從骨髓或臍帶血回收的干細胞和祖細胞組合物；用于制備其的系統(tǒng)和方法

從骨髓或臍帶血回收的干細胞和祖細胞組合物；用于制備其的系統(tǒng)和方法
【專利摘要】本發(fā)明包括從骨髓或臍帶血回收的干細胞和祖細胞組合物，其包含大多數(shù)活的CD34+細胞以及基本上消耗的位于原始樣品中的紅細胞，無需任何異生素添加劑以幫助細胞分離。本發(fā)明還包括用于制備組合物的系統(tǒng)和方法。該系統(tǒng)包括袋組和處理設備，所述處理設備利用光學傳感器、微控制器、伺服電動機、加速計、測壓儀和電池。該系統(tǒng)和方法利用離心，以使細胞分為數(shù)層并且隨后將干細胞分離且轉(zhuǎn)移到干細胞袋內(nèi)。處理設備的微控制器接受來自設備的加速計、測壓儀和光學傳感器的輸入，以指導袋組中的計量閥打開且關(guān)閉，以允許轉(zhuǎn)移盡可能多的干細胞與盡可能少的紅細胞。
【專利說明】從骨髓或臍帶血回收的干細胞和祖細胞組合物；用于制備其的系統(tǒng)和方法
[0001]本申請為申請?zhí)枮?00780053147.5的分案申請，要求2007年3月28日的優(yōu)先權(quán)。
_2] 與相關(guān)_請的交叉參考
[0003]根據(jù)35U.S.C.§ 120，本申請是于2002年4月8日提交的共同未決的美國專利申請系列號10/118，291的部分繼續(xù)申請，并且要求其優(yōu)先權(quán)，所述美國專利申請的完整公開內(nèi)容引入本文作為參考。根據(jù)35U.S.C.§ 120，本申請還是于2007年3月28日提交的共同未決的美國專利申請系列號11/664,212的部分繼續(xù)申請，并且要求其優(yōu)先權(quán)，所述美國專利申請是來自于2005年8月16日提交的國際申請系列號PCT/US2005/029288的35U.S.C.§371國家階段申請，并且要求其優(yōu)先權(quán)，所述國際申請指定美國并根據(jù)PCTArticle21 (2)于2006年4月13日作為國際申請?zhí)朩02006/038993A2以英文公開，并且其依次要求于2004年9月30日提交的美國專利申請系列號10/957,095的優(yōu)先權(quán)，所述美國專利申請于2007年5月I日作為美國專利號7，211，191授權(quán)，所述專利的所有公開內(nèi)容整體引入本文作為參考。
[0004]發(fā)明背景
[0005]1.發(fā)明領(lǐng)域
[0006]總的來說，本發(fā)明涉及用于從人骨髓或臍帶血回收特定細胞群體的方法和裝置。具體地，本發(fā)明包括用于高效回收(分離且分開)位于骨髓或臍帶血中的干細胞和祖細胞，并且取出過量紅細胞、嗜中性粒細胞、血小板和血漿的系統(tǒng)和方法，無需借助于通常用于改善干細胞回收效率的異生素添加剤。該系統(tǒng)包括無菌、功能上封閉的袋組(bag set)以及設計為在離心場中操作的微處理器控制的電機械和光學設備，所述設備基于其大小和密度使細胞群體分開，并且隨后將這些干細胞和祖細胞以預定最終體積轉(zhuǎn)移至干細胞袋。本發(fā)明還包括由人骨髓或臍帶血制備的干細胞和祖細胞組合物，其可用于立即使用或用于貯存和隨后使用。
_7] 2.相關(guān)技術(shù)描述
[0008]為了本說明書和權(quán)利要求的目的，使用下述定義:
[0009]“自體使用”意指人細胞或組織植入、移植、輸注或轉(zhuǎn)移回細胞或組織從其回收的個體內(nèi)。
[0010]“類晶體”意指用于電解質(zhì)替換或增加血管內(nèi)體積的等滲鹽和/或葡萄糖溶液，例如鹽水溶液、林格氏(Ringer’s)乳酸鹽溶液或5%葡萄糖水溶液。
[0011]“造血干細胞”是產(chǎn)生許多類型的血細胞包括紅細胞(RBCs)、白血球、白細胞(WBCs)和血小板的多能干細胞。
[0012]“白血球”或白細胞是造血譜系中的細胞,其主要包括單核細胞、淋巴細胞和嗜中性粒細胞，并且表達細胞表面抗原⑶45 (⑶45+細胞)。
[0013]“淋巴細胞”是如通過Sysmex XE-2100測量的淋巴樣譜系細胞，其可以包括成熟淋巴細胞(T細胞、B細胞、NK細胞)以及發(fā)育中的淋巴細胞例如淋巴母細胞。[0014]“最低限度處理的骨髄或臍帶血”意指用于干細胞和祖細胞的抗凝(例如用肝素或檸檬酸鹽)骨髄或臍帶血處理，其不包括添加化學物質(zhì)(除水，類晶體，或滅菌、防腐或貯存試劑外)，并且不改變細胞或組織的相關(guān)生物特征。
[0015]“單核細胞”是如通過Sysmex XE-2100測量的髓樣譜系細胞，其可以包括成熟單核細胞和發(fā)育中的單核細胞例如成單核細胞。
[0016]“單核的細胞”(MNC)是造血譜系中的細胞，其包括單核細胞和淋巴細胞。
[0017]“嗜中性粒細胞”是如通過Sysmex XE-2100測量的髓樣譜系細胞，其可以包括多形核嗜中性粒細胞和發(fā)育中的嗜中性粒細胞，例如帶形、晚幼粒細胞、中幼粒細胞和成粒細胞。
[0018]“血小板”是如通過Sysmex XE-2100測量的巨核細胞系細胞，其可以包括成熟血小板(凝血細胞)。
[0019]“祖細胞”是通過一系列細胞分裂產(chǎn)生不同細胞譜系的干細胞直接后代。
[0020]“紅細胞”如通過Sysmex XE-2100測量的紅細胞系細胞，其包括成熟RBC而不是具核紅細胞。
[0021]“干細胞”是具有3種一般性質(zhì)的多能細胞:(I)它們能夠長期分裂且更新其自身；
(2)它們是非特化的；和(3)它們可以產(chǎn)生不同的特化細胞類型。關(guān)于干細胞的細胞表面抗原標記是CD34抗原，升高的胞內(nèi)酶醛脫氫酶(ALDH)濃度也是這樣。
[0022]“斯托克斯定律(Stoke’ sLaw)”是描述顆粒在重力加速度過程中在粘性液體中的沉降速度的數(shù)學公式(Vg=d2 (Pl-P2)/18iixG)，其中:
[0023]? Vg=沉降速度，
[0024]? d=顆粒直徑，
[0025]? Pl=顆粒密度，
[0026]*P2=液體密度，
[0027]? G=重力加速度，和
[0028]? U =液體粘度。
[0029]“Sysmex XE-2100”是由Sysmex Corp, Kobe, Japan制造的自動化血液學細胞分析儀，其通過流式細胞術(shù)區(qū)分且定量造血細胞，發(fā)射半導體激光束，并且檢測3種光信號:向前散射、側(cè)向散射和側(cè)向熒光。
[0030]“總具核細胞”(TNC)是WBCs和具核RBCs。
[0031]“異生素添加剤”和“異生素試劑”意指并非人體的天然組分的化學物質(zhì)，其有意加入收集的骨髄或臍帶血中用于達到細胞分離過程性能特征中的變化的目的，如果不添加其，所述變化將不發(fā)生。
[0032]異生素添加劑的例子是:`[0033]1.沉降試劑(例如，羥乙基淀粉、葡聚糖或明膠)；
[0034]2?密度梯度介質(zhì)(例如，F(xiàn)ieoll?, Percoll?);和
[0035]3.用于細胞表面大分子細胞的親和分子(例如單克隆抗體、與順磁珠結(jié)合的單克隆抗體)。
[0036]迄今，盡管干細胞的巨大臨床潛力，但無干細胞治療已收到FDA許可用于人使用。證實臨床功效和安全性且獲得干細胞治療的管理許可的主要障礙是，用于從骨髄或臍帶血分離干細胞群體的現(xiàn)有設備和方法具有ー個或多個下述明顯局限性:它們是冒微生物污染危險的開放系統(tǒng)；它們是時間和勞動カ密集的；它們需要添加不希望有且昂貴的異生素試劑；它們以平均40-75%的非常低效率回收干細胞；并且它們與用于組織再生的臍帶血或骨髓量不相客。
[0037]在干細胞治療嚴重和頻繁的人疾病的廣泛使用可以發(fā)生前，所述疾病例如心肌梗死、缺血、糖尿病和皮膚傷ロ，必須克服3個關(guān)鍵障礙:
[0038]1.臨床試驗必須證實干細胞治療的功效和安全性；
[0039]2.必須獲得由健康管理機構(gòu)，特別是食品藥品監(jiān)瞀管理局(FDA)細胞、組織和基因治療辦公室(Office of Cell, Tissue and Gene Therapy) (OCTGT)的管理許可；和
[0040]3.必須開發(fā)用于從最低限度處理的骨髄或臍帶血快速和簡單回收活的干細胞和祖細胞的實用方法，其不依賴于使用異生素添加劑以取出過量血漿、紅細胞和粒細胞。
[0041 ] 除造血干細胞外，目前已知骨髄和臍帶血包含具有用于組織再生且增強傷ロ愈合的潛在治療價值的其他類型干細胞和祖細胞。先前命名為骨髓基質(zhì)細胞的間充質(zhì)干細胞可以產(chǎn)生骨、軟骨、脂肪、肌肉和結(jié)締組織，并且是ALDH Br+。位于骨髓中的內(nèi)皮祖細胞是從造血干細胞傳下來的原始細胞，可以進入血流并且到達血管損傷區(qū)域以幫助修復損害，可以產(chǎn)生新血管,并且是⑶34+。
