廣州管圓線蟲病早期檢測的分子標記物及引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種可作為早期廣州管圓線蟲病早期檢測的分子標志物，以及所用引物及相關(guān)試劑盒。該診斷試劑的必要組成包含：aca-miR-146a-5p序列及根據(jù)該序列設(shè)計的相應(yīng)的三條引物（莖環(huán)引物，上下游引物）。本發(fā)明是首次提出將aca-miR-146a-5p應(yīng)用于制備抗廣州管圓線蟲病的診斷。該診斷試劑具有早期、準確、簡易的檢測出廣州管圓線蟲感染，能把廣州管圓線蟲感染引起的腦膜炎或者腦炎和其他腦膜炎或者腦炎鑒別的優(yōu)點，具有很好的社會和經(jīng)濟效益。
【專利說明】廣州管圓線蟲病早期檢測的分子標記物及引物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本專利屬于生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種可作為早期廣州管圓線蟲病早期檢測的分子標志物，以及所用引物及相關(guān)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]廣州管圓線蟲病又稱嗜酸粒細胞增多性腦膜腦炎。是因吃了生的或不熟的含有廣州管圓線蟲幼蟲的淡水螺肉而感染，幼蟲寄生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)而致病。主要臨床表現(xiàn)為腦膜炎、脊髓膜炎、腦炎或脊髓炎，末梢血和腦脊液內(nèi)嗜酸性粒細胞數(shù)量增高，重型者可有持續(xù)性高顱壓；有腦部定位性損壞造成的相應(yīng)表現(xiàn)；少數(shù)患者可致死或留有后遺癥。廣州管圓線蟲病已被世界公認為新流行或者再流行的人獸共患寄生蟲病，我國衛(wèi)生部也在2003年將其列為新發(fā)傳染病。確診廣州管圓線蟲病需在病人腦脊液或者其他組織中找到蟲體，但檢出率只有百分之十左右。通常該病需要依靠臨床癥狀、流行病學(xué)資料和免疫學(xué)進行綜合診斷。目前實驗室檢查主要有以下幾種途徑:
一、血液常規(guī)檢查:白細胞總數(shù)正常或增加，嗜酸性粒細胞可有不同程度的增多。
[0003]二、腦脊液檢查:腦脊液壓力增高，白細胞數(shù)量及蛋白含量增加；嗜酸性粒細胞增多。糖、氯化物無明顯變化。極少數(shù)病例可找見幼蟲或成蟲。
[0004]三、免疫學(xué)檢查:常用的方法為酶聯(lián)免疫吸附試驗，抗體陽性可做為輔助診斷。
[0005]四、病原學(xué)檢查:從腦脊液、眼或其他寄生部位查見本蟲幼蟲或成蟲，但陽性機率極小。
[0006]五、影像學(xué)檢查:`頭顱MRI表現(xiàn)多種多樣，腦脊髓內(nèi)多發(fā)長條形或結(jié)節(jié)強化病灶和軟腦膜強化是主要的表現(xiàn)。
[0007]眾所周知，廣州管圓線蟲病的免疫診斷最主要是用ELISA法檢測病人血清中特異性抗體(蛋白質(zhì)水平)。而microRNA的變化早于蛋白質(zhì)變化和臨床癥狀的出現(xiàn)，因此適合于疾病的早期診斷。另外由于取材方便，血清或者腦脊液中的microRNA比組織的microRNA具有更好的應(yīng)用前景。microRNA是一種長度20~24nt單鏈小分子RNA，它廣泛存在于各種真核細胞生物中表達具時序性和組織特異性，在細胞生長、發(fā)育、分化、死亡等生物過程中起著重要的作用。miCToRNA釋放進入外周循環(huán)的途徑目前主要考慮有從受損細胞滲透入循環(huán)，形成微泡進入循環(huán)，由細胞分泌進入循環(huán)三種不同的途徑。miCToRNA耐RNA酶降解，在血清或者腦脊液中可以長期穩(wěn)定存在，煮沸、反復(fù)凍融、酸堿環(huán)境及長期保存等方法均不會損失。目前國外相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)miR-Ι對于急性心肌梗塞有診斷價值;miR-15、miR-16可用于慢性淋巴細胞性白血病的診斷；Let-7對非小細胞肺癌有診斷意義；miR-134可作為肺栓塞的診斷標志物。
[0008]miR-146a-5p是一種典型的多功能基因，由其下游基因介導(dǎo)，參與各種生理病理過程，如炎癥，免疫及腫瘤的發(fā)生發(fā)展。雖然microRNA在各種物種間有較高的保守性，即不同物種間的序列相似，但卻不完全相同。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]本發(fā)明的目的之一在于提供一種蟲源性的HiiCT0RNA作為廣州管圓線蟲病早期診斷的分子標志物。
[0010]本發(fā)明的另一個目的在于提供用于檢測廣州管圓線蟲病的引物。
