一種基于納米金標記的金黃色葡萄球菌可視化檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于納米金標記的金黃色葡萄球菌可視化檢測方法，將與金黃色葡萄球菌的目標DNA互補配對的且經(jīng)巰基修飾的DNA1和DNA2分別與10~14納米的納米金連接制成DNA1-適配體探針和DNA2-適配體探針，用DNA提取試劑盒提取待測物中的DNA,然后將DNA1-適配體探針和DNA2-適配體探針混勻后，加入待測物中的DNA，混勻，在90~95℃熱處理4~6分鐘后，降溫至37℃以下，在400~900納米進行UV-vis掃描，即可實現(xiàn)對待測物中的金黃色葡萄球菌的定量檢測。與現(xiàn)有技術相比，該方法靈敏度高、操作簡單、成本低。
【專利說明】一種基于納米金標記的金黃色葡萄球菌可視化檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種基于納米金標記的金黃色葡萄球菌可視化檢測方法。
【背景技術】
[0002]金黃色葡萄球菌在自然界中廣泛分布，可以引起食物中毒和胃腸炎等多種疾病。根據(jù)美國疾病預防與控制中心的統(tǒng)計，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒，占到整個細菌性食物中毒病例的33%，位居第二位，而加拿大則高達45%。傳統(tǒng)的檢測方法由于其操作復雜、特異性以及靈敏度不好的缺點，已經(jīng)無法滿足人們對于食品安全越來越高的要求了。因此，對于食品中金黃色葡萄球菌的快速、準確的檢測，越來越引起人們的關注。
[0003]傳統(tǒng)的檢測方法主要是應用國標法進行檢測，但是國標法需要較長的時間才能得到準確的檢測結果，無法滿足快速檢測的目的。目前快速檢測金黃色葡萄球菌的方法主要有紙片法、免疫學方法、分子生物學方法和生物傳感器檢測法等四種方法。其中免疫學的方法主要有免疫熒光法(IFA)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、免疫沉淀法、免疫層析法、免疫磁珠法、免疫印跡技術等。分子生物學的方法主要包括PCR技術、基因芯片等。這些方法各有其優(yōu)缺點，其中一些存在如成本較高、操作復雜、穩(wěn)定性差等問題，一定程度上限制了其推廣與應用。
[0004]因此，非常有必要開發(fā)一種成本較低、操作簡單、特異性強、靈敏度高、檢測時間較短的金黃色葡萄球菌的檢測技術。納米金由于具有獨特的光學、化學、電化學及催化性能，已被廣泛應用于生物學和化學傳感器的研究中。近年來，應用納米金及納米金的團聚對靶物質進行可視化檢測的報道越來越多，這些靶物質主要包括一些食源性致病菌、毒素、金屬離子、農藥殘留、食品非法添加劑等，納米金除了在檢測方面有著十分重要的應用外，在生命科學分析及癌癥的診斷與治療方面也有著非常廣泛的應用。但是，到目前為止，還沒有將納米金用于金黃色葡萄球菌的檢測`中。
【發(fā)明內容】
[0005]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種靈敏度高的基于納米金標記的金黃色葡萄球菌可視化檢測方法。
[0006]為解決以上技術問題，本發(fā)明采取如下技術方案:
[0007]一種基于納米金標記的金黃色葡萄球菌可視化檢測方法，將與金黃色葡萄球菌的目標DNA互補配對的且經(jīng)巰基修飾的DNAl和DNA2分別與10~14納米的納米金連接制成DNAl-適配體探針和DNA2-適配體探針，用DNA提取試劑盒提取待測物中的DNA，然后將所述的DNAl-適配體探針和DNA2-適配體探針混勻后，加入所述的待測物中的DNA，混勻，在90~95°C熱處理4~6分鐘后，降溫至37°C以下，在400~900納米進行UV-vis掃描，即可實現(xiàn)對待測物中的金黃色葡萄球菌的定量檢測。