[0042]干細胞通過各種細胞表面標記進行鑒定，包括⑶34+和醛脫氫酶亮細胞(ALDHBr+)。CD34+細胞是表達命名為CD34的抗原的干細胞，所述抗原可以通過使用對于那種特定抗原具有特異性的生色團綴合抗體進行檢測。其他研究者基于其表達高水平的醛脫氫酶(ALDH)鑒定成體干細胞。ー個公司Aldagen (Durham,NC)開發(fā)了利用基質(zhì)的技術(shù),所述基質(zhì)通過產(chǎn)生強綠色熒光檢測表達高水平ALDH的細胞。這些所謂的ALDH亮細胞(ALDH Br+)可以使用流式細胞術(shù)進行檢測 。ALDH Br+細胞包含不同祖先，其可以產(chǎn)生多種重要細胞系，包括神經(jīng)和內(nèi)皮細胞。
[0043]干細胞的生存力可以通過幾種方法加以證實，所述方法包括排斥活體染料例如錐蟲藍或7-氨基-放線菌素D (7-AAD)。使用商購可得的試劑盒，通過測量作為關(guān)于在骨髄或臍帶血中的干細胞替代物的白細胞(CD45+細胞)的生存力常規(guī)評估干細胞的生存力。
[0044]大量骨髓或臍帶血是難處理的，特別是因為大量紅細胞的存在(對于骨髄中的每個⑶34+細胞存在約25，000個紅細胞，并且對于臍帶血中的每個⑶34+細胞存在約180，000個紅細胞)。這些過量紅細胞使得難以使用干細胞和祖細胞，因為它們的存在從根本上稀釋了在需要組織再生的傷ロ部位處的干細胞和祖細胞濃度，并且它們干擾用于干細胞的其他處理步驟，包括用于先體外后體內(nèi)細胞擴增的培養(yǎng)，基因治療、或細胞群體的親和純化。此外，此種大量紅細胞的存在產(chǎn)生其他安全性問題，例如在同種異體移植中的ABO不相容性。在一些情況下，還可能希望使來自體積減少的干細胞濃縮物的嗜中性粒細胞降到最低，這是由于這些細胞與炎癥反應的潛在關(guān)聯(lián)，以及在其細胞質(zhì)中存在可能影響生存力或可塑性或以其他方式改變干細胞功能性的生物學活性酶和細胞因子。
[0045]在固定離心時間段后細胞的運動速率和最終位置隨其大小和密度而變，其中它的運動根據(jù)斯托克斯定律進行限定。干細胞在其密度方面低于RBCs，并且在密度方面高于血小板，具有更接近于WBCs的那種的密度。因此，通過密度和大小回收干細胞的常規(guī)方法一般涉及通過離心使細胞群體分層，且然后在從離心機取出后，嘗試從臍帶血或骨髓的剩余部分中捕獲干細胞。
[0046]從骨髓或臍帶血分離WBCs和干細胞的ー種手工方法是將全部骨髓或臍帶血插入離心機管內(nèi)，并且使它們在1500-2000xg下在室溫下旋轉(zhuǎn)10-15分鐘。這使骨髓或臍帶血分離成上部血漿層、下部紅細胞(RBC)層、和在RBC和血漿之間的界面處的薄WBCs和干細胞和祖細胞層。在分層完成后，一次性塑料轉(zhuǎn)移移液管可以用于下至距離RBCs約Imm抽吸掉血漿(上層)。當取出血漿時，必須非常小心，以免攪亂必須通過相同的移液技術(shù)取出的WBC/干細胞和祖細胞層，同時嘗試堤防干細胞和祖細胞丟失到RBCs內(nèi)或干細胞被RBCs過度污染。這種在試管中的手工方法的缺點是它是開放系統(tǒng)，這冒著骨髓單位的微生物污染危險；它是勞動カ和時間密集的；WBC/干細胞和祖細胞層的紅細胞污染量是高度可變的；并且干細胞的丟失是顯著且可變的。重要的是避免微生物污染一一關(guān)于這種方法的主要關(guān)注，因為它可以負面影響培養(yǎng)干細胞的能力或冒感染傳播給干細胞受體身體的危險。 [0047]從臍帶血或骨髓回收WBC/干細胞和祖細胞群體的另ー種方法利用細胞處理設備，例如 CompomatG4設備(Fresenius KabiAG,Friedberg,德國)和 C0BE2991 血細胞處理器(Blood Cell Processor) (COBE Laboratories,Lakewood,CO)。這種類型的方法的例子呈3?于TsubakL入“Concentration of Progenitor Cells Collected from Bone MarrowFluid Using a Continuous Flow Cell Separator System，，，ApheresisandDialysis5(I),46-48,2001中。對于干細胞收獲的骨髄或臍帶血量依賴于所提議的臨床用途。對于組織再生或修復中基于細胞的治療，一般收集50-150mL骨髄或臍帶血。這些血庫儀器需要大量骨髓或臍帶血(超過200mL)以正確發(fā)揮作用，并且完全不適合于一般對于組織再生醫(yī)學應用收集的低體積(小于200mL)。此外，這些機械化方法的細胞產(chǎn)物的最終體積(50-100mL)基本上大于優(yōu)選的3-20mL最終體積，這提供對于臨床用途合適的干細胞和祖細胞濃度。這些儀器還需要泵以將血液或骨髄從ー個容器移動到另ー個，并且這些泵可能潛在引起對于細胞的機械損害。
[0048]用于骨髓或臍帶血的體積減少和純化的另ー種方法利用梯度介質(zhì)例如Fkoli?或.Pereoll⑩，以與骨髓或臍帶血組合，并且在離心過程中，使其自身介入細胞群體之間，以減少在回收干細胞的嘗試過程中細胞群體的混合。Fieoll?是中性、高分支、高質(zhì)量、親水的多糖。Fieoli? (例如密度1.077)可以用于將血液或骨髓分離成其組分(紅細胞、白細胞等)。Ficoll?正常放置在管的底部，并且用鹽水稀釋的骨髓或臍帶血隨后在Fieoli?上緩慢成層。在離心后，較重的RBCs(密度1.09-1.10)取代在管底部的Fico丨Rk:ヽ并且下述層從頂部到底部在柱中可見:(I)血漿和血小板；(2)單核的細胞(MNC)(密度1.06-1.07);
(3)Ficoll?；和(4)在底部以沉淀形式存在的紅細胞和嗜中性粒細胞(密度1.08-1.09)。這種分離允許以MNCs與RBCs共混合的更少機會收獲MNCs。一些紅細胞俘獲(紅細胞和嗜中性粒細胞的存在)仍在MNC層中發(fā)生。
[0049]用Ficoll?處理骨髄或臍帶血的明顯缺點是在將FicoU?加入骨髄或臍帶血的步驟時它是開放系統(tǒng)，從而意味著微生物可以直接進入骨髄或臍帶血內(nèi)，并且從而增加微生物污染的危險。為了減少這種危險，必須使用生物學安全工作櫥執(zhí)行這個步驟，這可能不總是可得到的，并且是為了可接受的性能必須連續(xù)維持且監(jiān)控的實驗室設備的昂貴部分。此外，F(xiàn)ico丨I?是異生素，并且在細胞可以安全地施用于人體前必須通過洗滌取出。這個洗滌步驟需要時間和努力，并且進ー步增加關(guān)于微生物污染和細胞丟失的可能性。干細胞的回收是低的且高度可變的，為20-70%。Percoli⑩，用聚乙烯吡咯烷酮包被的膠態(tài)二氧化硅,是類似于Ficoll?的具有其伴隨缺點的另ー種密度梯度介質(zhì)。
[0050]關(guān)于使用羥乙基淀粉(HES)沉降試劑分離骨髄白細胞的技術(shù)已由A.Montuoro等人，“A technique for isolation of bone marrow cells using hyaroxyethyl starch(HES) sedimentation agent, Haematologica76Suppll:7-9,1991 公開。HES 在臨床上用作血漿擴張劑并且特征在于它的分子量及其取代程度。一般以0.5-2% HES重量與骨髄或臍帶血體積的終濃度的HES添加引起紅細胞凝集，并且從而基于斯托克斯定律的原理改變其沉降速度。然而，HES是異生素，并且已與靜脈內(nèi)施用時ー些患者中的不利事件相關(guān)。此外，！ES的使用増加成本和對于細胞處理的另外復雜性。葡聚糖聚合物制劑和明膠溶液也已用于相同目的，并且具有與!ES相同的缺點。
[0051]最后，還已知可以通過使用免疫方法從骨髓或臍帶血分離干細胞和祖細胞，所述免疫方法包括流式細胞術(shù)細胞分選(Beckton Dickinson或Coulter)和通過抗體包被的順磁顆粒細胞分選例如Miltenyi CliniMacs或BaxterIsolex系統(tǒng)。對干細胞抗原例如⑶34具有特異性的抗體用作這些分離技術(shù)的部分。這些方法具有需要昂貴的異生素試劑、設備和一次性處理用具，并且執(zhí)行是費時的缺點。雖然最終產(chǎn)物是具有少的紅細胞或白細胞污染的更純的干細胞群體，但這個純度水平代表相當大的產(chǎn)生的費用，并且可能不是達到預期細胞治療效果所需要的。此外，抗體和珠對骨髄或臍帶血的添加意味著產(chǎn)物在方法過程中不是“最低限度處理的”，因為這些試劑可能引起非故意的不利生物后果，例如干細胞不可逆的分化成譜系定型途徑。