[0011]本發(fā)明的目的之三在于提供檢測所采用的引物及分子生物學(xué)方法。
[0012]首先，發(fā)明提供了一種與廣州管圓線蟲病檢測相關(guān)的分子標記物，其核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。
[0013]同時，發(fā)明提供了一種用于檢測廣州管圓線蟲病的引物，其特征在于所述引物序列如 SEQ ID NO:2、SEQ ID N0:3 和 / 或 SEQ ID NO:4 所示。
[0014]如SEQ ID NO:1 所示基因，或者如 SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3 和 / 或 SEQ ID NO:4所示引物，可用于制備廣州管圓線蟲病檢測試劑。
[0015]發(fā)明同時提供了一種廣州管圓線蟲病檢測試劑盒，其特征在于含有如SEQ IDNO:2、SEQ ID N0:3和/或SEQ ID NO:4所示的引物。同時，該試劑盒其特征在于其擴增產(chǎn)物中還可含有aca-miR-146a_5p。
[0016]本發(fā)明通過數(shù)據(jù)庫mirbase中各種物種的miR-146a_5p進行序列比對,發(fā)現(xiàn)廣州管圓線蟲蟲源性 miR-146a-5p (aca-miR-146a_5p)序列為是 UGAGAACUGAAUUCCAUAGGC，而人源性 miR-146a-5p (hs a-miR-146a_5p)序列為 UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU，鑒于兩者序列末端相差較大，可以利用特別設(shè)計的三個引物(包括莖環(huán)引物、上游引物和下游引物)來鑒另1J。實驗證實，aca-miR-146a-5p是檢測人感染廣州管圓線蟲的有效標記物；而利用本發(fā)明所采用的引物，可以高特異性地檢測出相關(guān)疾病，準確率達96%。
[0017]本發(fā)明基于上述分子標記物和引物的設(shè)計，廣州管圓線蟲感染的檢測方法基本為:在人體血液中檢測到較高表達量的aca-miR-146a-5p，即可診斷此患者被廣州管圓線蟲感染；在腦脊液中檢測到較高表達量的aca-miR-146a-5p，即可診斷為廣州管圓線蟲感染引起的腦膜炎或者腦炎。
[0018]更具體地說，其步驟為提取疑似病人和正常人的血清(或腦脊液)中的總RNA然后用本發(fā)明中的特異性莖環(huán)引物逆轉(zhuǎn)錄成CDNA然后在用一對特異性引物進行實時定量PCR,以RNU6做為內(nèi)參，根據(jù)檢測結(jié)果判斷疑似病人有無廣州管圓線蟲感染。本發(fā)明可以用于制作診斷試劑盒。
[0019]本發(fā)明公開了 aca-miR-146a_5p在廣州管圓線蟲病中的診斷新方法。該診斷試劑的必要組成包含:aca-miR-146a-5p序列及根據(jù)該序列設(shè)計的相應(yīng)的三條引物(莖環(huán)引物，上下游引物)。本發(fā)明是首次提出將aca-miR-146a-5p應(yīng)用于制備抗廣州管圓線蟲病的診斷。該診斷試劑具有早期、準確、簡易的檢測出廣州管圓線蟲感染，能把廣州管圓線蟲感染引起的腦膜炎或者腦炎和其他腦膜炎或者腦炎鑒別的優(yōu)點，具有很好的社會和經(jīng)濟效益。
[0020]本發(fā)明具有以下有益效果:
采用本發(fā)明的分子標記物及相關(guān)引物，可準確地判斷出檢測對象是否受廣州管圓線蟲感染，準確率高達96%。
[0021]本發(fā)明的相關(guān)方法可早期、準確、簡易地檢測出廣州管圓線蟲感染，感染3d的病人即可在血液中檢測到aca-miR-146a-5p的表達增高5倍以上，從而及早治療，減輕臨床癥狀、減少并發(fā)癥和后遺癥。[0022]本發(fā)明的相關(guān)方法能把廣州管圓線蟲感染引起的腦膜炎或者腦炎和其他腦膜炎或者腦炎鑒別，在廣州管圓線蟲感染患者的腦脊液中，aca-miR-146a-5p表達量明顯增高，增高5倍以上,而在其他腦炎和其他腦膜炎感染患者中，aca-miR-146a-5p不出現(xiàn)增高,從而可以加以區(qū)別，進而采取有效的治療方案。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1為實時定量熒光PCR擴增曲線:圖示為標準的microRNA熒光PCR擴增曲線； 圖2實時熒光定量PCR溶解曲線:圖示中的溶解曲線為單峰，說明所用引物特異性好。
【具體實施方式】
[0024]下面通過具體的實施方式的描述來進一步闡明本發(fā)明，但并不是對本發(fā)明的限制，僅作示例說明。
[0025]實施例1 引物設(shè)計
