物學(xué)及免疫學(xué)研究的進(jìn)展，乳腺癌的研究由細(xì)胞水平進(jìn)入分子水平研究領(lǐng)域，生物診斷技術(shù)成為一種很有發(fā)展的檢測和治療手段，特別是近年來人類基因組研究取得的豐碩成果進(jìn)一步推動了生物診斷技術(shù)的發(fā)展，分子診斷已逐步成為乳腺癌診斷的一個重要內(nèi)容(US5，747，282、US5，693，473和US5，837，492)。
[0005]目前常用的基因檢測方法有免疫組織化學(xué)(IHC)、熒光原位雜交(FISH)、熒光定量PCR及酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)等，這些方法主要基于對癌癥發(fā)生導(dǎo)致的異常，如:癌基因的擴增或表達(dá)的腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行檢測，而為了更早地預(yù)防乳腺癌的發(fā)生，需要在癌癥發(fā)生前就提前通過基因檢測準(zhǔn)確篩查出高風(fēng)險人群，并對這一人群進(jìn)行有針對性的健康管理，才能做到真正的提早預(yù)防，真正實現(xiàn)乳腺癌的早發(fā)現(xiàn)和早治療。雖然現(xiàn)在也有一些文獻(xiàn)或?qū)＠麍蟮?，通過基因芯片檢測一些關(guān)鍵癌基因的表達(dá)豐度變化情況來，但基因芯片檢測涉及的基因很多，而且在檢測早期樣本中由于基因豐度變化較低可能會檢測不到，這給癌癥檢測帶來較大的假陰性。
[0006]將上述檢測方法聯(lián)合使用，已能實現(xiàn)提高乳腺癌基因突變檢測的靈敏性并降低檢測的假陰性率。但這樣亦提高了成本，對于一些經(jīng)濟較不發(fā)達(dá)地區(qū)，這些檢測方法的聯(lián)合使用存在著較大的局限性。因此，開發(fā)適合的、低成本的乳腺癌相關(guān)基因的檢測方法，是亟待實現(xiàn)的技術(shù)進(jìn)步。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明的一個方面在于提供一種用于從人的不同樣品(癌組織樣本或血液)中選擇性地捕獲(或篩選)特定外顯子(如:乳腺癌相關(guān)基因)或目標(biāo)基因組區(qū)域的捕獲探針文庫的構(gòu)建方法。
[0008]本發(fā)明所提供的捕獲探針文庫構(gòu)建方法，其通過針對一些重要乳腺癌靶基因高突變位點設(shè)計多對引物探針，并應(yīng)用構(gòu)建好的探針庫雜交捕獲待檢樣本的特異區(qū)域而實現(xiàn)快速、高效的乳腺癌早期檢測不失為一種高性價比手段。
[0009]本發(fā)明提供的方法，涉及乳腺癌相關(guān)基因捕獲探針文庫的構(gòu)建，是對乳腺癌發(fā)病風(fēng)險高突變基因(如:但不僅限于BRCAl、BRCA2和CHEK2等)或乳腺癌病例樣本全外顯子組測序(Exome-seq)獲得的高突變位點相關(guān)基因作為目標(biāo)基因。這些目標(biāo)基因不僅包括通過紙件或電子方式記載在期刊、書籍、專利文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫(如:NCBI)中，那些已發(fā)現(xiàn)尚未公開、即將發(fā)現(xiàn)或未曾發(fā)現(xiàn)的與乳腺癌高發(fā)病風(fēng)險相關(guān)的基因或核苷酸也應(yīng)當(dāng)理解為目標(biāo)基因，而落入本發(fā)明的所涉及的范圍。
[0010]一種具體的實施方式，涉及乳腺癌相關(guān)基因捕獲探針文庫的構(gòu)建方法，其包括:
[0011]i)依據(jù)目標(biāo)基因，設(shè)計捕獲探針，探針至少須符合如下要求:
[0012]I)捕獲探針長度為60-80nt ;2)各探針的Tm值50°C-65°C ;3)無發(fā)卡等特殊結(jié)構(gòu)；以及4)進(jìn)行blast 比對，以校對探針的特異性。
[0013]ii)將與所設(shè)計的捕獲探針序列一致的寡核苷酸，連接入DNA克隆載體(含有多克隆位點)，獲得乳腺癌相關(guān)基因捕獲探針克隆庫；