[0052]由 Minguell,等人“Preparative separation of nucleated cells from humanbone marrow”，Experentia35:548-549,1978的研究比較了由于用葡聚糖、葡聚糖加
Ficoll?、 和血沉棕黃層法處理的體積減少、細胞回收和細胞生存力。該論文
證實缺乏用于骨髄的理想制備方法`，因為ー些方法引起細胞生存カ的喪失，并且全部具有68%或更少淋巴樣細胞(單核細胞和淋巴細胞或MNC)的相對低的細胞回收。為了達到所觀察到的2.7:1紅細胞(RBC)/具核細胞比，命名為血沉棕黃層法的無需沉降輔助的離心法具有低且高度可變的(36-68% )最初存在的這些細胞的淋巴樣細胞回收范圍。
[0053]發(fā)明概沭
[0054]需要用于從骨髄或臍帶血制備干細胞組合物的系統(tǒng)和方法，其選擇性回收高百分比的干細胞和非常低百分比的RBCs ;快速，非勞動カ密集，且易于以一致方式執(zhí)行；可以在手術(shù)室中使用；在無菌、功能上封閉的系統(tǒng)中執(zhí)行；不需要異生素添加劑；減少骨髄或臍帶血樣品的原始體積；能夠處理一系列骨髓體積；并且允許用戶預先選擇最終產(chǎn)物的體積。還需要這樣的干細胞組合物，其包括來自原始樣品的高百分比干細胞且使那些干細胞維持在存活條件下，包含來自原始樣品的非常低百分比的RBCs，不包括任何異生素添加剤，并且具有可以由用戶選擇的最終體積。
[0055]公開了衍生自人骨髓或臍帶血的干細胞組合物以及用于其制備的系統(tǒng)和方法。公開的發(fā)明具有整合到單一系統(tǒng)內(nèi)的下述10個屬性:[0056]1.它回收高百分比的干細胞；
[0057]2.它通過取出過量血漿、RBCs、血小板和嗜中性粒細胞而減少骨髓或臍帶血樣品的原始體積；
[0058]3.它不需要異生素添加劑以完成干細胞回收，同時增強產(chǎn)物的安全性概況，從而消除關(guān)于細胞洗滌的需要，且使成本降到最低；
[0059]4.它使干細胞維持在存活條件下；
[0060]5.它快速完成(少于90分鐘)；
[0061]6.由于干細胞分離和捕獲步驟的自動化，它并非勞動カ密集的；
[0062]7.它易于以一致方式執(zhí)行，從而需要最低限度的操作員訓練和專業(yè)知識；
[0063]8.它可以在手術(shù)室中或鄰近手術(shù)室使用用于自體或同種異體用途，或在細胞處理實驗室中使用。
[0064]9.它在無菌、功能上封閉的系統(tǒng)中分開且分離干細胞和祖細胞，以減少產(chǎn)物的微生物污染危險；和
[0065]10.它能夠處理用于組織再生的全范圍的骨髄和臍帶血。
[0066]在ー個方面，本發(fā)明包括了包括處理袋組和處理設備的系統(tǒng)。無菌且優(yōu)選一次性的袋組包括處理袋、RBC濃縮袋、干細胞袋、計量閥和使計量閥與每個袋連接的管路。一旦臍帶血或骨髓已轉(zhuǎn)移到處理袋內(nèi)，就將袋組放置到安裝到離心桶(bucket)內(nèi)的處理設備內(nèi)。處理設備與袋組相互作用，以在單次離心運行過程中將WBC/干細胞和祖細胞層從骨髄或臍帶血轉(zhuǎn)移到干細胞袋內(nèi)。處理設備包括光學傳感器、微控制器、伺服電動機、一個或多個加速計、測壓儀(load cell)和電池。微控制器接受且分析來自光學傳感器、加速計和測壓儀的輸入，并且指導伺服電動機以精確的閥運動打開且關(guān)閉計量閥，這允許在離心過程中通過密度和大小分層的不同細胞層轉(zhuǎn)移到不同袋內(nèi)。
[0067]在另ー個方面，本發(fā)明還包括用于從骨髄或臍帶血分離且濃縮干細胞的方法。該方法包括下述步驟。將骨髓或臍帶血轉(zhuǎn)移到處理袋內(nèi)。將裝載的袋組放置到處理設備內(nèi)。袋組在處理設備中以足夠的g力和時間離心，以使處理袋中的骨髄或臍帶血的細胞基于其密度和大小分為數(shù)層。袋組在處理設備中以較低的gカ離心，以允許大多數(shù)RBCs從處理袋分離且轉(zhuǎn)移到RBC濃縮袋內(nèi)。袋組可以任選在處理設備中以足夠的g力和時間離心，以使處理袋中的細胞基于細胞密度和大小再次分為數(shù)層。袋組在處理設備中離心，同時計量閥連續(xù)快速打開且關(guān)閉多次，以使剩余RBCs部分從處理袋分離到RBC濃縮袋內(nèi)，而不同時轉(zhuǎn)移WBC/干細胞和祖細胞層。當袋組在離心時，處理設備使空干細胞袋的重量校準為零。袋組在處理設備中離心，同時計量閥連續(xù)快速打開且關(guān)閉多次，以使小量剰余RBCs、WBC/干細胞和祖細胞層以及一些血漿從處理袋中分離且轉(zhuǎn)移到干細胞袋內(nèi)。
[0068]在另ー個方面，本發(fā)明包括通過本發(fā)明方法的實施方案制備的衍生自骨髓或臍帶血的干細胞和祖細胞組合物。來自骨髓的干細胞和祖細胞組合物具有約I個CD34+細胞與約500個RBCs的比，并且來自臍帶血的具有I個⑶34+細胞與5，000個RBCs的比。這些干細胞和祖細胞組合物不包含任何異生素添加剤。
[0069]本發(fā)明的干細胞組合物解決了無需異生素添加劑的、關(guān)于在功能上封閉的袋組中快速制備的干細胞和祖細胞組合物的目前未滿足的臨床需要，以達到先前難以達到的紅細胞與干細胞比。骨髓組合物是有利的，因為它回收高比例的⑶34+細胞(約97%)和ALDHBr+細胞(約92%)，同時消耗約98%的RBCs，并且不包含異生素添加剤。臍帶血組合物也是有利的，因為它回收高比例的⑶34+細胞(約95% )，同時消耗約98%的RBCs，并且不包含異生素添加剤。
[0070]附圖簡沭
[0071]圖1是本發(fā)明袋組的實施方案的二維布置圖。
[0072]圖2是圖1袋組的透視圖。
[0073]圖3A是顯示圖1袋組的計量閥的ー個流體通道的示意圖。
[0074]圖3B是顯示圖3A中所示計量閥的第二個流體通道的示意圖。
[0075]圖3C是顯示圖3B中所示計量閥的第三個流體通道的示意圖。
[0076]圖4A是顯示與圖3A-3C實施方案不同的計量閥的實施方案的ー個流體通道的示意圖。
[0077]圖4B顯示圖4A中所示計量閥的第二個流體通道的示意圖。
[0078]圖5是本發(fā)明處理設備的實施方案的透視圖。
[0079]圖6是圖5處理設備的透視圖。
[0080]圖7是圖5處理設備的透視圖。
[0081]圖8是圖5處理設備的透視圖。
[0082]圖9是圖5處理設備的側(cè)視圖。
[0083]圖10是本發(fā)明處理設備的基板的實施方案的透視圖，顯示組分。
[0084]圖11是圖5處理設備的分解圖。
[0085]圖12是圖5處理設備中放置的圖1袋組的透視圖。
[0086]圖13是圖12袋組和處理設備的透視圖。
[0087]圖14是圖12袋組和處理設備的透視圖。
[0088]圖15是圖12袋組和處理設備的透視圖。
[0089]圖16是圖12袋組和處理設備在離心桶中的透視圖。
[0090]圖17是顯示圖16裝載的離心桶和離心機的部分分解圖。
[0091]圖18是圖5處理設備的微控制器的輸入和輸出的方框圖。
[0092]圖19是顯示在分層步驟后的細胞層的圖1處理袋的部分橫截面?zhèn)纫晥D。
[0093]圖20是顯示在方法的離心步驟過程中隨時間而變的在透光率中的變化的曲線圖，具體顯示在離心過程中隨時間而變的在LED和光學傳感器之間骨髓或臍帶血流體透光率中的變化。
[0094]發(fā)明詳沭
[0095]用于從骨髓或臍帶血回收干細胞和祖細胞組合物的系統(tǒng)
[0096]該系統(tǒng)包括袋組100和處理設備200。
[0097]圖1和2顯示袋組100的實施方案。袋組100是功能上封閉且優(yōu)選一次性的。袋組100包括通過管路或管道系統(tǒng)與計量閥連接的3個或更多個袋，具有入口管路、夾、濾器和取樣位點。袋組100優(yōu)選包括3個袋:處理袋102、紅細胞(RBC)濃縮袋104和干細胞袋106。
[0098]處理袋102可以由乙烯こ酸乙烯酯(EVA)制成，但還可以由PVC或其他塑料制成。RBC濃縮袋可以由PVC或其他塑料制成。干細胞袋106可以由EVA制成，盡管也可以使用其他塑料。袋102和106可以是吹塑的。RBC濃縮袋可以是RF熔接的，盡管它可以是吹塑的。
[0099]處理袋102是三維袋，其可以具有不對稱形狀，包括頂部邊緣108、彎曲側(cè)面110、垂直側(cè)面112、錐形底部113和底部出口 114。頂部邊緣108包括入口 115和2個洞116。可替代地，處理袋102可以是對稱形狀的，從而使得它的側(cè)面錐形對稱地朝向底部出口 114。處理袋102的總體積可以是約240mL，盡管在使用中，它一般充滿約50_150mL骨髓或臍帶血。處理袋102通過與入口 115連接的入口管路118供應。入口管路118包括凹形Iuer ロ(female Iuer) 120，其允許袋組100與包含待轉(zhuǎn)移到處理袋102內(nèi)的骨髓或臍帶血的注射器連接。凹形Iuer ロ 120與凸形Iuer頭(male luer)122連接，所述凸形Iuer頭122與釘124連接，所述釘124由帽126覆蓋，所述帽126允許袋組100與包含待轉(zhuǎn)移到處理袋102內(nèi)的骨髓或臍帶血的收集袋連接。入口管路118包括凝塊和骨碎片濾器128(約200-300 U網(wǎng)孔)。管路或管道系統(tǒng)夾130位于凝塊和骨碎片濾器128與凹形Iuer ロ 120之間。入口管路118可以任選還包括取樣位點132、取樣枕134和取樣位點136，全部位于凝塊和骨碎片濾器128下。取樣位點132和136各自包括無針凹形Iuer 口和非放氣Iuer ロ帽。底部出口 114將輸出從處理袋102導向計量閥138。
