一種普魯蘭酶突變體及其制備方法【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有高比活和高熱穩(wěn)定性普魯蘭酶突變體及其制備方法，所述突變體包括一個、兩個或三個相對于脫支芽孢桿菌普魯蘭酶活性氨基酸殘基的取代、與普魯蘭酶的熱穩(wěn)定性相關(guān)；所述活性氨基酸殘基包括第503位的天冬氨酸，可以分別突變成精氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸，上述突變提高了普魯蘭酶比活力和熱穩(wěn)定性，至少以下性質(zhì)之一發(fā)生改變：1）最適反應溫度提高；2）在pH4.0-5.0熱穩(wěn)定性提高；3）在pH4.0-5.0比活力提高。這些突變體比野生型普魯蘭酶更適用于淀粉糖化生產(chǎn)過程。【專利說明】一種普魯蘭酶突變體及其制備方法[0001]本申請是專利號為:201210256804.9，申請日為:2012年7月23日，
專利名稱：為:一種普魯蘭酶突變體及其制備方法的分案申請?！?br>技術(shù)領(lǐng)域：
】[0002]本發(fā)明涉及一種普魯蘭酶的突變體及其制備方法，特別是利用蛋白質(zhì)工程的定點突變方法來提高普魯蘭酶的比活力和熱穩(wěn)定性的技術(shù)，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域?！?br>背景技術(shù)：
】[0003]普魯蘭酶(Pullulanase，EC3.2.1.41)是一種脫支酶，能夠?qū)Ｒ恍郧虚_普魯蘭多糖、可溶性淀粉、支鏈淀粉和一些寡聚糖中的α-1，6_糖苷鍵，應用于淀粉加工工業(yè)中，可極大提高淀粉的利用率和生產(chǎn)效率。普魯蘭酶主要用于和糖化酶復配制備葡萄糖。由于糖化酶對支鏈糊精中α-1，6-糖苷鍵切割效率很低，導致糖化時間長、葡萄糖收率低、生產(chǎn)成本高。而普魯蘭酶可以切斷淀粉中的分支點，加速糖化反應，縮短糖化反應時間，提高葡萄糖得率，降低糖化酶的使用量，從而達到增加產(chǎn)量、提高設(shè)備利用率、降低生產(chǎn)成本的目的。[0004]為了與糖化酶更好的協(xié)同作用，普魯蘭酶的最適pH、溫度和熱穩(wěn)定性是其能否應用于淀粉糖化生產(chǎn)的關(guān)鍵。工業(yè)生產(chǎn)中為了發(fā)揮糖化酶的最大效率，減少糖化過程中染菌幾率，糖化過程一般在高溫、低pH值下進行，糖化過程溫度和pH控制在60°C和pH4.5，糖化時間一般48h左右。因此，普魯蘭酶必須具備在60°C和pH4.5條件下保留較高的活性和良好的穩(wěn)定性才能滿足糖化過程的需要。近年來國內(nèi)外學者把普魯蘭酶的開發(fā)研究作為非常重要的研究主題。國外學者從極端嗜熱微生物中分離出具有可以耐受接近100°C高溫的普魯蘭酶，但是這些酶往往只有在PH6.0以上才具有較高的活性。國內(nèi)主要研究了產(chǎn)普魯蘭酶野生菌的篩選鑒定、重組菌構(gòu)建、發(fā)酵條件優(yōu)化以及在淀粉原料酶解中的應用。蘇品等實現(xiàn)了來源于Thermotogamaritima的普魯蘭酶編碼基因在枯草芽孢桿菌中的成功表達，該酶最適溫度90°C，最適pH6.0，發(fā)酵酶活可達89.lU/mL(ZheSu,Fu-PingLu，QiangGaojXiao-GuangLiujBin-ZheWang,TaoNiu.CloningandexpressionofathermostablepullulanasegenefromThermotogamaritimaMSB8inBacillussubtilisWB600.2010全國生物材料大會論文集，2010，141-144.)。目前能夠與糖化酶進行較好配合的商品化淀粉脫支酶主要是美國杰能科公司的OptimaxL-1000。我國雖然對普魯蘭酶進行了大量的研究，但是還沒有實現(xiàn)該酶的工業(yè)化生產(chǎn)，仍然依賴進口。[0005]發(fā)明人前期克隆并表達了來源于脫支芽孢桿菌(Bacillusderamifican)的普魯蘭酶(NCBI登錄號:AX203845)，該酶最適pH4.5，最適溫度55°C，在pH4.5、60°C條件下半衰期為23h。