[0008]具體地，所述的金黃色葡萄球菌的目標DNA序列為Y -CGA GGA TTT TCC MT GAGGTG GCC GA-3/ 。
[0009]具體地，所述的DNAl的序列為Y SH-TCG GCC ACC TCA T-3 ^，所述的DNA2的序列為 5' -TGG AAA ATC CTC G-3' SH。
[0010]具體地，所述的納米金的制備方法包括依次進行的如下步驟:
[0011](I)用王水對容器進行浸泡，然后用超純水對所述的浸泡后的容器進行清洗并烘干;
[0012](2)在所述的烘干后的容器中按體積比為100~125:1加入所述的超純水和質量百分濃度為2~3%氯金酸溶液，攪拌均勻后煮沸8~12分鐘，然后加入質量百分濃度為0.8~1.2%的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)煮沸8~12分鐘，其中所述的檸檬酸三鈉溶液與所述的氯金酸溶液的體積比為10~13:1 ;
[0013](3)停止加熱，繼續(xù)攪拌12~18分鐘，冷卻至10~40°C，即得所述的納米金。
[0014]具體地，所述的超純水的電阻率大于等于18.2ΜΩ.cm。
[0015]具體地，所述的DNAl-適配體探針制備方法包括依次進行的如下步驟:
[0016](I)將所述的納米金在3~5°C，13000~15000r/min離心30~40分鐘后，吸出
上清液；
[0017](2)將濃度為10_5mOl/L的DNAl加入到所述的上清液中，在35~40°C下?lián)u床孵育20~30小時，形成納米金-DNAl溶液，其中，所述的DNA1、上清液的體積比為1:45~55 ；
[0018](3)將十二烷基磺酸鈉(SDS)加入到所述的納米金-DNAl溶液中，然后再分多次加入0.8~1.2mol/L的NaCl，使所述的NaCl的終濃度達到0.3~0.4mol/L,每次加入所述的NaCl后，超聲處理8~12秒；
[0019](4)將經(jīng)步驟(3)處理后的納米金-DNAl溶液在35~40°C陳化20~30小時；
[0020](5)將經(jīng)步驟(4)陳化后的納米金-DNAl溶液在3~5°C 13000~15000r/min離心30~40分鐘，吸出上清液，再用IXPBS緩沖液溶解沉淀，如此重復離心多次，以去除未連接到納米金上的DNA，即得所述的DNAl-適配體探針。
[0021 ]具體地，所述的 I X PBS 緩沖液的配方為 0.lmol/L NaCl、IOmmoI/L Na2HPO4'IOmmoI/L NaH2PO4, pH 值為 7.4。
[0022]具體地，所述的DNA2-適配體探針的制備方法包括依次進行的如下步驟:
[0023](I)將所述的納米金在3~5°C，13000~15000r/min離心30~40分鐘后，吸出
上清液；
[0024](2)將濃度為10_5mOl/L的DNA2加入到所述的上清液中，在35~40°C下?lián)u床孵育20~30小時，形成納米金-DNA2溶液，其中，所述的DNA2、上清液的體積比為1:45~55 ；
[0025](3)將十二烷基磺酸鈉(SDS)加入到所述的納米金-DNA2溶液中，然后再分多次加入0.8~1.2mol/L的NaCl，使所述的NaCl的終濃度達到0.3~0.4mol/L,每次加入所述的NaCl后，超聲處理8~12秒；
[0026](4)將經(jīng)步驟(3)處理后的納米金-DNA2溶液在35~40°C陳化20~30小時；
[0027](5)將經(jīng)步驟(4)陳化后的納米金-DNA2溶液分別在3~5°C 13000~15000r/min離心30~40分鐘，吸出上清液，再用I XPBS緩沖液溶解沉淀，如此重復離心多次，以去除未連接到納米金上的DNA，即得所述的DNA2-適配體探針。