[0100]RBC濃縮袋104可以是扁平袋，具有頂部邊緣105、底部邊緣107和2個側(cè)面邊緣109,并且包括蝶形釘孔(spike port) 140,其用于在過程結(jié)束時取出RBCs的等分試樣,如果需要這樣的話。底部邊緣107在ー個角落處包括入口 111。RBC濃縮袋104的體積是約IOOmL,盡管在使用中，它一般充滿約30-80mL。RBC濃縮袋104在入口 111處與供應管路142連接，所述供應管路142在計量閥138的連接頭139之ー處與計量閥138連接。
[0101]干細胞袋106是形狀為矩形的三維袋。干細胞袋106包括頂部邊緣117、底部邊緣119、大區(qū)室144和小區(qū)室146，其中區(qū)室144和146通過2個通道148連接。頂部邊緣117包括入口 121和2個釘孔150，其用于在過程結(jié)束時取出干細胞。干細胞袋106的體積是約30mL，盡管在使用中，它一般充滿約25mL，其中約20mL在大區(qū)室144中，并且約5mL在小區(qū)室146中。干細胞袋106在入口 121處與干細胞袋入口管路152連接，所述干細胞袋入ロ管路152通過F連接頭154與供應管路156連接。供應管路156在計量閥138的連接頭139之ー處與計量閥138連接。F連接頭154使供應管路156和干細胞袋入口管路152與分支管路158連接。分支管路158通過T連接頭160與取樣管路162和冷凍保護劑供應管路164連接。取樣管路162包括管路夾164和取樣位點166，并且在取樣枕168中終止。冷凍保護劑供應管路164包括取樣位點170和管路夾172，并且在無菌濾器174 (優(yōu)選約0.2 U網(wǎng)孔)中終止。取樣位點166和170各自包括無針凹形Iuer 口和非放氣Iuer ロ帽。
[0102]管路118、142、156和162是可以由PVC、EVA或其他材料制成的管道系統(tǒng)。管路152和158是由EVA制成的管道系統(tǒng)。冷凍保護劑供應管路164是在外部用PVC和在內(nèi)部用EVA制備的共擠壓管道系統(tǒng)。因為與冷凍保護劑接觸的塑料材料(如果它們浸出到冷凍保護劑內(nèi))可以進入干細胞袋106且污染最終產(chǎn)物，所以使用不包含可以浸出到冷凍保護劑內(nèi)的增塑劑的材料例如EVA用于將與冷凍保護劑接觸的管路是有利的。
[0103]計量閥138 可以是旋塞閥。在一個實施方案中，計量閥138是三通旋塞閥，因為它具有3個連接頭139，從而使得它可以與3個袋連接:處理袋102、RBC濃縮袋104和干細胞袋106。其他類型的計量閥或旋塞閥也將發(fā)揮作用，例如具有4個連接頭的四通旋塞閥。計量閥138包括具有3個連接頭139的外部部分141和內(nèi)部部分143。外部部分141可以由聚碳酸酯制成。內(nèi)部部分143包括整體模塑的柄145和桶147，其可以由聚乙烯(polyethelene)制成。桶147在幾個位置之間移動，包括定義為不允許任何流體流過計量閥138的位置的封閉位置，以及定義為允許流體流過計量閥138的位置的2個開放位置。2個開放位置包括允許流體從處理袋102流過計量閥138到RBC濃縮袋104的ー個位置，和允許流體從處理袋102流過計量閥138到干細胞袋106的ー個位置。在圖3A-3C中所示的一個實施方案中，計量閥138的桶147可以配置為包含3個開ロ，從而允許流體沿著3個可能流體通道流動:如圖3A中所示從處理袋102到RBC濃縮袋104的預期通道；如圖3B中所示從處理袋102到干細胞袋106的預期通道；和如圖3C中所示在RBC濃縮袋104和干細胞袋106之間的非計劃暫時通道，這可能在計量閥138在其2個預期位置之間移動時出現(xiàn)。此種暫時流體流動是不希望的，因為它可以允許ー些另外的RBCs流入干細胞袋106內(nèi)，從而減少所得到的干細胞組合物的純度。為了解決這個擔心，在圖4A-4B中所示的另ー個實施方案中，計量閥138的桶147可以可替代地配置為僅包含2個開ロ，從而允許流體僅沿著2個可能的流體通道流動；如圖4A中所示從處理袋102到RBC濃縮袋104的預期通道；和如圖4B中所示從處理袋102到干細胞袋106的預期通道。這種配置將排除在RBC濃縮袋104和干細胞袋106之間任何可能的暫時流體流動。計量閥138應能夠經(jīng)得住在離心過程中發(fā)生的高壓；例如，評定為約500磅/英寸2 (psi)的閥是令人滿意的。供應管路142從計量閥138導向RBC濃縮袋104。供應管路156從計量閥138導向F連接頭154，所述F連接頭154經(jīng)由干細胞袋入口管路152導向干細胞袋106。管路142、152和156可以各自是熱封的且與袋組100分開。[0104]如果需要更多的袋以使來自骨髓或臍帶血的另外組分分開，那么袋組100可以包括另外的袋。如果包括另外的袋，那么計量閥138將具有另外的連接頭以供給每個袋，并且袋組將包括另外的供應管路以使計量閥與每個袋連接。例如，如果希望使處理袋102中最后部分的RBCs與轉(zhuǎn)移到RBC濃縮袋104內(nèi)的那些RBCs分開，那么需要第四個袋。第四個袋通過分開的供應管路與計量閥138連接。在那種情況下，計量閥138將是具有4個連接頭的四通旋塞閥，并且將包括允許從處理袋102到其他3個袋中每個的流體流動的桶。
[0105]圖5-15顯示處理設備200的實施方案。處理設備200是略微圓柱狀的，具有頂部202、底部204、前部206、背部208、側(cè)面210和側(cè)面212。前部206包括前門214以及前壁216和217。處理設備200具有機體218、干細胞袋區(qū)室220、基板222、支持托架224和處理袋吊架226。機體218和干細胞袋區(qū)室220優(yōu)選由模塑的氨基甲酸こ酯制成，盡管還可以使用其他熱塑材料?；?22優(yōu)選由不銹鋼制成。支持托架224優(yōu)選由鋁制成。處理袋吊架226優(yōu)選由不銹鋼制成。依一定尺寸制造處理設備200以配合具有IL最低限度容積的離心桶內(nèi)，所述離心桶在橫截面中可以是圓形或卵圓形的。圖16顯示處理設備200，包含在離心桶228內(nèi)部的袋組100。圖17顯示裝載的離心桶228如何安裝到在合適位置中已具有另外5個裝載的離心桶的離心機內(nèi)。
[0106]處理設備200的機體218包括主區(qū)室230，所述主區(qū)室230具有加工為接受處理袋102的尺寸的延長卵圓形形狀。主區(qū)室230在頂部是開放的，并且由開放前門214接近，所述前門214通過鉸鏈232與處理設備200的前部206附著。主區(qū)室230具有符合且支持處理袋102的側(cè)壁234和236以及后壁238，且朝向通道240漸小，所述通道加工為接受處理袋102的錐形底部113的尺寸。側(cè)壁234和236在中部附近寬松地用架支撐處理袋102，并且在錐形底部113處更緊密地用架支撐處理袋102。接近處理袋102錐形底部113的更緊密容限是有利的，以提供關(guān)于處理袋102及其內(nèi)容物在離心的高壓過程中的支持，并且使對袋內(nèi)容物的干擾降到最低。前門214包括在其內(nèi)部表面上的凹入內(nèi)部凹進242，所述凹入內(nèi)部凹進242對應于主區(qū)室230的側(cè)壁234和236以及通道240，并且提供連續(xù)表面，從而使得當前門214閉合時，它符合且支持處理袋102。
[0107]凹進244位于處理設備200的前部206上，在前壁216和217下，并且配置為支持計量閥138的連接頭139。閥門致動器套箍246位于凹進244內(nèi)，并且按一定尺寸制造且配置為接受計量閥138柄145。閥門致動器套箍246通過螺絲250與伺服電動機248的軸附著。相應凹進252位于前門214內(nèi)部上，并且按一定尺寸制造且配置為接受計量閥138的伸出末端和連接頭139。