通過與糖化酶復配應用實驗，發(fā)現(xiàn)其能夠與糖化酶復配并提高葡萄糖得率。但是該酶在最適溫度和熱穩(wěn)定性還不能完全滿足糖化過程的需要，且催化效率偏低。因此，進一步提高該酶的最適溫度、熱穩(wěn)定性及催化效率將賦予其在工業(yè)上更好的應用潛能?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0006]本發(fā)明所要解決的一個技術(shù)問題是提供一種普魯蘭酶的突變體，包括含有括一個、兩個或三個相對于脫支芽孢桿菌的普魯蘭酶活性氨基酸殘疾的取代，與親本普魯蘭酶相比有更高比活力和熱穩(wěn)定性。[0007]所述脫支芽孢桿菌普魯蘭酶的親本基因與NCBI數(shù)據(jù)庫中的脫支芽孢桿菌普魯蘭酶一致(登錄號:AX203845)。[0008]所述的突變體是將親本普魯蘭酶基因中第437位的天冬氨酸(Asp)突變成了組氨酸(His)，命名為D437H;將普魯蘭酶基因中第503位的天冬氨酸(Asp)分別突變成了精氨酸(Arg)，苯丙氨酸(Phe)，色氨酸(Trp)或酪氨酸(Tyr)分別命名為D503R，D503F,D503W及D503Y;將普魯蘭酶基因中第589位的谷氨酸(Glu)突變成了酪氨酸(Tyr)，命名為E589Y。[0009]所述的突變體是將單突變體酶D437H基因中第503位的天冬氨酸(Asp)突變成了苯丙氨酸(Phe)，色氨酸(Trp)或酪氨酸(Tyr)，分別命名為D437H/D503F，D437H/D503W,D437H/D503Y;將單突變體酶D437H基因中第589位的谷氨酸(Glu)突變成了酪氨酸(Tyr)，命名為D437H/D589Y。[0010]所述的突變體是在雙突變體酶D437H/D503Y基因中第589位的谷氨酸(Glu)突變成了酪氨酸(Tyr)，命名為D437H/D503Y/D589Y。[0011]本發(fā)明所要解決的的另一個技術(shù)問題是提供提高來源于脫支芽孢桿菌普魯蘭酶(NCBI登錄號:AX203845)突變體的比活和熱穩(wěn)定性的制備方法，包括如下步驟:[0012]I)在脫支芽孢桿菌普魯蘭酶氨基酸序列的基礎(chǔ)上確定突變位點；設(shè)計定點突變的突變引物，設(shè)計定點突變的突變引物，以攜帶普魯蘭酶基因的載體為模板進行定點突變并構(gòu)建含突變體的質(zhì)粒載體；[0013]2)將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進宿主細胞；[0014]3)挑選陽性克隆進行發(fā)酵培養(yǎng)，并純化普魯蘭酶突變體D437H、D503R,D503F,D503W、D503Y、E589Y、D437H/D503F、D437H/D503W,D437H/D503Y、D437H/D589Y及D437H/D503Y/D589Y。[0015]所述質(zhì)粒載體為pUC系列，pET系列，或pGEX中的任——種。[0016]所述的宿主細胞包括:細菌、酵母和真菌細胞，其也為本發(fā)明要求保護的范圍。[0017]所述的細菌為革蘭氏陰性細菌或革蘭氏陽性細菌。[0018]本發(fā)明構(gòu)建了十一個有意義的突變體，實現(xiàn)了普魯蘭酶比活力和熱穩(wěn)定性的提高。單突變體酶的比活力均有所提高，其中D437H、E589Y和D503Y比活力提高最多，分別達到411.3,425.6和452.8U/mg。雙突變體D437H/D503Y、D437H/D589Y和三突變體D437H/D503Y/D589Y比活分別為430.8,415.9和421.5U/mg。在ρΗ4.5，60度的水浴中野生型酶的半衰期為20h，D437H、E589Y、D503Y半衰期為40h左右，雙突變體D437H/D503Y、D437H/D589Y和三突變體D437H/D503Y/D589Y半衰期都超過70h。其中D437H/D503Y和D437H/D503Y/D589Y熱穩(wěn)定性最好。突變體比野生型普魯蘭酶更適合應用于工業(yè)化的淀粉糖化過程。【專利附圖】【附圖說明】[0019]圖1野生型普魯蘭酶和突變型酶的熱穩(wěn)定性?！