[0014]在待捕獲核酸片段較大的情況下，還包括iii)基于所獲得的捕獲探針克隆庫，利用生物素標(biāo)記數(shù)量和位置確定的擴增引物或接頭元件(adapter)制備含有利于靶標(biāo)片段抓取的捕獲探針文庫(Database),具體操作如下:
[0015]I)將上述獲得的乳腺癌相關(guān)基因捕獲探針的DNA克隆載體片段化處理(如:超聲)，獲得含有靶標(biāo)基因的DNA克隆載體片段，片段長度為100-1000 ；
[0016]2)在DNA克隆載體片段兩端加上生物素標(biāo)記數(shù)量和位置確定的接頭，獲得帶有生物素標(biāo)記接頭的含有靶標(biāo)基因的DNA克隆載體片段；
[0017]3)通過表明帶有親和素修飾的磁珠而分離純化帶有生物素標(biāo)記接頭的含有靶標(biāo)基因的DNA克隆載體片段，從而得到已知生物素標(biāo)記數(shù)量和位置的捕獲探針集即帶有生物素標(biāo)記的捕獲探針文庫。
[0018]本發(fā)明的另一個方面在于提供一種從人的不同樣品(癌組織樣本或血液)中選擇性地捕獲(或篩選)特定外顯子(如:乳腺癌相關(guān)基因)或目標(biāo)基因組區(qū)域的高效低成本的方法。
[0019]本發(fā)明的乳腺癌相關(guān)基因的捕獲(或篩選)方法，是通過針對一些重要乳腺癌靶基因高突變位點設(shè)計多對引物探針，并應(yīng)用構(gòu)建好的探針庫雜交捕獲待檢樣本的特異區(qū)域，而選擇性地捕獲(或篩選)特定外顯子或目標(biāo)基因組區(qū)域，從而以高性價比的手段，實現(xiàn)了快速、高效的乳腺癌(高風(fēng)險基因)早期檢測。
[0020]一種具體的實施方式，將本發(fā)明獲得的乳腺癌相關(guān)基因捕獲探針克隆庫或乳腺癌相關(guān)基因捕獲探針文庫與含有待捕獲的祀標(biāo)基因組區(qū)域DNA片段雜交，捕獲疾病相關(guān)的核酸片段。
[0021]獲取靶標(biāo)基因組區(qū)域DNA模板及其文庫，是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)掌握的常規(guī)操作技術(shù)，其通過教科書所記載的技術(shù)手段即可實現(xiàn)，至少有如下4種方法可以獲取DNA模板及其文庫，如:
[0022]I)從來自生物樣品(癌組織或血液等)的總RNA或mRNA通過逆轉(zhuǎn)錄而獲得所需要的DNA模板；或
[0023]2)通過進(jìn)行多重PCR反應(yīng)而獲得DNA模版；或
[0024]3 )提取自生物樣品的基因組DNA模板；
[0025]4)通過基因合成獲得DNA模板。
[0026]本發(fā)明根據(jù)現(xiàn)有的或已獲得的乳腺癌高風(fēng)險致病基因的信息，構(gòu)建了乳腺癌疾病特異檢測的捕獲探針文庫(或克隆庫)，將捕獲探針文庫與片段化的DNA模板雜交。通過對捕獲得到的片段進(jìn)行高通量測序，并基于乳腺癌致病基因的已知信息，利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，還獲得了待測樣本中與乳腺癌高風(fēng)險致病基因相關(guān)的核酸序列的遺傳變異?目息。
[0027]本發(fā)明提供的各種方法及其獲得文庫(或克隆庫)，尤其適合于選擇性的捕獲高度特異性的祀標(biāo)基因，例如:與特定疾病相關(guān)的基因(乳腺癌相關(guān)基因等)。由于在這樣的應(yīng)用中，通常要靶向數(shù)十個甚至數(shù)百個特定的基因，因此，高特異性的捕獲效率和高通量的測序驗證必不可少，并為其奠定了基礎(chǔ)。
[0028]本發(fā)明提供的各種方 法及其獲得文庫(或克隆庫)，因可以調(diào)整相對捕獲效率從而確保了在所有基因靶標(biāo)上的一致性捕獲。解決了目前文獻(xiàn)報道的芯片捕獲中的不均一性而極大阻礙了 NGS測序平臺的使用效率。
【具體實施方式】
