一種具有抗菌功能的融合蛋白及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種具有抗菌功能的融合蛋白及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，所述融合蛋白由經(jīng)修飾的小鼠Reg3α抗菌蛋白和6個(gè)組氨酸組成，是含有SEQ?ID?NO.1所示氨基酸序列的肽，其構(gòu)建方法是將Reg3α與表達(dá)質(zhì)粒pwPICZalpha連接構(gòu)成重組表達(dá)質(zhì)粒pwPICZalpha-Reg3α，線性化后整合到畢赤酵母基因組中，挑取陽(yáng)性克隆誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)而以ProteinPureNi-NTA樹(shù)脂和強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂純化得到。本發(fā)明構(gòu)建的融合蛋白具有抗staphylococcus的能力，可用于生產(chǎn)動(dòng)物飼養(yǎng)用抗菌蛋白。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種具有抗菌功能的融合蛋白及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種融合蛋白，特別是涉及一種利用基因工程重組技術(shù)構(gòu)建的Reg3 a 融合蛋白，以及該融合蛋白的構(gòu)建方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]Reg3 a (Regenerating islet-derived protein 3 alpha)屬于 C 型凝集素超家族，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性耐藥細(xì)菌具有顯著的直接殺傷和抑制效果，其主要依賴(lài)C端結(jié)構(gòu)域與細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的結(jié)合作用，以補(bǔ)體殺傷的模式對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁進(jìn)行作用。在組織受損的狀態(tài)下，Reg3 a的表達(dá)不僅能促進(jìn)細(xì)胞的增殖，而且能防止傷口感染，有助于傷口愈合。另外，Reg3a對(duì)于急性炎癥的發(fā)生具有一定的抑制作用，能緩解炎癥因子的過(guò)度產(chǎn)生所造成的組織損傷。綜上所述，Reg3a具有抑制病原微生物生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞增殖以及抑制損傷部位炎癥因子過(guò)表達(dá)的功能，有望成為治療感染、炎癥和組織受損的新型藥物。
[0003]畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)是上世紀(jì)80年代初期發(fā)展起來(lái)的一種新型的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，它既具有原核表達(dá)系統(tǒng)操作簡(jiǎn)易、易于培養(yǎng)、生長(zhǎng)速度快、表達(dá)量高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，還具有原核生物表達(dá)系統(tǒng)所不具有的對(duì)外源蛋白的翻譯后修飾等特點(diǎn)， 如糖基化、蛋白磷酸化等，同時(shí)還避免了釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)分泌效率差、表達(dá)菌株不夠穩(wěn)定、表達(dá)質(zhì)粒易丟失等缺陷。除此之外，由于其在蛋白質(zhì)表達(dá)方面還具有以下幾個(gè)其它表達(dá)系統(tǒng)所不可比擬的優(yōu)點(diǎn)，使得該系統(tǒng)成為目前研究最多、應(yīng)用最廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng)之一:1)它所攜帶的aox啟動(dòng)子是一種強(qiáng)有力的啟動(dòng)子，受甲醇嚴(yán)格誘導(dǎo)調(diào)控而表達(dá)，所以可嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá)；2)可以對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行糖基化、蛋白磷酸化、折疊、信號(hào)序列加工、脂類(lèi)?