揪唧w實施方式】[0020]實施例1:重組菌構(gòu)建[0021]根據(jù)NCBI上登錄的pulA的基因序列(NCBI登錄號:AX203845)，采用化學全合成方法合成淀粉脫支酶基因序列pulA。用于構(gòu)建大腸桿菌表達載體的質(zhì)粒是pET20b(+)，帶有T7啟動子。將pET20b(+)質(zhì)粒和含有pulA基因的質(zhì)粒分別進行NcoI和HindIII雙酶切，酶切產(chǎn)物割膠回收后，再用T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細胞，經(jīng)37°C培養(yǎng)8h，挑轉(zhuǎn)化子在含有100mg/L氨芐青霉素液體的LB中振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，酶切驗證得到表達質(zhì)粒pulA/pET20b(+)。[0022]將質(zhì)粒pulA/pET20b(+)轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)宿主菌，涂布含氨芐青霉素(100mg/L)的LB平板上，37°C培養(yǎng)8h，命名為pulA/pET20b(+)/BL21(DE3)。挑單菌落至液體LB中，37°C培養(yǎng)過夜，保存甘油管。[0023]實施例2:突變體的制備。[0024](I)單突變[0025]來源于B.deramificans的普魯蘭酶的六種單突變體酶D437H，D503R,D503F,D503W,D503Y及E589Y:[0026]在不同來源普魯蘭酶序列比對分析的基礎(chǔ)上，對脫支芽孢桿菌普魯蘭酶蛋白結(jié)構(gòu)進行模擬及理性分析，再結(jié)合普魯蘭酶熱動力學分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了脫支芽孢桿菌普魯蘭酶分子中三個對該酶熱穩(wěn)定性具有潛在影響的氨基酸位點(Asp437、Asp503和Glu589)。[0027]將普魯蘭酶基因中第437位的天冬氨酸(Asp)突變成了組氨酸(His)，命名為D437H;將普魯蘭酶基因中第503位的天冬氨酸(Asp)分別突變成了精氨酸(Arg)，苯丙氨酸(Phe)，色氨酸(Trp)或酪氨酸(Tyr)分別命名為D503R，D503F,D503W及D503Y;將普魯蘭酶基因中第589位的谷氨酸(Glu)突變成了酪氨酸(Tyr);突變體相比于野生型普魯蘭酶具有更高的比活力和熱穩(wěn)定性。[0028]六種單突變體酶D437H，D503R,D503F,D503W,D503Y及E589Y的制備方法，根據(jù)B.deramificans普魯蘭酶基因序列，分別設(shè)計并合成引入D437H，D503R,D503F,D503W,D503Y或E589Y突變的引物，對普魯蘭酶基因進行定點突變，測定DNA編碼序列，分別鑒別出第437位Asp密碼子變成His密碼子,第503位Asp密碼子分別變成Arg,Phe,Trp或Tyr密碼子的突變體，第589位Glu密碼子變成Tyr密碼子。將突變體基因置于適當?shù)谋磉_載體中并導入枯草芽孢桿菌、地衣芽胞桿菌或大腸桿菌中進行表達，得到單突變普魯蘭酶。[0029]單突變D437H，D503R,D503F,D503W,D503Y及E589Y的定點突變:利用快速PCR技術(shù)，以表達載體pulA/pET-20b(+)為模板，[0030]引入D437H突變的定點突變引物為:[0031]正向引物:5’-ATCTATGAAATGCATGTCCGTGACTTT-3’(下劃線為突變堿基)[0032]反向引物:5’-AAAGTCACGGACATGCATTTCATAGAT-3’(下劃線為突變堿基)[0033]引入D503R突變的定點突變引物為:[0034]正向引物:5’-GATCCAACCCAACGTAATTGGGGTTAT-3’(下劃線為突變堿基)[0035]反向引物:5’-GTAACCCCAGTTACGTTGGGTCGGATC-3’(下劃線為突變堿基)[0036]引入D503F突變的定點突變引物為:[0037]正向引物:5’-GATCCAACCCAATTTAATTGGGGTTAT-3’(下劃線為突變堿基)[0038]反向引物:5’-GTAACCCCAGTTAAATTGGGTCGGATC-3’(下劃線為突變堿基)[0039]引入D503W突變的定點突變引物為:[0040]正向引物:5’-GATCCAACCCAATGGAATTGGGGTTAT-3’(下劃線為突變堿基)[0041]反向引物:5’-GTAACCCCAGTTCCATTGGGTCGGATC-3’(下劃線為突變堿基)[0042]引入D503Y突變的定點突變引物為:[0043]正向引物:5’-GATCCAACCCAATATAATTGGGGTTAT-3’(下劃線為突變堿基)[0044]反向引物:5’-GTAACCCCAGTTATATTGGGTCGGATC-3’(下劃線為突變堿基)[0045]引入D589Y突變的定點突變引物為:[0046]正向引物:5’-GGTACTGGAAATGAAATTGCAGCCGAA-3’(下劃線為突變堿基)[0047]反向引物:5’-TTCGGCTGCAATTTCATTTCCAGTACC-3’(下劃線為突變堿基)[0048]PCR反應體系均為:5XPSbufferlOμL，dNTPsMix(2.5mM)4μL，正向引物(10μΜ)IμL，反向引物(10μΜ)IμL,模板DNAlμL,PrimeStarHS(5U/μL)0.5μL，加入雙蒸水至50μL。PCR擴增條件均為:94°C預變性4min;隨后進行30個循環(huán)(98°CIOs,58°C5s,72°C6min);72°C繼續(xù)延伸IOmin0[0049]PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnI(Fermentas公司)消化，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，感受態(tài)細胞在LB固體培養(yǎng)基(含100μg/mL氨芐青霉素)培養(yǎng)過夜后，挑單克隆于LB液體培養(yǎng)基(含100μg/mL氨芐青霉素)中培養(yǎng)，后提取質(zhì)粒，將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達宿主大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，所有突變質(zhì)粒均測序正確。[0050](2)雙突變[0051]B.deramificans普魯蘭酶的四種雙突變體酶D437H/D503F，D437H/D503W,D437H/D503Y或D437H/D589Y:將單突變體酶D437H基因中第503位的天冬氨酸(Asp)突變成了苯丙氨酸(Phe)，色氨酸(Trp)或酪氨酸(Tyr)，分別命名為D437H/D503F，D437H/D503W,D437H/D503Y;將單突變體酶D437H基因中第589位的谷氨酸(Glu)突變成了酪氨酸(Tyr)，命名為D437H/D589Y，突變體相比于野生型普魯蘭酶具有更高的比活力和熱穩(wěn)定性。[0052]四種雙突變體酶D437H/D503F，D437H/D503W,D437H/D503Y或D437H/D589Y的制備方法，以單突變體酶D437H編碼基因為模板，分別設(shè)計并合成引入D437H，D503R,D503F,D503W或D503Y突變的引物，對單突變體酶D437H編碼基因進行定點突變，測定序列，鑒別出503位的Asp突變成Arg，Phe，Trp或，Tyr的突變體。將突變體基因置于適當?shù)谋磉_載體中并導入枯草芽孢桿菌、地衣芽胞桿菌或大腸桿菌中進行表達，得到雙突變普魯蘭酶突變體。