[0029]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面對本發(fā)明的各實施方式進(jìn)行詳細(xì)的闡述。然而，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解，在本發(fā)明各實施方式中，為了使讀者更好地理解本申請而提出了許多技術(shù)細(xì)節(jié)。但是，即使沒有這些技術(shù)細(xì)節(jié)和基于以下各實施方式的種種變化和修改，也可以實現(xiàn)本申請各權(quán)利要求所要求保護的技術(shù)方案。
[0030]具體而言，本發(fā)明根據(jù)現(xiàn)有的或已獲得的乳腺癌高風(fēng)險致病基因的信息，構(gòu)建了乳腺癌疾病特異檢測的捕獲探針文庫；對待測樣本中含有待捕獲的靶標(biāo)基因組區(qū)域DNA模板片段化，兩端加上adapter (接頭)，富集后用于檢測。制得的捕獲探針文庫與片段化的DNA模板雜交，捕獲得到的片段。經(jīng)高通量測序后，再基于乳腺癌致病基因的已知信息，利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，從而獲得待測樣本中核酸序列的遺傳變異情況。
[0031]1.樣品采集、運送和保存
[0032]無菌操作分別收集疾病樣本和正常血液樣本，更進(jìn)一步的可分別收集原癌灶、癌旁(或正常全外周血液樣本)，上述樣本在2~8°C條件下保存應(yīng)不超過72小時；-20°C可保存I個月；要長期保存的，需分裝后儲存于_70°C。如集中檢驗，標(biāo)本需在(TC以下環(huán)境中運送并于24小時內(nèi)送達(dá)實驗室。
[0033]2.乳腺癌相關(guān)基因捕獲探針文庫的構(gòu)建[0034]探針必須是純凈和特異的，不受其他不同核酸序列的影響。通常情況下，探針是克隆的DNA序列，人工合成的寡核苷酸或從體外轉(zhuǎn)錄克隆DNA序列后獲得的RNA，或者是一些寡肽也可以作為探針。本發(fā)明可按照以下方式獲得靶標(biāo)基因的捕獲探針文庫，具體如下描述:
[0035]i)首先，選擇用于制備捕獲探針文庫的乳腺癌相關(guān)靶基因，探針的序列對應(yīng)于特定疾病致病基因的外顯子(或外顯子前后兩端200bp)或特定目標(biāo)區(qū)域?？赏ㄟ^以下幾種方式實現(xiàn):
[0036]①文獻(xiàn)報道的乳腺癌發(fā)病風(fēng)險高突變基因，BRCAl、BRCA2、CHEK2等；②乳腺癌病例樣本全外顯子組測序(Exome-seq)獲得的高突變位點相關(guān)基因。
[0037]ii )確定目標(biāo)基因后(聞突變基因)，基于NCBI等數(shù)據(jù)庫獲得基因的序列，利用專業(yè)引物設(shè)計軟件(Primer或Oligo)設(shè)計出每個基因的分子探針，探針設(shè)計原則包括:①設(shè)計好的探針與NCBI等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blast比對以確保探針設(shè)計的特異性；②核苷酸的個數(shù)為60-80nt ;③各探針的Tm值適中(50-65°C);④無發(fā)卡等特殊結(jié)構(gòu)。探針的序列與靶標(biāo)基因的序列同源性在50%-80%之間，且與靶標(biāo)基因雜交時要求二者的identity值要大于90%，這樣可保證探針雜交的特異性。
[0038]iii)將設(shè)計出的探針序列合成為寡核苷酸探針，確認(rèn)合成探針無誤后連接入克隆載體(PUC19或pET29等，含有多克隆位點)，PCR驗證后獲得乳腺癌相關(guān)基因捕獲探針克隆庫；
[0039]如果待捕獲核酸片段較大，可進(jìn)一步基于上述獲得的捕獲探針克隆庫，利用生物素標(biāo)記數(shù)量和位置確定 的擴增引物或接頭元件制備含有利于靶標(biāo)片段抓取的捕獲探針文庫。具體操作步驟包括:1)采用超聲波等將上述獲得的乳腺癌相關(guān)基因捕獲探針克隆(DNA克隆載體)片段化處理，獲得含有靶標(biāo)基因的DNA克隆載體片段；2)在DNA克隆載體片段兩端加上生物素標(biāo)記數(shù)量和位置確定的接頭，獲得帶有生物素標(biāo)記接頭的含有靶標(biāo)基因的DNA克隆載體片段；3)通過表明帶有親和素修飾的磁珠而分離純化帶有生物素標(biāo)記接頭的含有靶標(biāo)基因的DNA克隆載體片段，從而得到已知生物素標(biāo)記數(shù)量和位置的捕獲探針集即帶有生物素標(biāo)記的捕獲探針文庫(Database )。