[0108]一個或多個光學傳感器254通過主區(qū)室230的前壁217裝配，它們的小孔位于側(cè)壁236上，其中相等數(shù)目的LEDs256位于相對側(cè)壁234上。LED256包括紅色LED燈，盡管還可以使用其他類型的LEDs。一個光學傳感器254和一個LED256優(yōu)選位于通道240之上約2cm，從而使得在光學傳感器254和LED256水平以及計量閥138水平之間的處理袋102中的體積是約2mL，盡管還可以使用其他距離和相應體積。如果包括另外的光學傳感器和LEDs,那么它們可以位于光學傳感器254和LED256之上或之下,這依賴于待分離的RBCs所需體積。
[0109]處理設備200的側(cè)面212包括槽ロ 258、貯存腔260、通道262、RBC濃縮袋凹進264、支持架266和鉤268。槽ロ 258按一定尺寸制造且配置為接受RBC濃縮袋104的釘孔140。RBC濃縮袋凹進264從槽ロ 258向下延伸至支持架266，并且按一定尺寸制造且配置為接受RBC濃縮袋104。貯存腔260位于槽ロ 258下，并且在RBC濃縮袋凹進264后且與RBC濃縮袋凹進264連續(xù)。通道262沿著RBC濃縮袋凹進264的內(nèi)部邊緣延伸，與前門214、頂部202和背部208鄰近。支持架266是形成RBC濃縮袋凹進264的底面的水平架。
[0110]干細胞袋區(qū)室220是水平、中空的矩形區(qū)室，其具有位于前門214的鉸鏈232下的較大側(cè)面270。干細胞袋區(qū)室268位于基板232下，并且與測壓儀272附著。干細胞袋區(qū)室220通過向下打開的鉸接門274接近，并且經(jīng)由在其頂部邊緣處位于干細胞袋區(qū)室220內(nèi)部的閂276合到應有位置。鉸接門274的內(nèi)部包含凹進278，所述凹進278按一定尺寸制造且配置為容納干細胞袋106的釘孔150和入口 121。鉸接門274的外部包含按一定尺寸制造以容納干細胞袋入口管路152的槽280和通道282。
[0111]底部通道284向上延伸并且與基板222平行，從在鉸鏈232下的前部206經(jīng)過側(cè)面210和背部208到側(cè)面212。底部通道284按一定尺寸制造以容納管路142。
[0112]處理設備200包括在側(cè)面210處延伸超過頂部202的處理袋吊架226。處理袋吊架226具有銜接在處理袋102上的洞116的接片227，使處理袋102維持在處理設備200內(nèi)部適當位置中。LED窗ロ 229位于側(cè)面210處的頂部202上。
[0113]支持托架224是U型托架，其通過螺絲225與基板222附著，并且定向與處理設備200的側(cè)面210和212平行。
[0114]如圖10中所示，基板222優(yōu)選具有安裝到其上的下述組分:印刷電路板286、伺服電動機248、測壓儀272和界面接觸印刷電路板288。印刷電路板286包含可編程只讀存儲器憶微控制器290。由于在離心過程中的熱產(chǎn)生，微控制器290可能需要溫度補償。測壓儀272是補償溫度的應變計測壓儀。伺服電動機248是齒輪減速電動機。ー個或多個加速計292安裝到印刷電路板286上；如果使用2個加速計292，那么ー個可以安裝到另ー個之上。優(yōu)選地，加速計292包括測量約0-200xg的低g加速計291，和測量約1000_1700xg的高g加速計293。印刷電路板286還包括通過LED窗ロ 229可見的狀態(tài)LEDs294。ー個或多個狀態(tài)LEDs294可以指示電池296的充電狀態(tài)以及在方法中正執(zhí)行的當前步驟，以及其他信息。提供界面接觸印刷電路板288以與外部電池充電器連接，并且提供與個人計算機的通訊連接?；?22通過螺絲298與機體218附著。
[0115]圖18是顯不微控制器290的輸入和輸出的方框圖。光學傳感器254、電池電壓302、測壓儀272以及加速計291和293，產(chǎn)生轉(zhuǎn)變成由微控制器290接受的數(shù)字輸入的模擬輸出。微控制器290以預定時間間隔記錄、貯存且分析那些輸入。微控制器控制伺服電動機248、關(guān)于光學傳感器254的LED256和狀態(tài)LEDs294。當包括計量閥138的袋組100正確放置到處理設備200內(nèi)吋，伺服電動機248通過其傳動軸與閥門致動器套箍246連接，并且響應來自微控制器290的信號，伺服電動機248引起計量閥138移動至不同位置，以打開或關(guān)閉至袋組100的袋的流體流動。
[0116]電池296位于處理設備200的側(cè)面210處在頂部202上的電池腔300中。電池296是可再充電的鎳金屬氫化物電池，包括具有總共約3.8-4伏的3個電池，所述電壓進行調(diào)節(jié)以提供5伏的恒定電壓。電池296給微控制器290、光學傳感器254、加速計291和293、測壓儀272、光學傳感器LED256、狀態(tài)LEDs294、伺服電動機248、以及處理設備200中的所有電路包括與個人計算機的通訊連接提供動カ。
[0117]處理單元200可以放置在分開的擴展塢(docking station)中，所述擴展塢包括電池充電器并且可以與個人計算機連接。來自微控制器290的數(shù)據(jù)可以轉(zhuǎn)移給個人計算機，并且經(jīng)由擴展塢通過界面接觸印刷電路板288，可以接受來自個人計算機的命令。
[0118]如圖12-15中所示，袋`組100如下插入處理設備200內(nèi)。將干細胞袋106放置到干細胞袋區(qū)室220內(nèi)，從而使得底部邊緣119首先配合，并且小區(qū)室146折疊并且放置在較大側(cè)面270中。入口 121和釘孔150放置在鉸接門274的凹進278內(nèi)部。干細胞袋入口管路152放置在鉸接門274的槽280中。鉸接門274隨后關(guān)閉并且用閂276閂上。干細胞袋入口管路152放置在通道282中。計量閥138的柄145放置到閥門致動器套箍246內(nèi)。處理袋102在主區(qū)室230中這樣定向，從而使得前門214在處理袋102的垂直側(cè)面112上關(guān)閉。F連接頭154放置在RBC濃縮袋凹進264內(nèi)。管路夾165關(guān)閉且連同取樣管路162 —起放置在通道262內(nèi)部。冷凍保護劑供應管路165、管路夾172 (關(guān)閉的)和取樣位點170放置到貯存腔260內(nèi)，其中無菌濾器174放置到貯存腔260的右側(cè)壁插座內(nèi)。取樣位點166錨定在鉤268處。取樣枕168安裝到直接在RBC濃縮袋凹進264的右側(cè)中的濾器插座下的凹進內(nèi)。隨后，將供應管路142放置到底部通道284內(nèi)，并且將RBC濃縮袋104放置到RBC濃縮袋凹進264內(nèi)。入口管路118和取樣位點136向下并且朝向在側(cè)面210處的處理袋吊架226折疊。處理袋102的洞116與吊架226的接片227附著。前門214關(guān)閉。釘孔140安裝到槽ロ 258內(nèi)，其中底部邊緣107在支持架266上，從而使得RBC濃縮袋104安裝在貯存腔260上。分支管路158沿著貯存腔260的左側(cè)垂直放置。
[0119]從骨髓或臍帶血回收干細胞和祖細胞組合物的方法[0120]該方法包括使骨髄或臍帶血細胞通過細胞密度和大小分層且分離的離心。待處理的骨髓或臍帶血包含血漿、RBCs、WBCs和干細胞，如由⑶34+和ALDHBr+干細胞標記的存在指示的。所得到的干細胞產(chǎn)物是干細胞和祖細胞的組合物，其包括ー些WBCs、以及顯著減少的RBCs和血漿。使用上文描述的系統(tǒng)的該方法在能夠處理一系列骨髄或臍帶血體積的無菌、功能上封閉的系統(tǒng)中執(zhí)行，并且產(chǎn)生其體積可以預先由用戶選擇的最終產(chǎn)物。該方法通過取出過量RBCs和血漿，并且如果臨床上有利的，則取出嗜中性粒細胞和血小板，來顯著減少骨髓體積，從而使最終干細胞組合物中的干細胞濃縮。對于這種方法不需要異生素添加劑，所述方法從骨髓或臍帶血回收高百分比的干細胞和祖細胞。
[0121]如本說明書中使用的，術(shù)語“g力”指相對離心力，并且所有對特定g力的參考均在處理設備200中的光學傳感器254位置處測定。應當理解本文提及的特定gカ和時間段舉例說明該方法的實施方案，并且除所提及的那些外的gカ和時間段是有用的并且包括在該方法的其他實施方案中。
[0122]在該方法的一個實施方案中，包括下述步驟:
[0123]1.將骨髓或臍帶血轉(zhuǎn)移到處理袋內(nèi)。
[0124]將骨髓或臍帶血收獲或收集到收集容器例如袋、注射器或其他容器內(nèi)，與抗凝劑例如肝素或(PD—起保存，并且轉(zhuǎn)移到處理袋102內(nèi)。轉(zhuǎn)移可以這樣完成:通過將釘124插入收集袋內(nèi)，使凹形旋鎖Iuer ロ(Iuerlock) 120與注射器附著,或使用無菌連接設備無菌對接收集袋和處理袋的管道系統(tǒng)。管路夾130是打開的。骨髄或臍帶血隨后經(jīng)由重力流動通過入口管路118從收集容器轉(zhuǎn)移到處理袋102。骨髓或臍帶血經(jīng)過凝塊和骨碎片濾器128，在它到達處理袋102前，所述凝塊和骨碎片濾器128從骨髓或臍帶血取出聚集物(例如血凝塊、脂肪球和骨碎片)。在骨髓或臍帶血轉(zhuǎn)移后，入口管路118在取樣位點132之上進行熱封，并且取出收集容器、凝塊和骨碎片濾器128以及管路118的其余部分。