[0053]雙突變D437H/D503F，D437H/D503W,D437H/D503Y和D437H/D589Y，的定點突變:利用快速PCR技術(shù)，以表達載體D437H/pET-20b(+)為模板，[0054]引入D503F突變的定點突變引物為:[0055]正向引物:5’-GATCCAACCCAATTTAATTGGGGTTAT-3’(下劃線為突變堿基)[0056]反向引物:5’-GTAACCCCAGTTAAATTGGGTCGGATC-3’(下劃線為突變堿基)[0057]引入D503W突變的定點突變引物為:[0058]正向引物:5’-GATCCAACCCAATGGAATTGGGGTTAT-3’(下劃線為突變堿基)[0059]反向引物:5’-GTAACCCCAGTTCCATTGGGTCGGATC-3’(下劃線為突變堿基)[0060]引入D503Y突變的定點突變引物為:[0061]正向引物:5’-GATCCAACCCAATATAATTGGGGTTAT-3，(下劃線為突變堿基)[0062]反向引物:5’-GTAACCCCAGTTATATTGGGTCGGATC-3’(下劃線為突變堿基)[0063]引入D589Y突變的定點突變引物為:[0064]正向引物:5’-GGTACTGGAAATGAAATTGCAGCCGAA-3’(下劃線為突變堿基)[0065]反向引物:5’-TTCGGCTGCAATTTCATTTCCAGTACC-3’(下劃線為突變堿基)[0066]PCR反應體系、反應條件及突變基因的測序方法同單突變體的方法。[0067](3)三突變[0068]B.deramificans普魯蘭酶的三突變體酶D437H/D503Y/D589Y:將雙突變體酶D437H/D503Y基因中第589位的谷氨酸(Glu)突變成了酪氨酸(Tyr)，命名為D437H/D503Y/D589Y，突變體相比于野生型普魯蘭酶具有更高的比活力和熱穩(wěn)定性。[0069]三突變體酶D437H/D503Y/D589Y的制備方法，以雙突變體酶D437H/D503Y編碼基因為模板，用引入D589Y突變的引物，對雙突變體酶D437H/D503Y編碼基因進行定點突變，測定序列，鑒別出589位的谷氨酸(Glu)突變成了酪氨酸(Tyr)的突變體。將突變體基因置于適當?shù)谋磉_載體中并導入枯草芽孢桿菌、地衣芽胞桿菌或大腸桿菌中進行表達，得到三突變普魯蘭酶突變體。[0070]三突變D437H/D589Y/D589Y的定點突變:利用快速PCR技術(shù)，以表達載體D437H/D503Y/pET-20b(+)為模板，[0071]引入D589Y突變的定點突變引物為:[0072]正向引物:5’-GGTACTGGAAATGAAATTGCAGCCGAA-3’(下劃線為突變堿基)[0073]反向引物:5’-TTCGGCTGCAATTTCATTTCCAGTACC-3’(下劃線為突變堿基)[0074]PCR反應體系、反應條件及突變基因的測序方法同單突變體的方法。[0075](4)突變體酶的表達與純化:[0076]挑取轉(zhuǎn)入表達宿主大腸桿菌BL21(DE3)的陽性單克隆于LB液體培養(yǎng)基(含100μg/mL氨芐青霉素)生長8~10h，按5%接種量將種子發(fā)酵液接到TB液體培養(yǎng)基(含100μg/mL氨芐青霉素);大腸桿菌在30°C搖床培養(yǎng)至0D_=0.6，加入0.01mM終濃度的IPTG誘導胞外表達，并在25°C搖床繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵50小時后，將發(fā)酵液于4°C、1000Og離心IOmin除菌體,收集離心上清液。[0077]調(diào)節(jié)普魯蘭酶突變體的發(fā)酵上清液pH到4.5，置于水浴鍋中55°C熱處理I小時，40CUOOOOg離心20min，收集上清液。往上清液中緩慢加入70%的(NH4)2S04，4°C放置鹽析過夜。4°C、1000Og離心20min,收集沉淀。用20mmol/L磷酸緩沖液復溶沉淀后,在20mmol/L磷酸緩沖液中透析過夜，期間更換2-3次透析緩沖液，通過0.22μm膜過濾后制成上樣樣品。采用AKTA蛋白純化儀進行重組蛋白的純化，整個純化過程在層析柜中進行，控制溫度為4°C。陰離子交換色譜純化步驟:⑴平衡:用5倍體積的20mmol/L磷酸緩沖液平衡DEAE陰離子交換色譜柱；(2)上樣:預先處理好的樣品以lmL/min的流速上樣；(4)洗脫，流速1.0mL/min，進行梯度洗脫，檢測波長為280nm，分部收集含普魯蘭酶酶活的洗脫液；活力組分在50mMpH4.5醋酸緩沖液中透析過夜后，分別得到純化突變體酶D437H，D503R,D503F,D503W,D503Y,D437H/D503R,D437H/D503F,D437H/D503W及D437H/D503Y。