[0040]表1捕獲探針序列信息表
[0041]
【權(quán)利要求】
1.一種乳腺癌相關(guān)基因捕獲探針文庫的構(gòu)建方法，其包括: i)依據(jù)目標(biāo)基因，設(shè)計捕獲探針，所述探針至少須符合如下要求: I)捕獲探針長度為60-80nt ;2)各探針的Tm值50°C _65°C ;3)無發(fā)卡等特殊結(jié)構(gòu)；以及4)進(jìn)行blast比對，以校對探針的特異性； ii)將與所設(shè)計的捕獲探針序列一致的寡核苷酸，連接入DNA克隆載體，獲得乳腺癌相關(guān)基因捕獲探針克隆庫。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳腺癌相關(guān)基因捕獲探針文庫的構(gòu)建方法，其特征是所述的DNA克隆載體含有多克隆位點。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳腺癌相關(guān)基因捕獲探針文庫的構(gòu)建方法，其特征是所述的DNA克隆載體為PUC19或pET29。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳腺癌相關(guān)基因捕獲探針文庫的構(gòu)建方法，其特征是還包括所述的乳腺癌相關(guān)基因捕獲探針的DNA克隆載體片段化處理，獲得捕獲探針文庫。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳腺癌相關(guān)基因捕獲探針文庫的構(gòu)建方法，其特征是還包括: 1)將所述的乳腺癌相關(guān)基因捕獲探針的克隆庫片段化處理，獲得含有靶標(biāo)基因的DNA克隆載體片段，片段長度為100-1000 ； 2)在DNA克隆載體片段兩端加上生物素標(biāo)記數(shù)量和位置確定的接頭，獲得帶有生物素標(biāo)記接頭的含有靶標(biāo)基因的DNA克隆載體片段； 3)通過表明帶有親和素修飾的磁珠而分離純化帶有生物素標(biāo)記接頭的含有靶標(biāo)基因的DNA克隆載體片段，從而得到已知生物素標(biāo)記數(shù)量和位置的捕獲探針集即帶有生物素標(biāo)記的捕獲探針文庫。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的乳腺癌相關(guān)基因捕獲探針文庫的構(gòu)建方法，其特征是所述的片段化處理方法為物理超聲。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的乳腺癌相關(guān)基因捕獲探針文庫的構(gòu)建方法，其特征是所述的片段長度為100-1000。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1-7之一所述的乳腺癌相關(guān)基因捕獲探針文庫的構(gòu)建方法，用于從待測樣本中獲得與乳腺癌高風(fēng)險致病基因相關(guān)的核酸序列的遺傳變異信息。
9.一種捕獲乳腺癌相關(guān)基因的探針，其特征是依據(jù)權(quán)利要求1-7之一所述的乳腺癌相關(guān)基因捕獲探針文庫的構(gòu)建方法制得。
10.一種捕獲乳腺癌相關(guān)基因的方法，其特征是將依據(jù)權(quán)利要求9所述的捕獲乳腺癌相關(guān)基因的探針與含有待捕獲的 祀標(biāo)基因組區(qū)域DNA片段雜交，捕獲疾病相關(guān)的核酸片段。
【文檔編號】C12N15/11GK103757709SQ201310504391
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年10月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月23日
【發(fā)明者】張一桐, 張祥林, 胡秋萍, 陳昌岳, 陶曄 申請人:上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司