[0028]具體地，所述的I X PBS 緩沖液的配方為 0.lmol/L NaCl、IOmmoI/L Na2HPO4'IOmmoI/L NaH2PO4, pH 值為 7.4。
[0029]具體地，所述的DNAl-適配體探針、DNA2-適配體探針、待測物中的DNA的體積比為 1:1:4 ~10。
[0030]檢測原理:DNA1、DNA2和金黃色葡萄球菌的目標DNA是完全互補配對的，當檢測體系中出現(xiàn)金黃色葡萄球菌的目標DNA時，DNAU DNA2就會與金黃色葡萄球菌目標DNA雜交在一起，從而使納米金之間的距離拉近，由于納米金的顏色具有光距離依賴特性，因此就會引起納米金顏色的變化；目標DNA濃度不同，納米金聚集的程度也就不同，從而導致納米金溶液呈現(xiàn)出不同顏色的變化，由此實現(xiàn)金黃色葡萄球菌的可視化檢測。
[0031]由于以上技術方案的實施，本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有如下優(yōu)點:
[0032]本發(fā)明對金黃色葡萄球菌的目標DNA的檢測限為0.5pmol/L,在I~1000pmol/L范圍內線性良好(R2=0.9921);對金黃色葡萄球菌的檢測限達到了 25cfu/mL，而且在30~9800cfu/mL范圍內線性良好(R2=0.9958)，因此，本發(fā)明中的檢測方法靈敏度高；并且本發(fā)明中的DNAl-適配體探針、DNA2-適配體探針易于制備，因此本發(fā)明操作簡單，且成本較低。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0033]圖1是納米金的透射電鏡圖；
[0034]圖2是納米金的紫外-可見吸收圖譜；
[0035]圖3是特異性實驗，其中，a為金黃色葡萄球菌，b為鼠傷寒沙門氏菌，c為大腸桿菌，d為單增李斯特菌，e為阪崎桿菌；
[0036]圖4是檢測金黃色葡萄球菌的目標DNA的標準曲線，其中，橫坐標的單位為pmol/L ；
[0037]圖5是檢測金黃色葡萄球菌的標準曲線，其中，橫坐標的單位為lOcfu/mL。
【具體實施方式】
[0038]下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細的說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。實施例中采用的實施條件可以根據(jù)具體使用的不同要求做進一步調整，未注明的實施條件為本行業(yè)中的常規(guī)條件。
[0039]實施例1
[0040]1、合成金黃色葡萄球菌的目標DNA及巰基修飾的與金黃色葡萄球菌的目標DNA互補配對的DNAl和DNA2 (購自上海生工生物工程股份有限公司)
[0041]金黃色葡萄球菌的目標DNA:5' -CGA GGA TTT TCC AAT GAG GTG GCC GA-3'；
[0042]短連DNAl 序列:5' SH-TCG GCC ACC TCA T-3'；
[0043]短連DNA2 序列:5' -TGG AAA ATC CTC G_3' SH ；
[0044]2、制備納米金
[0045]I)用王水(體積比為3:1的濃鹽酸和濃硝酸)浸泡相關容器，再用超純水清洗，烘干;
[0046]2)在容器中加入99.16mL超純水(電阻率≥18.2ΜΩ)和0.84mL2.5%氯金酸溶液，用轉子攪拌均勻，煮沸IOminJPA 10mLl%的檸檬酸三鈉溶液，溶液立即變?yōu)樯钏{黑色，繼續(xù)煮沸IOmin ；[0047]3)停止加熱，持續(xù)攪拌15min，在室溫下冷卻，得到了酒紅色的納米金溶液，并通過透射電子顯微鏡以及紫外-可見吸收圖譜對所制備的納米金進行表征，表征圖譜參見圖1和圖2。