在microRNA數(shù)據(jù)庫mirbase檢索得到廣州管圓線蟲蟲源性miR-146a_5p(aca-miR-146a-5p)序列為 SEQ ID NO:1 (UGAGAACUGAAUUCCAUAGGC)。
[0026]設(shè)計帶有莖環(huán)的逆轉(zhuǎn)錄引物SEQID NO:2:CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCCTATGG
實時PCR的上下游引物分別為:
上游引物 SEQ ID NO:3:ACACTCCAGCTGGGTGAGAACTGAATTCC
下游引物 SEQ ID NO:4:TGGTGTCGTGGAGTCG
實施例2
血清或者腦脊液總RNA的抽提
取200微升血清或者腦脊液至無RNA酶EP管中，12000rpm, 4°C離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清至另一去RNA酶EP管中，加入I毫升trizol，劇烈震蕩五分鐘，加入氯烷200微升，混勻后常溫下靜置十分鐘，12000rpm，4°C離心15分鐘，轉(zhuǎn)移上清另一去RNA酶EP管中，加入等體積異丙醇，混勻后常溫下靜置15分鐘，再置于4°C溫度下靜置35分鐘，12000rpm，4°C離心10分鐘，輕輕倒棄上清，然后用75%的乙醇洗滌沉淀后7200rpm，4°C離心10分鐘，棄風干10分鐘后加入20微升經(jīng)cbpc處理水溶解沉淀。
[0027]實施例3
由廣州管圓線蟲引起的腦部病變需要與病毒性腦膜腦炎，結(jié)核性腦膜腦炎以及其他腦寄生蟲病的鑒別:從確診廣州管圓線蟲感染病人30例及對照組30例(病毒性腦膜腦炎，結(jié)核性腦膜腦炎和其他腦寄生蟲病病人各10例)腰穿得到一毫升左右腦脊液，按照實施例2中提供的方法提取RNA后逆轉(zhuǎn)錄成CDNA，然后進行實時定量熒光PCR，實時熒光定量PCR的反應(yīng)條件為:預(yù)變性95°C，時間為IOmin ;變性95°C，時間為15sec，退火溫度為60°C，時間為30sec，延伸溫度72°C，時間為15sec，循環(huán)數(shù)為40 ;每個樣品進行復(fù)孔測試，每次檢測反應(yīng)都需要在循環(huán)結(jié)束后立即進行融解曲線分析，檢測溫度為70°C°C，升溫速率為0.4/ °〇次，恒溫時間為I sec/次。結(jié)果顯示:實時定量熒光PCR的溶解曲線為單峰(如圖2所示)，按照本試劑盒提供的診斷標準，即aca-miR-146a-5p表達量是標準陰性樣品五倍或者以上的可診斷為廣州管圓線蟲病引起的腦膜炎或者腦炎，本實驗得出該檢驗方法的敏感性和特異性分別為96%和94%。
[0028] 實施例4 通過血清早期診斷廣州管圓線蟲病
從確診廣州管圓線蟲感染病人50例及正常對照組50人靜脈抽血一毫升左右，不抗凝常溫放置四個小時，7500rpm，離心五分鐘，上清液即為血清，吸取100微升血清按照實施例2中提供的方法提取RNA，然后進行逆轉(zhuǎn)錄然后按照實施例3提供的方法進行實時定量熒光PCR,按照本試劑盒提供的診斷標準，即aca-miR-146a-5p表達量是標準陰性樣品五倍或者以上的可診斷為廣州管圓線蟲病，本實驗得出敏感性和特異性分別為96%和92%。
【權(quán)利要求】
1.一種與廣州管圓線蟲病檢測相關(guān)的分子標記物，其特征在于所述標記物核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。
2.一種用于檢測廣州管圓線蟲病的引物，其特征在于所述引物序列如SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3 和 / 或 SEQ ID NO:4 所示。
3.如SEQID NO:1所示基因在作為廣州管圓線蟲病分子標記物上的應(yīng)用。
4.如SEQID NO:1所示基因在制備廣州管圓線蟲病檢測試劑中的應(yīng)用。
5.如SEQID NO:2, SEQ ID N0:3和/或SEQ ID NO:4所示引物在制備廣州管圓線蟲病檢測試劑中的應(yīng)用。
6.一種廣州管圓線蟲病檢測試劑盒，其特征在于含有如SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3和/或SEQ ID N0:4所示的引物。
7.一種廣州管圓線蟲病 檢測試劑盒，其特征在于其擴增產(chǎn)物中含有aca-miR-146a_5p。
【文檔編號】C12Q1/68GK103695532SQ201310491375
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年10月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月18日
【發(fā)明者】陳小光, 孫希, 吳忠道 申請人:中山大學(xué)