[0125]約25-200mL體積的骨髓或臍帶血可以放置到處理袋102內(nèi)，其中約50_170mL是優(yōu)選的。如果收集的骨髄或臍帶血的原始體積是約IOOmL,并且骨髄或臍帶血具有約30%的血細胞比容，那么RBC體積將是約30mL，WBC以及干細胞和祖細胞體積將是約lmL，并且剩余體積將是血衆(zhòng)。
[0126]出乎意料地，不必需沉降試劑或其他異生素添加剤，以執(zhí)行這個方法并且達到干細胞和祖細胞從骨髓或臍帶血的有效回收，如本文所描述的。如果需要沉降試劑例如HES，那么它任選加入處理袋102中的骨髄中。
[0127]如果需要，在取樣位點132之上的入口管路118熱封后，待處理的骨髓或臍帶血樣品可以從處理袋102中獲取。對取樣枕134進行擠壓并且釋放以將樣品抽取到枕內(nèi)。入口管路118隨后在取樣位點136之上進行熱封，并且連同取樣位點132取出取樣枕134。取樣枕134中的骨髓或臍帶血隨后可以通過取樣位點132接近用于分開的測定，例如用于細胞計數(shù)、細胞生存力、微生物污染和HLA分析。
[0128]如果未從處理袋102中獲取樣品，那么入口管路118在取樣位點136之上進行熱封，并且取出在取樣位點136之上的所有組分。
[0129]2.將裝載的袋組放置到處理設備內(nèi)。
[0130]將袋組100包括袋、管路和計量閥放置到如上所述的處理設備200內(nèi)。
[0131]如圖16和17中所示，將處理設備200與袋組100 —起放置到離心機的離心桶228內(nèi)，所述離心桶228可以進行冷凍。離心機需要用另ー個處理設備200或用合適的砝碼進行平衡。
[0132]3.使袋組以足夠的g力和經(jīng)過時間在處理設備中離心，以使處理袋中的骨髓或臍帶血細胞基于其密度和大小分為數(shù)層。
[0133]處理設備200中的袋組100以足夠的預定gカ和預定時間進行離心，以使處理袋102中的骨髓或臍帶血細胞群體通過細胞密度和大小分為數(shù)層。例如，離心可以在約1400xg下執(zhí)行約20-約40分鐘。在這個分層步驟過程中，計量閥138處于其關(guān)閉位置，從而使得不允許流體流動通過計量閥138。加速計293測量在離心過程中的g力。
[0134]離心優(yōu)選繼續(xù)直至細胞已分為3層。參見顯示在這個分層步驟已執(zhí)行后的處理袋102的圖19。下面、最濃的層400主要是RBCs ;中間密度的中間層402是WBC/干細胞和祖細胞以及ー些血小板的層；并且上面、最不濃的層404主要是血漿伴隨一些另外的血小板。與干細胞和祖細胞一起存在的血小板百分比將隨著離心持續(xù)時間增加而變大。1400g力和20-40分鐘的離心時間足以引起超過70%的干細胞遷移至WBC/干細胞和祖細胞層，盡管優(yōu)選至少約80% -90%的干細胞位于這個層中。
[0135]4.袋組在處理設備中以較低gカ離心，以允許大多數(shù)RBCs從處理袋分離且轉(zhuǎn)移到RBC濃縮袋內(nèi)。
[0136]細胞已在先前步驟中在處理袋102中分層后，處理設備200中的袋組100以足夠的預定較低gカ和預定時間進行離心，以允許大多數(shù)RBCs從處理袋102分離且轉(zhuǎn)移到RBC濃縮袋104內(nèi)。g力低于步驟3中使用的g力，以依具有細胞損傷的最低危險的受控方式，允許RBC層從處理袋102通過計量閥138通過供應管路142流動到RBC濃縮袋104內(nèi)。例如，離心可以在約80xg下執(zhí)行約3-約`10分鐘。這個離心步驟可以通過使先前步驟的g力自動減少至預定較低g力與先前分層步驟的離心連續(xù)，或它可以在先前離心步驟已完成且停下來后起始且執(zhí)行。
[0137]加速計291測量在離心過程中的g力。微控制器290 —接受預定gカ穩(wěn)定例如約30秒的來自加速計291的輸入，微控制器290就指導伺服電動機248，以引起閥門致動器套箍246使計量閥138打開至這樣的位置，所述位置產(chǎn)生從處理袋102通過供應管路142且到RBC濃縮袋104內(nèi)的流體通道。在計量閥138打開時，處理袋102中由壓緊的RBCs組成的大部分下層流動到RBC濃縮袋104內(nèi)。
[0138]同時在計量閥138打開時，微控制器290在流體流過LED256時指導光學傳感器254從LED256獲取通過在處理袋102中的骨髓或臍帶血的透光率讀數(shù)。微控制器290連續(xù)記錄且分析透光率，它接受所述透光率作為隨時間而變的來自光學傳感器254的輸入。圖20顯示隨著細胞層流經(jīng)LED256和光學傳感器254在離心過程中隨時間而變的相對透光率，在步驟4中計量閥138打開后開始并且持續(xù)經(jīng)過步驟8，排除任選步驟5。線近似S形曲線，具有其中存在很少的透光率或無透光率并且線幾乎水平的區(qū)域A ;其中存在透光率量中的快速増加并且線的斜率陡的區(qū)域B ;和其中存在大量透光率并且線幾乎水平的區(qū)域C。
[0139]在這個步驟過程中，RBC層流經(jīng)光學傳感器254。因為RBC層具有最大的細胞濃度，所以它阻斷光透射至光學傳感器254。因此，在這個步驟過程中，光學傳感器254檢測出來自LED256的很少光或未檢測出光，如圖20上的區(qū)域A所示。
[0140]在RBC層已流經(jīng)光學傳感器254后，RBC層和WBC/干細胞和祖細胞層之間的界面開始流過光學傳感器254。因為這個層具有比RBC層更低的細胞濃度，所以更多的光通過光學傳感器254從LED256檢測出。微控制器290 —由光學傳感器254通知，預定量的透光率已達到，這指示W(wǎng)BC/干細胞和祖細胞組合物層的經(jīng)過的開始，微控制器就指導伺服電動機248，以引起閥門致動器套箍246使計量閥138關(guān)閉，從而使得通過計量閥138的流體流動停止。這由圖20上的點D顯示。因此，WBC/干細胞和祖細胞層的最低部分一開始達到光學傳感器254，計量閥138就關(guān)閉。
[0141]在這個分離步驟后，約2mL壓緊的RBC體積保留在處理袋102中，大部分RBC體積已轉(zhuǎn)移到RBC濃縮袋104內(nèi)。例如，在具有30%血細胞比容的IOOmL收集的骨髓的原始體積中，約28mLRBC體積(約93% )目前將在RBC濃縮袋104中，并且約2mL (7% )RBC體積將保留在處理袋102中。
[0142]5.袋組可以任選在處理設備中以足夠的g力和經(jīng)過時間離心，以使處理袋中的細胞基于細胞密度和大小再次分為數(shù)層。
[0143]這是個任選步驟。如果這個步驟不執(zhí)行，那么該方法前進到下ー個步驟。
[0144]由于先前分離步驟和當細胞溶液通過計量閥138取出時發(fā)展的科里奧利(Coriolis)力，處理袋102中的細胞層(這包括RBC層的剩余部分、所有WBC/干細胞和祖細胞層、和所有血漿層)可以在其界面處變得略微更少確定且更多混合。在這個任選步驟中，處理設備200中的袋組100可以以足夠的預定g力和時間離心，以使剩余細胞通過細胞密度和大小再次分為更確定的層。例如，離心可以在約1400xg下執(zhí)行約5-約15分鐘。這個離心步驟可以通過給離心機編程以自動增加g力與先前分離步驟的離心連續(xù)，或它可以在先前離心步驟已完成且停下來后起始且執(zhí)行。
[0145]在這個離心步驟過程中，計量閥138處于其關(guān)閉位置，從而使得不允許流體流動通過計量閥138。離心優(yōu)選持續(xù)直至細胞已再次分為在層之間的界面處具有減少的混合的3層:剩余RBCs的下層、WBC/干細胞和祖細胞的中間層、和血漿上層。離心カ和時間是足夠的，從而使得超過70%的干細胞位于WBC/干細胞和祖細胞層中，盡管優(yōu)選至少約80% -90%的干細胞位于這個層中。
[0146]6.袋組在處理設備中離心，同時計量閥接連快速打開且關(guān)閉多次，以使剩余RBCs的相當大部分從處理袋更精確地轉(zhuǎn)移到RBC濃縮袋內(nèi)，而不同時轉(zhuǎn)移WBC/干細胞和祖細胞層。
[0147]先前任選再分層步驟后，或如果未執(zhí)行再分層步驟，那么在先前分離步驟后，處理設備200中的袋組100以足夠的預定g力和預定時間段離心，以完成這個步驟以及步驟7和8。例如，離心可以在約80xg (與步驟4中使用的相同的g力)下執(zhí)行約5-約15分鐘。