；纫幌盗械姆g后修飾，從而使其表達(dá)的蛋白具有生物活性；3)表達(dá)量高，迄今為止，已有300多種異源蛋白在該表達(dá)系統(tǒng)中獲得了高效表達(dá)，如破傷風(fēng)毒素片段C可達(dá)12g/L，而明膠的表達(dá)量甚至達(dá)到了 14.8g/L ;4)外源基因的表達(dá)產(chǎn)物既可存在于胞內(nèi)，又可通過(guò)其特有的信號(hào)肽a -因子或天然蛋白本身的信號(hào)肽分泌至細(xì)胞外，同時(shí)，該系統(tǒng)自身分泌的蛋白非常少，這大大簡(jiǎn)化了純化過(guò)程；5)整合入外源基因的重組子表達(dá)系統(tǒng)十分穩(wěn)定，有文獻(xiàn)報(bào)道，通過(guò)同源重組整合入外源基因的重組子表達(dá)系統(tǒng)可連續(xù)培養(yǎng)50代，卻未見(jiàn)外源基因丟失的現(xiàn)象；6)糖基化程度低，畢 赤酵母中加到外源蛋白每條側(cè)鏈的平均長(zhǎng)度為8-14個(gè)甘露糖殘基，較之釀酒酵母每條側(cè)鏈平均50-150甘露糖殘基要短得多，同時(shí)，由于畢赤酵母不能象釀酒酵母那樣在核心多糖末端形成a -1, 3末端甘露糖，使得它的蛋白抗原性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于后者，因而更適合于治療用途；7)該表達(dá)系統(tǒng)由于對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求低，培養(yǎng)基成份簡(jiǎn)單廉價(jià)，可進(jìn)行高密度高產(chǎn)量的發(fā)酵培養(yǎng)，便于工業(yè)化生產(chǎn)。利用畢赤酵母構(gòu)建的高效表達(dá)系統(tǒng)能夠顯著提高蛋白的產(chǎn)量，從而降低蛋白的生產(chǎn)成本，對(duì)蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0004]
【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明的目的是提供一種具有抗菌功能的融合蛋白，以及所述融合蛋白的構(gòu)建方法和應(yīng)用。[0005]本發(fā)明的融合蛋白是由經(jīng)過(guò)修飾的小鼠Reg3 a抗菌蛋白和6個(gè)組氨酸組成，所述融合蛋白是含有SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的肽。
[0006]上述融合蛋白的基因由編碼小鼠Reg3 a成熟肽的cDNA序列、6個(gè)組氨酸cDNA序列、限制性?xún)?nèi)切酶Xho I和EcoR I位點(diǎn)的cDNA序列以及符合畢赤酵母表達(dá)偏好性的基因序列組成，所述融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0007]本發(fā)明所述Reg3 a融合蛋白的構(gòu)建方法包括如下步驟:1).表達(dá)載體的構(gòu)建:SEQID N0.2所示人工合成的Reg3 a基因序列上設(shè)計(jì)有限制性?xún)?nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，將Reg3a基因序列與表達(dá)質(zhì)粒pwPICZalpha以同樣的限制性?xún)?nèi)切酶酶切后連接在一起，通過(guò)雙酶切檢測(cè)，篩選出含有Reg3 a基因序列的重組表達(dá)質(zhì)粒 pwPICZalpha-Reg3a ；
2).酵母表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建:使用限制性?xún)?nèi)切酶線性化口《?102&1?1^-1?叩3[1，通過(guò)電轉(zhuǎn)化方法將Reg3 a基因序列整合到畢赤酵母基因組中，將轉(zhuǎn)化后的菌體懸液涂布于含有 Zeocin的YH)平板上，30°C培養(yǎng)誘導(dǎo)篩選單菌落出現(xiàn)，挑取單菌落進(jìn)行小劑量誘導(dǎo)表達(dá)， SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)上清確認(rèn)陽(yáng)性克??；
3).融合蛋白的純化和活性檢測(cè):挑選陽(yáng)性克隆菌落進(jìn)行大劑量誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)上清采用ProteinPure N1-NTA樹(shù)脂和強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂純化，通過(guò)SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)純化的融合蛋白。
[0008]本發(fā)明Reg3a是一種優(yōu)良的抗菌蛋白，抑菌圈實(shí)驗(yàn)檢測(cè)融合蛋白的抗菌活性具有紙staphylococcus的能力，這些特點(diǎn)使得Reg3 a可以作為抗生素的候選替代品來(lái)進(jìn)行研究。