[0078]實施例3:本實施例說明酶活分析。[0079]I)酶活測定方法[0080]普魯蘭酶酶活性的測定采用3，5_二硝基水楊酸發(fā)(DNS法)。普魯蘭酶在一定條件下，催化水解普魯蘭糖生成還原糖，3，5-二硝基水楊酸與還原糖溶液共熱后被還原為顯棕紅色的氨基絡(luò)合物，在一定范圍內(nèi)其顏色的深淺與還原糖的量成正比，故可以在540nm的波長下進行比色，計算酶活。酶活單位定義:在上述條件下，每分鐘催化產(chǎn)生Iymol葡萄糖的酶量作為一個活力單位。[0081]酶活力測定步驟:[0082]A.預熱:取2ml的0.5%普魯蘭溶液(50mMpH4.5醋酸bufffer)于試管中，置于60°C水浴鍋預熱IOmin左右，[0083]B.反應:加入0.1ml樣品酶液，振蕩混勻，準確計時lOmin，加入3mlDNS混勻，放入冰水中終止反應,沸水浴7min,冷卻。[0084]C.測量:向上述反應體系中加入蒸懼水并定容至15ml的,混勻。在540nm下測量其吸光值并計算酶活力。[0085]2)比酶活比較:[0086]實驗結(jié)果列于表1，將突變體純酶與野生型純酶相比，可以發(fā)現(xiàn):單突變體酶的比活力均有所提高，其中D437H、E589Y和D503Y比活力提高最多，分別達到411.3,425.6和452.8U/mg0雙突變體D437H/D503Y、D437H/D589Y和三突變體D437H/D503Y/D589Y比活分別為430.8,415.9和421.5U/mg。[0087]表1[0089]實施例4:本實施例說明普魯蘭酶的熱穩(wěn)定性。[0090]將純化的野生型和突變體普魯蘭酶用IOOmMpH4.5醋酸緩沖液稀釋至蛋白含量為0.4mg/mL,且pH為4.5，置于60°C恒溫水浴中，每隔5h取樣一次，測其殘酶活，比較其穩(wěn)定性。[0091]將上述突變體表達獲得的突變體純酶制品與野生型純酶制品熱穩(wěn)定性進行比較，實驗結(jié)果如圖1所示，可以發(fā)現(xiàn)，單突變體D437H、E589Y、D503Y，雙突變體D437H/D503Y、D437H/D589Y和三突變體D437H/D503Y/D589Y熱穩(wěn)定性都提高了。野生型酶的半衰期為20h,D437H、E589Y、D503Y半衰期為40h左右，雙突變體D437H/D503Y、D437H/D589Y和三突變體D437H/D503Y/D589Y半衰期都超過70h。其中D437H/D503Y和D437H/D503Y/D589Y熱穩(wěn)定性最好?！緳?quán)利要求】1.一種普魯蘭酶突變體，其特征在于包括一個、兩個或三個相對于脫支芽孢桿菌普魯蘭酶活性氨基酸殘基的取代，所述氨基酸與普魯蘭酶的熱穩(wěn)定性相關(guān)；所述活性氨基酸殘基包括第503位的天冬氨酸。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體，其特征是將普魯蘭酶第503位的天冬氨酸分別突變成精氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸，分別命名為D503R、D503F、D503W及D503Y。3.權(quán)利要求1所述的突變體的制備方法，包括如下步驟:1)在脫支芽孢桿菌普魯蘭酶氨基酸序列的基礎(chǔ)上確定突變位點；設(shè)計定點突變的突變引物，以攜帶普魯蘭酶基因的載體為模板進行定點突變并構(gòu)建含突變體的質(zhì)粒載體；2)將突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進宿主細胞；3)挑選陽性克隆進行發(fā)酵培養(yǎng)，并純化普魯蘭酶突變體；所述質(zhì)粒載體為PUC系列，pET系列，或pGEX中的任一一種；所述宿主細胞為細菌、酵母和真菌細胞；所述細菌為革蘭氏陰性細`菌或革蘭氏陽性細菌?！疚臋n編號】C12R1/10GK103484443SQ201310471021【公開日】2014年1月1日申請日期:2012年7月23日優(yōu)先權(quán)日:2012年7月23日【發(fā)明者】吳敬,陳晟,段緒果,陳堅申請人:江南大學