[0048]3、制備DNAl-適配體探針
[0049]取ImL納米金置于1.5mL離心管中，4°C 14000r/min離心35min,吸出500 μ L的上清液，取10 μ L濃度為10_5mOl/L的DNAl加入到上清液中，37°C搖床孵育24h ;將5mg SDS加入到納米金-DNAl溶液中，逐次加入lmol/L的NaCl，使NaCl的終濃度達到0.36mol/L，每次加入NaCl后，超聲處理IOs左右；然后在37°C陳化24h ;再在4°C，HOOOrpm離心35min，吸出上清液，再用 I XPBS (0.lmol/L NaCl, 10mmol/L Na2HP04/NaH2P04, pH7.4)溶解沉淀，如此重復2次，以去除未連接到納米金上的DNA，保存在4°C條件下備用。
[0050]4、DNA2-適配體探針的制備方法和DNAl-適配體探針的制備方法相同
[0051]5、提取 DNA
[0052]利用成品試劑盒提取金黃色葡萄球菌的目標DNA。
[0053]6、金黃色葡萄球菌的檢測
[0054]分別取50 μ L制備好的DNAl-適配體探針和DNA2-適配體探針，置于無菌的離心管中，混勻，再加入10 μ L不同濃度的金黃色葡萄球菌的目標DNA，混勻，95°C熱處理5min，然后放置于4°C環(huán)境中；觀察顏色變化并在400~900nm進行UV-vis掃描，根據(jù)A700/A525的值和金黃色葡萄球菌的目標DNA的濃度繪制出金黃色葡萄球菌的目標DNA的標準曲線，參見圖4 ;根據(jù)A700/A525的值和金黃色葡萄球菌的菌落個數(shù)繪制出金黃色葡萄球菌的標準曲線，參見圖5。
[0055]實施例2
[0056]分別提取金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、單增李斯特菌、阪崎桿菌的DNA，并將上述5種DNA以相同的濃度加入到DNAl-適配體探針和DNA2-適配體探針的混合液中，其他條件均與實施例1相同，實驗數(shù)據(jù)參見圖3。
[0057]實施例3
[0058]對市售的無菌奶進行加標回收實驗，實驗方法如實施例1所述，實驗結果參見表1，表1為牛奶中金黃色葡萄球菌的檢測回收率(n=5)。
[0059]表1
[0060]
【權利要求】
1.一種基于納米金標記的金黃色葡萄球菌可視化檢測方法，其特征在于:將與金黃色葡萄球菌的目標DNA互補配對的且經(jīng)巰基修飾的DNAl和DNA2分別與10~14納米的納米金連接制成DNAl-適配體探針和DNA2-適配體探針，用DNA提取試劑盒提取待測物中的DNA,然后將所述的DNAl-適配體探針和DNA2-適配體探針混勻后，加入所述的待測物中的DNA，混勻，在90~95°C熱處理4~6分鐘后，降溫至37°C以下，在400~900納米進行UV-vis掃描，即可實現(xiàn)對待測物中的金黃色葡萄球菌的定量檢測。
2.根據(jù)權利要求1所述的可視化檢測方法，其特征在于:所述的金黃色葡萄球菌的目標 DNA 序列為 5' -CGA GGA TTT TCC AAT GAG GTG GCC GA-3'。
3.根據(jù)權利要求1所述的可視化檢測方法，其特征在于:所述的DNAl的序列為5' SH-TCG GCC ACC TCA T-3/，所述的 DNA2 的序列為 5' -TGG AAA ATC CTC G-3/ SH。
4.根據(jù)權利要求1所述的可視化檢測方法，其特征在于:所述的納米金的制備方法包括依次進行的如下步驟: (1)用王水對容器進行浸泡，然后用超純水對所述的浸泡后的容器進行清洗并烘干； (2)在所述的烘干后的容器中按體積比為100~125:1加入所述的超純水和質量百分濃度為2~3%氯金酸溶液，攪拌均勻后煮沸8~12分鐘，然后加入質量百分濃度為0.8~1.2%的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)煮沸8~12分鐘，其中所述的檸檬酸三鈉溶液與所述的氯金酸溶液的體積比為10~13:1 ; (3)停止加熱，繼續(xù)攪拌12~18分鐘，冷卻至10~40°C，即得所述的納米金。