[0009]本發(fā)明即是基于上述抗菌蛋白和畢赤酵母的優(yōu)點(diǎn)，以畢赤酵母表達(dá)基因工程抗菌蛋白，能夠大量生產(chǎn)動(dòng)物飼養(yǎng)所急需的、可以替代抗生素的動(dòng)物自身基因表達(dá)的抗菌蛋白， 為市場(chǎng)提供無(wú)毒無(wú)害、健康的綠色產(chǎn)品。并且對(duì)抗菌蛋白的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用將產(chǎn)生很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和巨大的社會(huì)效益。
[0010]【專(zhuān)利附圖】
【附圖說(shuō)明】
圖1 是 ProteinPure N1-NTA 樹(shù)脂純化 Reg3 a 的 SDS-PAGE 電泳圖。
[0011]圖2是強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂純化Reg3 a的SDS-PAGE電泳圖。
[0012]圖3是重組Reg3 a的Western blot分析圖。
[0013]圖4是重組Reg3a的抑菌效果圖，圖中:1)氨芐青霉素；2)PBS ;3)重組Reg3 a。 【具體實(shí)施方式】
[0014]1、所用試劑及其配制
(I)LB (Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基:取蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 5g，溶解于800mL ddH20 中，IOM NaOH 調(diào)節(jié) pH 至 7.0，定容至 1000mL,高壓滅菌(121°C，1.034X 105Pa)20min,4°C保存。
[0015](2) LB (Luria-Bertani)固體培養(yǎng)基:按每 10OOmT, ddH20 加 15g 瓊脂粉，向 LB 液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉，高壓滅菌，4°C保存。
[0016](3)貯備液:
IOXYNB (13.4%，含硫酸銨而不含氨基酸):將34g YNB和100g硫酸銨熱溶于1000mLddH20中，過(guò)濾除菌，4°C保存。
[0017]500 X生物素(0.02%):20mg生物素溶于IOOmL ddH20中，過(guò)濾除菌，4°C保存。
[0018]IOX葡萄糖(20%):200g葡萄糖溶于1000mL ddH20中，高壓滅菌,4°C保存。
[0019]IOX甲醇(5%甲醇):5mL甲醇與95mL ddH20混勻，過(guò)濾除菌，4°C保存。
[0020]IOX甘油(10%甘油MOOmL甘油與900mL ddH20混勻，過(guò)濾除菌或高壓滅菌，室溫保存。
[0021]IM 磷酸氫二鉀緩沖液，pH=7.0:132mL IM K2HPO4 與 868mL IM KH2PO4 混合，高壓滅菌，室溫保存。
[0022]10 X酸水解酪素(10%酸水解酪素):100g酸水解酪素溶于1000mL ddH20中，高壓滅菌，4°C保存。
[0023](4) YPD培養(yǎng)基(1.0%酵母提取物、2.0%蛋白胨、2.0%葡萄糖):IOg酵母提取物、 20g蛋白胨溶于900mL ddH20中，加入20g瓊脂制YTO板，高壓滅菌，再加IOOmL IOX葡萄
糖，4°C保存?zhèn)溆谩?br>
[0024](5) YPG培養(yǎng)基(1.0%酵母提取物、2.0%蛋白胨、1.0%甘油):IOg酵母提取物、20g 蛋白胨溶于900mL ddH20中，高壓滅菌，再加IOOmL IOX甘油，4°C保存?zhèn)溆谩?br>
[0025](6) BMMYC 培養(yǎng)基(1.34%YNB、4X 10、生物素、0.5% 甲醇、1.0% 酵母提取物、2.0% 蛋白胨、1.0%酸水解酪素):1Og酵母提取物、20g蛋白胨溶于600mL ddH20中，高壓滅菌，冷卻至室溫，加IOOmL IM磷酸氫二鉀緩沖液，pH=7.0、100mL 10XYNB、2mL 500X生物素、IOOmL IOX甲醇、IOOmL IOX酸水解酪素混勻，4°C保存。
[0026]2、Reg3a基因序列的優(yōu)化和犾得
根據(jù)NCBI登陸的小鼠Reg3 a基因序列(Gene ID: 19694)和酵母菌密碼子偏好性，對(duì) Reg3a的基因序列進(jìn)行優(yōu)化，為了便于純化，在C端加入6個(gè)組氨酸(6XHis tag)，在序列的5’和3’端引入Xho I和EcoR I兩個(gè)酶切位點(diǎn)。優(yōu)化后的Reg3 a基因序列由Invitrogen 公司合成，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0027]3、表達(dá)載體的構(gòu)建
利用Xho I和EcoR I兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)合成的Reg3 a和質(zhì)粒pwPICZalpha進(jìn)行雙酶切，酶切后產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳并采用膠回收試劑盒回收DNA片段并進(jìn)行連接。
[0028]用Xho I和EcoR I對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切鑒定，驗(yàn)證基因片段正確插入，該重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pwPICZalpha_Reg3 a。
[0029]在無(wú)菌Eppendorf管中7 ii L雙酶切的目的基因片段，Iii L雙酶切的質(zhì)粒，Iii L T4 連接酶，I UL連接酶緩沖液，混勻，4°C連接12h ;將IOii L連接產(chǎn)物加入到90 ii L感受態(tài)大腸桿菌T0P10中，混勻，42°C熱激90s轉(zhuǎn)化，加入400iiL LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)lh， 將菌液涂布在Zeocin抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。從轉(zhuǎn)化的平板上挑取6個(gè)菌落接種到含Zeocin的5mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。
[0030]4、融合蛋白的表達(dá) I)小劑量誘導(dǎo)表達(dá)
利用限制性?xún)?nèi)切酶Sac I將5-10 u g重組表達(dá)質(zhì)粒pwPICZalpha-Reg3 a進(jìn)行線性化， 采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收線性化的pwPICZalpha-Reg3 a，加入到90 y L感受態(tài)畢赤酵母X-33中，混勻，冰浴5min后電擊轉(zhuǎn)化，加入ImL山梨醇后，30°C放置2h，將菌液涂布在 Zeocin抗性的YPD固體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)3_4d。從轉(zhuǎn)化的平板上挑取6個(gè)菌落接種到含 Zeocin的5mL YPD液體培養(yǎng)基中，30°C 250rpm培養(yǎng)24h，3500rpm離心，棄上清后加入5mL YPG液體培養(yǎng)基，300C 250rpm培養(yǎng)24h，3500rpm離心棄掉上清，加入2mL BMMYC液體培養(yǎng)基，270C 225rpm培養(yǎng)48h，每隔12h補(bǔ)充一次甲醇，使甲醇濃度維持在0.5%。3500rpm離心后收集上清液，SDS-PAGE分析上清液。
[0031]2)大劑量誘導(dǎo)表達(dá)
挑取一個(gè)陽(yáng)性菌落接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，30°C 250rpm培養(yǎng)24h作為種子培養(yǎng)液， 取13mL種子培養(yǎng)液接種到250mL YPD液體培養(yǎng)基中，30°C 250rpm培養(yǎng)24h，30°C 250rpm培養(yǎng)24h，3500rpm離心，棄上清后加入250mL YPG液體培養(yǎng)基，30°C 250rpm培養(yǎng)24h，3500rpm 離心棄掉上清，加入125mL BMMYC液體培養(yǎng)基，27°C 225rpm培養(yǎng)48h，每隔12h補(bǔ)充一次甲醇，使甲醇濃度維持在0.5%。3500rpm離心后收集上清液，SDS-PAGE分析上清液。
[0032]5、融合蛋白的純化
I) ProteinPure N1-NTA 樹(shù)脂純化
在誘導(dǎo)表達(dá)的上清液中加入終濃度為50mM磷酸鈉，0.3M氯化鈉，IOmM咪唑和IOmM pH 8.0 Tris-HCl，用 0.45 y m 濾器過(guò)濾。取 IOmL ProteinPure N1-NTA 樹(shù)脂裝入 XK16/20 層
析柱中，柱子裝好后與恒流泵相連，用10倍體積的Buffer I干衡柱子，平衡好后上樣，上樣結(jié)束后用8倍體積的Buffer I沖洗柱子，再用8倍體積的Buffer II洗脫目的蛋白并收集到8個(gè)不同的管中，整個(gè)過(guò)程的流速為5mL/min。用SDS-PAGE對(duì)純化的蛋白進(jìn)行分析，圖1 中的SDS-PAGE結(jié)果顯示，目的蛋白集中在Buffer n的2號(hào)和3號(hào)管中。將含有目的蛋白的Buffer II混合，裝入3.5kDa透析袋中，在4°C條件下用含有20mM Tris-HCl pH 8.0, ImM EDTA pH8.0，5%甘油的透析液透析8h，每隔4h換一次透析液。
[0033]2)強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂純化