[0148]在這個步驟中，在處理袋102中剩余RBCs的相當大部分精確地轉(zhuǎn)移到RBC濃縮袋104內(nèi)。較低g力的目的是以具有細胞損傷的最低危險的受控方式，允許RBCs從處理袋102流動到RBC濃縮袋104內(nèi)。這個離心步驟可以與先前步驟的離心連續(xù)，如果先前步驟是再分層，那么通過給離心機編程以自動減少g力來實現(xiàn)，或如果先前步驟是分離，那么通過以相同g力繼續(xù)離心來實現(xiàn)，或它可以在先前離心步驟完成且停下來后起始且執(zhí)行。
[0149]加速計291測量在離心過程中的g力。微控制器290 —接受預定gカ穩(wěn)定例如約30秒的來自加速計291的輸入，微控制器290就指導伺服電動機248，以引起閥門致動器套箍246使計量閥138打開至這樣的位置，所述位置產(chǎn)生從處理袋102通過供應管路142且到RBC濃縮袋104內(nèi)的流體通道，并且隨后關(guān)閉，經(jīng)過預定時間間隔的預定持續(xù)時間連續(xù)重復打開和關(guān)閉多次達預定數(shù)目的循環(huán)，允許從處理袋102到RBC濃縮袋104訪問足夠的重復的、不連續(xù)時間量，以允許血漿層接近光學傳感器254水平。例如，計量閥138可以設定為打開約0.1-約0.2秒的持續(xù)時間，并且關(guān)閉約10秒，這個循環(huán)重復約10-約30次，盡管持續(xù)時間、時間間隔和重復的其他組合也將良好工作。隨著計量閥138打開且關(guān)閉，處理袋102中剰余RBCs部分流動到RBC濃縮袋104內(nèi)。這個精確的紅細胞取出步驟引起在先前步驟后保留在處理袋102中的2mLRBC體積中約1_1.5mL從處理袋102流動到RBC濃縮袋104內(nèi)，甚至進一步減少處理袋102中留下的RBC體積，并且由于伴隨計量閥138毎次短暫打開和關(guān)閉的微小體積的RBC轉(zhuǎn)移，RBCs不與干細胞和祖細胞混合，并且由于科里奧利力，干細胞和祖細胞不吸入到轉(zhuǎn)移的紅細胞內(nèi)。如果需要，甚至更大比例的剩余RBCs也可以通過這種方式轉(zhuǎn)移到RBC濃縮袋102內(nèi)。
[0150]這個最終精確計量活性由微控制器290指導，所述微控制器290隨著處理袋102中的細胞層流過LED256，從光學傳感器254接受來自LED256的透光率讀數(shù)。微控制器290連續(xù)記錄且分析隨時間而變的透光率，并且使當前值與先前值比較。在這個步驟過程中，WBC/干細胞和祖細胞層流經(jīng)光學傳感器254。因為這個層在其與RBC層的界面處具有較高的細胞濃度，并且在其與血漿層的界面處具有較低的細胞濃度，所以隨著WBC/干細胞和祖細胞層流經(jīng)光學傳感器254和與血漿層的界面接近，透光率穩(wěn)定增加。因此，在這個步驟過程中，光學傳感器254檢測出在來自LED256的透光率中的穩(wěn)定增加。這由圖20上區(qū)域B中線的斜率顯示。
[0151 ] WBC/干細胞和祖細胞層已流經(jīng)光學傳感器254后，WBC/干細胞和祖細胞層和血漿層之間的界面開始流過光學傳感器254。因為血漿層具有比WBC/干細胞和祖細胞層更少的細胞，所以通過光學傳感器254從LED256檢測出更多的光。微控制器290 —接受來自光學傳感器254的輸入，所述輸入為透光率的變化率中的預定減少已發(fā)生，這基于光學傳感器254檢測預定速率值，微控制`器290就指導伺服電動機248，以引起閥門致動器套箍246使計量閥138關(guān)閉，從而使得RBCs通過計量閥138的轉(zhuǎn)移終止。這由圖20上的點E顯示，在從區(qū)域B中線的陡斜率到區(qū)域C中幾乎水平的線的轉(zhuǎn)換處，這是在其下WBC/干細胞和祖細胞組合物層已流過光學傳感器254之下并且血漿層已開始流經(jīng)光學傳感器254的點。因此，血漿層的最低部分一開始達到光學傳感器254，計量閥138就關(guān)閉。
[0152]在這個分離步驟后，約0.5-1.0mLRBC體積保留在處理袋102中，另外1_1.5mLRBC體積已轉(zhuǎn)移到RBC濃縮袋104內(nèi)。
[0153]7.當袋組在離心時，處理設備使空干細胞袋的重量校準為零。
[0154]計量閥138在先前步驟中已關(guān)閉后，離心以步驟6中設定的g力和時間繼續(xù)。カロ速計291證實設定的g力，在這個點下測壓儀272和微控制器290組合以使空干細胞袋106的重量校準為零。
[0155]8.袋組在處理設備中離心，同時計量閥接連快速打開且關(guān)閉多次，以使小量剰余RBCs、WBC/干細胞和祖細胞層以及一些血漿從處理袋中分離且轉(zhuǎn)移到干細胞袋內(nèi)。
[0156]袋組106在處理設備200中的離心以步驟6中設定的g力和時間繼續(xù)。當微控制器290接受來自測壓儀272的輸入，所述輸入為空干細胞袋106的重量已校準為零，微控制器290就指導伺服電動機248，以引起閥門致動器套箍246使計量閥138打開至這樣的位置，所述位置產(chǎn)生從處理袋102通過供應管路156和干細胞袋入口管路152到干細胞袋 106內(nèi)的流體通道，并且隨后關(guān)閉，經(jīng)過預定時間間隔的預定持續(xù)時間連續(xù)重復打開和關(guān)閉多次達預定數(shù)目的循環(huán)，允許從處理袋102到干細胞袋106訪問足夠的重復的、不連續(xù)時間量，以允許干細胞袋106填充直至達到它的預定重量。例如，計量閥138可以設定為打開約0.1-約0.2秒的持續(xù)時間，并且關(guān)閉約10秒，這個循環(huán)重復多次。隨著計量閥138打開且關(guān)閉，處理袋102中的剩余RBCs、WBC/干細胞和祖細胞層以及一些血漿流動到干細胞袋 106內(nèi)。這個步驟過程中較低g力的目的是以具有細胞損傷(其在較高g力下將發(fā)生)的最低危險的受控方式，允許這些細胞從處理袋102流動到干細胞袋106內(nèi)。[0157]在這個分離步驟過程中，測壓儀272測量干細胞袋106的重量，并且微控制器290 接受來自測壓儀272的輸入。預設WBC/干細胞和祖細胞層的所需重量，并且可以設定為約 3克-約30克。例如，如果干細胞袋106中最終干細胞產(chǎn)物的所需體積是10mL，那么可以使用10克的重量。微控制器290 —接受來自測壓儀272的輸入，所述輸入為干細胞袋106 已達到其預設重量，微控制器290就指導伺服電動機248，以引起閥門致動器套箍246使計量閥138關(guān)閉，從而使得通過計量閥138的流體流動停止。[0158]計量閥138關(guān)閉后，離心以相同的g力繼續(xù)直至已達到步驟6中的預設時間段設置。[0159]9.離心結(jié)束并且從處理設備中取出袋組。[0160]在預設離心時間段結(jié)束時，離心終止并且從離心機中取出處理設備200。從處理單元200中取出袋組100，包括所有袋、計量閥138和管路。[0161]干細胞袋106包含剩余RBCs、WBC/干細胞和祖細胞、以及一些血漿。干細胞袋106 的內(nèi)容物在本文中稱為“干細胞組合物”或“干細胞的組合物”。RBC濃縮袋104包含RBCs。 處理袋102包含在干細胞袋106中不包含的血漿的剩余部分。[0162]若需要，可以獲取來自RBC濃縮袋104和干細胞袋106的樣品。取樣管路162、取樣枕168、取樣位點166和管路夾164用于取樣干細胞袋106。[0163]如果干細胞組合物立即使用，例如在自體背景中，那么干細胞袋106隨后使用 Sebra密封器(Sebra Corp., Tucson, AZ.)與袋組100的其余部分分離。[0164]如果干細胞組合物待冷凍，那么冷凍保護劑溶液例如DMSO溶液應通過無菌濾器 174和冷凍保護劑供應管路165加入干細胞袋106中。使用骨髓和臍帶血作為干細胞來源的方法的例子[0165]從授權(quán)供應商收集5單位人骨髓和6單位臍帶血，并且在收集1-3天內(nèi)進行處理。 下表顯示對于通過本文所述方法處理的骨髓和臍帶血獲得的數(shù)據(jù)。骨髓用肝素進行抗 凝， 并且臍帶血用(PD進行抗凝。依一定尺寸制造以包含處理設備的臺式離心機提供離心場。 在這些實驗中不使用異生素添加劑作為沉降助劑。下表1提供用于骨髓和臍帶血實驗的方法步驟概括。[0166]表1:用于骨髓和臍帶血實驗的方法概括[0167]
【權(quán)利要求】