5.根據(jù)權利要求4所述的可視化檢測方法，其特征在于:所述的超純水的電阻率大于等于 18.2M Ω.cm。
6.根據(jù)權利要求1所述的可視化檢測方法，其特征在于:所述的DNAl-適配體探針制備方法包括依次進行的如下步驟`: (1)將所述的納米金在3~5°C，13000~15000r/min離心30~40分鐘后，吸出上清液； (2)將濃度為10_5mOl/L的DNAl加入到所述的上清液中，在35~40°C下?lián)u床孵育20~30小時，形成納米金-DNAl溶液，其中，所述的DNA1、上清液的體積比為1:45~55 ； (3)將十二烷基磺酸鈉加入到所述的納米金-DNAl溶液中，然后再分多次加入0.8~1.2mol/L的NaCl，使所述的NaCl的終濃度達到0.3~0.4mol/L,每次加入所述的NaCl后，超聲處理8~12秒； (4)將經(jīng)步驟(3)處理后的納米金-DNAl溶液在35~40°C陳化20~30小時； (5)將經(jīng)步驟(4)陳化后的納米金-DNAl溶液在3~5°C13000~15000r/min離心30~40分鐘，吸出上清液，再用IXPBS緩沖液溶解沉淀，如此重復離心多次，以去除未連接到納米金上的DNA，即得所述的DNAl-適配體探針。
7.根據(jù)權利要求6所述的可視化檢測方法，其特征在于:所述的IXPBS緩沖液的配方為 0.lmol/L NaClUOmmol/L Na2HPO4、IOmmoI/L NaH2PO4, pH 值為 7.4。
8.根據(jù)權利要求1所述的可視化檢測方法，其特征在于:所述的DNA2-適配體探針的制備方法包括依次進行的如下步驟: (I)將所述的納米金在3~5°C，13000~15000r/min離心30~40分鐘后，吸出上清液；(2)將濃度為10_5mOl/L的DNA2加入到所述的上清液中，在35~40°C下?lián)u床孵育20~`30小時，形成納米金-DNA2溶液，其中，所述的DNA2、上清液的體積比為1:45~55 ； (3)將十二烷基磺酸鈉加入到所述的納米金-DNA2溶液中，然后再分多次加入0.8~`1.2mol/L的NaCl，使所述的NaCl的終濃度達到0.3~0.4mol/L,每次加入所述的NaCl后，超聲處理8~12秒； (4)將經(jīng)步驟(3)處理后的納米金-DNA2溶液在35~40°C陳化20~30小時； (5)將經(jīng)步驟(4)陳化后的納米金-DNA2溶液分別在3~5°C13000~15000r/min離心30~40分鐘，吸出上清液，再用I XPBS緩沖液溶解沉淀，如此重復離心多次，以去除未連接到納米金上的DNA，即得所述的DNA2-適配體探針。
9.根據(jù)權利要求8所述的可視化檢測方法，其特征在于:所述的IXPBS緩沖液的配方為 0.lmol/L NaClUOmmol/L Na2HPO4、IOmmoI/L NaH2PO4, pH 值為 7.4。
10.根據(jù)權利要求1所述的可視化檢測方法，其特征在于:所述的DNAl-適配體探針、DNA2-適配體探針、待測物`中的DNA的體積比為1: 1:4~10。
【文檔編號】C12Q1/68GK103555832SQ201310481326
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月15日 優(yōu)先權日:2013年10月15日
【發(fā)明者】俞曄, 王周平, 袁京磊, 杜國興, 周強, 王玥 申請人:中華人民共和國張家港出入境檢驗檢疫局, 江南大學