取IOmL強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂裝入HQ6/20層析柱中，柱子裝好后與恒流泵連接，用10倍體積的Buffer III平衡柱子，將透析好的樣品上樣，上樣結(jié)束后用8倍體`積的Buffer III沖洗柱子，再分別用8倍體積的Buffer r和Buffer V洗脫目的蛋白，并將洗脫液收集到8 個(gè)不同的管中，整個(gè)過(guò)程的流速為5mL/min。用SDS-PAGE對(duì)純化的蛋白進(jìn)行分析，由圖2可知目的蛋白集中在Buffer IV的1、2、3、4和5管中。將含有目的蛋白的Buffer Bf混合， 采用超濾濃縮的方法對(duì)目的蛋白進(jìn)行濃縮，然后裝入3.5kDa的透析袋中，在4°C條件下用含有5%甘油的PBS透析8h，每隔4 h換一次PBS。用BCA試劑盒測(cè)定目的蛋白濃度，蛋白濃度為lmg/mL，說(shuō)明該蛋白基因在畢赤酵母中得到高效表達(dá)。利用抗His標(biāo)簽抗體對(duì)該蛋白進(jìn)行western blot分析，由圖3結(jié)果確證其為所要表達(dá)的蛋白。
[0034]4、抑菌實(shí)驗(yàn)
將100 u L葡萄球菌涂到LB固體培養(yǎng)上，在平板打4個(gè)直徑為5mm的孔，在孔中分別加 A 50 u L Reg3 a (lmg/mL)、氨節(jié)青霉素(100mg/mL)和PBS, 37°C培養(yǎng)12h,觀察并記錄抑菌效果。
[0035]抑菌效果見(jiàn)圖4，由圖中可以看出重組Reg3a能夠有效抑制葡萄球菌的生長(zhǎng)，表明重組Reg3 a能夠作為潛在的抗菌藥物進(jìn)行進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)研究。[0036]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對(duì)本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、`等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種具有抗菌功能的融合蛋白，所述融合蛋白由經(jīng)過(guò)修飾的小鼠Reg3a抗菌蛋白和6個(gè)組氨酸組成，為SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗菌功能的融合蛋白，所述融合蛋白的核苷酸序列如 SEQ ID N0.2 所示。
3.權(quán)利要求1具有抗菌功能的融合蛋白的構(gòu)建方法，包括如下步驟:1)表達(dá)載體的構(gòu)建:SEQID N0.2所示人工合成的Reg3 a基因序列上設(shè)計(jì)有限制性?xún)?nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，將Reg3a基因序列與表達(dá)質(zhì)粒pwPICZalpha以同樣的限制性?xún)?nèi)切酶酶切后連接在一起，通過(guò)雙酶切檢測(cè)，篩選出含有Reg3 a基因序列的重組表達(dá)質(zhì)粒 pwPICZalpha-Reg3a ；2)酵母表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建:使用限制性?xún)?nèi)切酶線性化口《?102&1?1^-1?叩3[1，通過(guò)電轉(zhuǎn)化方法將Reg3a基因序列整合到畢赤酵母基因組中，將轉(zhuǎn)化后的菌體懸液涂布于含有 Zeocin的YH)平板上，30°C培養(yǎng)誘導(dǎo)篩選單菌落出現(xiàn)，挑取單菌落進(jìn)行小劑量誘導(dǎo)表達(dá)， SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)上清確認(rèn)陽(yáng)性克??；3)融合蛋白的純化和活性檢測(cè):挑選陽(yáng)性克隆菌落進(jìn)行大劑量誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)上清采用ProteinPure N1-NTA樹(shù)脂和強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂純化，通過(guò)SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)純化的融合蛋白。
4.權(quán)利要求1具有抗菌功能`的融合蛋白作為抗用抗生素的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/62GK103554267SQ201310481238
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月15日
【發(fā)明者】范闊海, 王志瑞, 姜俊兵, 李宏全 申請(qǐng)人:山西農(nóng)業(yè)大學(xué)