1.一種用于從骨髓或臍帶血制備干細胞產(chǎn)物的系統(tǒng)，其包括: a.袋組，包括容納收集的骨髄或臍帶血的處理袋、紅細胞濃縮袋、干細胞袋和計量閥，其中所述計量閥與所述處理袋、所述紅細胞濃縮袋和所述干細胞袋連接； b.處理設備，所述袋組安裝到其內(nèi)，并且包括微控制器、電動機、光學傳感器、LED、測壓儀和加速計， c.所述微控制器可操作地偶聯(lián)至所述電動機、所述光學傳感器、所述LED、所述測壓儀和所述加速計； d.當所述袋組包含在所述處理設備中時，所述電動機與所述計量閥可操作地偶聯(lián)； e.其中所述微控制器被設定為接受來自所述加速計的輸入，其中在所述處理設備中所述計量閥關(guān)閉，所述袋組以第一 gカ被離心，所述第一 g力足夠使所述處理袋中的骨髓或臍帶血分層為包含紅細胞的層，包含白細胞/干細胞和祖細胞的層，以及包含血漿的層；和 f.其中所述微控制器被設定為在骨髄或臍帶血在所述處理袋中被分層后接受來自所述加速計的輸入，其中在所述處理設備中所述袋組以第二 gカ被離心，所述第二 g力低于所述第一 g力，然后控制所述電動機，促使所述計量閥打開所述處理袋與所述紅細胞濃縮袋之間的流體通道，以允許相當一部分所述紅細胞從所述處理袋轉(zhuǎn)移至所述紅細胞濃縮袋，然后響應所述光學傳感器，控制所述電動機，促使所述計量閥關(guān)閉所述處理袋與所述紅細胞濃縮袋之間的所述流體通道，所述光學傳感器檢測在所述處理袋的頂部邊緣和底部出ロ之間水平通過所述處理袋的來自所述LED的透光率的ー組量；和 g.其中所述微控制器被設定為在促使所述計量閥關(guān)閉所述處理袋與所述紅細胞濃縮袋之間的所述流體通道后接受來自所述加速計的輸入，其中在所述處理設備中所述袋組以第三gカ被離心，然后控制所述電動機，促使所述計量閥接連多次打開和關(guān)閉所述處理袋與所述紅細胞濃縮袋之間的所述流體通道以相繼重復打開和關(guān)閉所述處理袋與所述紅細胞濃縮袋之間的所述流體通道接連重復的、不連續(xù)時間量，以允許另一部分所述紅細胞從所述處理袋轉(zhuǎn)移至所述紅細胞濃縮袋，然后響應所述光學傳感器，控制所述電動機，促使所述計量閥關(guān)閉所述處理袋與所述紅細胞濃縮袋之間的所述流體通道，所述光學傳感器檢測在所述處理袋的所述頂部邊緣和所述底部出口之間所述水平的通過所述處理袋的來自所述LED的透光率的變化速率的降低；和 h.其中所述微控制器被設定為響應所述微控制器接受的來自所述測壓儀測量所述干細胞袋重量的輸入，使所述干細胞袋校準為零；和 1.其中所述微控制器被設定為在所述干細胞袋校準為零后控制所述電動機，促使所述計量閥接連多次打開和關(guān)閉所述處理袋與所述紅細胞濃縮袋之間的所述流體通道以相繼重復打開和關(guān)閉所述處理袋與所述紅細胞濃縮袋之間的所述流體通道接連重復的、不連續(xù)時間量，以足夠使至少剩余的紅細胞以及白細胞/干細胞和祖細胞層轉(zhuǎn)移至所述干細胞袋然后響應所述微控制器對來自預設重量的所述測壓儀輸入的接受，控制所述電動機，促使所述計量閥關(guān)閉所述處理袋與所述干細胞袋之間的所述流體通道。
2.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中所述光學傳感器位于所述處理設備中，從而使得在所述光學傳感器水平和所述計量閥水平之間的所述處理袋中的體積是約2mL。
3.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中所述微控制器被設定為在步驟(f)之后且步驟(g)之前接受來自所述加速計的輸入，其中在所述處理設備中所述計量閥關(guān)閉，所述袋組以第四g力離心，所述第四g力足夠使所述處理袋中的骨髄或臍帶血再次分層為包含紅細胞的層，包含白細胞/干細胞和祖細胞的層，以及包含血漿的層。
4.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中所述第二和所述第三g力低于所述第一g力，并且其中所述第四g力等于所述第一 g力。
5.一種用于從骨髓或臍帶血制備干細胞產(chǎn)物的系統(tǒng)，其包括: 袋組，包括容納收集的骨髄或臍帶血的處理袋、紅細胞濃縮袋、干細胞袋和計量閥，其中所述計量閥與所述處理袋、所述紅細胞濃縮袋和所述干細胞袋連接； 處理設備，所述袋組安裝到其內(nèi)， 測壓儀裝置，用于測量所述干細胞袋的重量； 加速計裝置，用于含有所述袋組的所述處理裝置的離心g力； 光學傳感器裝置，用于測量通過所述處理袋的來自LED的透光率； 裝置，用于接受第一、加速計裝置測量的、含有所述袋組的所述處理裝置的離心g力足夠的時間段以使所述處理袋中的骨髄或臍帶血分層為包含紅細胞的層，包含白細胞/干細胞和祖細胞的層，以及包含血漿的層，其中所述計量閥關(guān)閉； 裝置，用于以第二、加速計裝置測量的、含有所述袋組的所述處理裝置的離心gカ打開所述計量閥，用于打開 含有所述分層的骨髄或臍帶血的所述處理袋與所述紅細胞濃縮袋之間的流體通道，以允許相當一部分所述紅細胞從所述處理袋轉(zhuǎn)移至所述紅細胞濃縮袋，并根據(jù)光學傳感器裝置測量的用于關(guān)閉所述流體通道的通過所述處理袋的來自所述LED的透光率ー組量，用于關(guān)閉計量閥；和 裝置，用于接連多次以第三、加速計裝置測量的、含有所述袋組的所述處理裝置的離心g力打開和關(guān)閉所述計量閥以相繼重復打開和關(guān)閉所述處理袋與所述紅細胞濃縮袋之間的所述流體通道接連重復的、不連續(xù)時間量，以允許另一部分所述紅細胞從所述處理袋轉(zhuǎn)移至所述紅細胞濃縮袋，井根據(jù)所述光學傳感器裝置檢測通過所述處理袋的來自所述LED的透光率的變化率的降低，用于關(guān)閉計量閥；和 裝置，用于接連多次打開和關(guān)閉所述計量閥以相繼重復打開和關(guān)閉所述處理袋與所述紅細胞濃縮袋之間的流體通道接連重復的、不連續(xù)時間量，以足夠使至少剩余的紅細胞和白細胞/干細胞和祖細胞的層轉(zhuǎn)移至所述干細胞袋，井根據(jù)預設的、測壓儀裝置測量的、所述干細胞袋的重量，用于關(guān)閉所述計量閥。
6.ー種從骨髄或臍帶血制備干細胞組合物的方法，其包括: a.將收集的骨髄或臍帶血放置到處理袋內(nèi)，其中所述處理袋是袋組的部分，所述袋組還包括紅細胞濃縮袋、干細胞袋和計量閥，并且進ー步地，其中所述計量閥與所述處理袋、所述紅細胞濃縮袋和所述干細胞袋連接； b.將所述袋組放置到處理設備內(nèi)，其中所述處理設備包括微控制器、伺服電動機、光學傳感器、LED、測壓儀和加速計，其中當所述袋組包含在所述處理設備中時，所述伺服電動機與所述計量閥可操作地偶聯(lián)； c.使包含所述袋組的所述處理設備以足夠的g力和時間離心，以使所述處理袋中的所述骨髓或臍帶血細胞分為紅細胞層、WBC/干細胞和祖細胞層以及血漿層，其中所述計量閥關(guān)閉； d.使包含所述袋組的所述處理設備以低于所述分層步驟中使用的g力的g力和足夠的時間離心，以使大多數(shù)所述紅細胞從所述處理袋分離到所述紅細胞濃縮袋內(nèi)，其中所述計量閥從所述處理袋打開到所述紅細胞濃縮袋； e.促使所述計量閥響應所述光學傳感器檢測來自所述LED的預定量透光率而關(guān)閉； f.使包含所述袋組的所述處理設備以足夠的g力和時間離心，以使更多所述紅細胞從所述處理袋分離到所述紅細胞濃縮袋內(nèi)，其中所述計量閥接連打開且關(guān)閉多次； g.促使所述計量閥響應所述光學傳感器檢測透光率的預設變化速率而關(guān)閉； h.使所述干細胞袋校準為零，其中所述校準使用來自所述測壓儀的數(shù)據(jù)來執(zhí)行； .使包含所述袋組的所述處理設備以足夠的g力和時間離心，以使剩余紅細胞、所述WBC/干細胞和祖細胞層以及一些所述血漿從所述處理袋分離到所述干細胞袋內(nèi)，其中所述計量閥接連打開且關(guān)閉多次； j.促使所述計量閥響應所述測壓儀測量所述干細胞袋的預設重量而關(guān)閉； k.從所述處理單元中取出所述袋組；和 .從所述袋組中取出包含所述干細胞組合物的所述干細胞袋。
7.權(quán)利要求6的方法，其在步驟(e)和(f)之間進一歩包括，使包含所述袋組的所述處理設備以足夠的g力和時間離心，以使所述處理袋中的所述骨髓或臍帶血細胞再次分為紅細胞層、WBC/干細胞和祖細胞層以及血漿層，其中所述計量閥關(guān)閉。
8.權(quán)利要求6的方法，其進ー步包括預先選擇所述干細胞組合物的體積。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述選擇的體積通過選擇所述干細胞袋中所述干細胞組合物的重量進行測定。
10.權(quán)利要求6的方法，其中所述收集骨髓的體積是約40mL-約240mL。
【文檔編號】C12M1/36GK103555559SQ201310484895
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2007年7月6日 優(yōu)先權(quán)日:2007年3月28日
【發(fā)明者】P.H.科埃略, B.A.貝克, J.R.查普曼, 李俊之, R.S.蔡爾德斯, P.埃曼努埃爾 申請人:熱起源公司