一種腫瘤細(xì)胞系的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種可以高效刺激DC細(xì)胞致敏的抗原來源，即從腫瘤組織中分離得到腫瘤細(xì)胞，然后通過基因（bcl-2和erbB-1）的轉(zhuǎn)染，使其形成個(gè)體化的腫瘤細(xì)胞系，從而達(dá)到可以連續(xù)多次、高效刺激致敏DC細(xì)胞，使其將抗原遞呈T淋巴細(xì)胞后，產(chǎn)生高效特異性殺傷功能的CTL細(xì)胞的方法。
【專利說明】一種腫瘤細(xì)胞系的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種腫瘤細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和建系，并用此細(xì)胞系對(duì)樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell, DC)進(jìn)行高效致敏的方法。 【背景技術(shù)】
[0002]人體的免疫系統(tǒng)可以分為天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng)兩部分。DC細(xì)胞作為最主要的連接天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng)的橋梁，可以捕獲侵入機(jī)體的微生物、被病毒感染的細(xì)胞以及發(fā)生變異的腫瘤細(xì)胞的抗原信息，并遞呈給獲得性免疫系統(tǒng)，激活B細(xì)胞和T細(xì)胞，使其產(chǎn)生特異性的免疫反應(yīng)。
[0003]DC細(xì)胞最初由Ralph Steinman于1973年發(fā)現(xiàn)，隨后，DC細(xì)胞極強(qiáng)的抗原遞呈能力逐漸得到廣大研究人員的確認(rèn)。DC細(xì)胞作為過繼性細(xì)胞免疫治療的一種手段，也逐漸在臨床上展開應(yīng)用。截止的目前，有超過400家的醫(yī)療機(jī)構(gòu)正在進(jìn)行DC細(xì)胞相關(guān)的臨床研究。
[0004]利用DC的抗原遞呈能力，研究人員可以在體外培養(yǎng)DC細(xì)胞，然后通過加入的各種形式的抗原來刺激DC，使其致敏，致敏后的DC再與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，即可將抗原遞呈給T細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞分化成為具有特異性殺傷功能的細(xì)胞(Cytotoxic T Lymphocyte, CTL)。
[0005]現(xiàn)在主要的用于刺激DC致敏的抗原來源包括合成短肽、腫瘤細(xì)胞株以及患者手術(shù)所得的腫瘤組織裂解液等。其中腫瘤細(xì)胞株和合成短肽，由于所含抗原信息很難與患者個(gè)體的腫瘤抗原信息一致，所以其免疫原性較低，最終得到的CTL的殺傷活性較低；而腫瘤組織中由于超過95%的成分是內(nèi)皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和侵潤(rùn)性淋巴細(xì)胞等，所以其致敏DC效果較差，且腫瘤組織數(shù)量有限，只能進(jìn)行有限幾次的致敏操作。
[0006]綜上，尋找一種可以高效刺激DC細(xì)胞致敏的大量的腫瘤抗原來源就成了目前全世界科研工作者努力的目標(biāo)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明的目的是提供一種可以高效刺激DC細(xì)胞致敏的抗原來源，即從腫瘤組織中分離得到腫瘤細(xì)胞，然后通過基因(bcl-2和erbB-Ι)的轉(zhuǎn)染，使其形成個(gè)體化的腫瘤細(xì)胞系，從而達(dá)到可以連續(xù)多次、高效刺激致敏DC細(xì)胞，使其將抗原遞呈T淋巴細(xì)胞后，產(chǎn)生高效特異性殺傷功能的CTL細(xì)胞的方法。
[0008]本發(fā)明腫瘤細(xì)胞系的構(gòu)建方法，包括如下的步驟:
[0009]I)從腫瘤組織分離濃縮腫瘤細(xì)胞:用RPMI 1640培養(yǎng)基沖洗腫瘤組織；再用將腫瘤組織剪碎研磨后離心收集腫瘤細(xì)胞；用RPMI 1640培養(yǎng)基重懸腫瘤細(xì)胞制成細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液加在腫瘤細(xì)胞分離液上，離心后從液體界面中間收集白色細(xì)胞層，將收集的細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋后接種到細(xì)胞培養(yǎng)板中；
[0010]2)基因轉(zhuǎn)染:細(xì)胞貼壁后，將含有特定基因的慢病毒加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，病毒滴度大于IO7單位/毫升；
[0011]其中特定基因?yàn)閎cl-2基因和erbB-Ι基因，bcl-2基因核苷酸序列為SEQ IDNO:1 ；erbB-l基因核苷酸序列為SEQ ID NO: 3。
[0012]3)將基因轉(zhuǎn)染后的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)3-5天后，將培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞用胰蛋白酶酶解，進(jìn)行細(xì)胞傳代建立腫瘤細(xì)胞系。
[0013]步驟3)所述的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基，其配方組成如下:硝酸鈣100mg/L，氯化鉀400.00mg/L,硫酸鎂 48.80mg/L,氯化鈉 6000.00mg/L,碳酸氫鈉 2000mg/L，磷酸二氫鈉677.00mg/L、L-精氨酸 200.00mg/L, L-天冬酰胺 56.80mg/L, L-天冬氨酸 20.00mg/L, L-胱氨酸 49.8mg/L, L-谷氨酸 20.00mg/L,甘氨酸 10.00mg/L, L-組氨酸 15.00mg/L, L-羥脯氨酸 20.00mg/L, L-異亮氨酸 50.00mg/L, L-亮氨酸 50.00mg/L, L-賴氨酸鹽酸鹽 40.0mg/L,L-蛋氨酸 15.00mg/L, L-苯丙氨酸 15.00mg/L, L-脯氨酸 20.00mg/L, L-絲氨酸 30.0Omg/L, L-蘇氨酸 20.00mg/L, L-色氨酸 5.00mg/L, L-酪氨酸 20.00mg/L, L-繳氨酸 20.00mg/L,對(duì)氨基苯甲酸1.00mg/L,生物素0.20mg/L,氯化膽堿3.00mg/L,維生素B120.005mg/L,葉酸1.00mg/L,肌醇35.00mg/L,煙酰胺1.00mg/L,泛酸鈣0.25mg/L,鹽酸批卩多醇1.00mg/L,核黃素 0.20mg/L,鹽酸硫胺素 1.00mg/L,葡萄糖 2000.00mg/L,谷胱甘肽 1.0mg/L,酹紅 5.0mg/L。
[0014]為了加速腫瘤細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng)，在上述的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基另外添加了表皮生長(zhǎng)因子0.0lmg/L,胰島素8mg/L,轉(zhuǎn)鐵蛋白50mg/L,三碘甲腺原氨酸0.005mg/L。
[0015]待腫瘤細(xì)胞擴(kuò)增到一定數(shù)量后，收集IO7腫瘤細(xì)胞，用5毫升培養(yǎng)基重懸，然后反復(fù)凍融，使細(xì)胞徹底裂解，將裂解液加入提前培養(yǎng)到第6天的患者DC細(xì)胞中，48小時(shí)后，收集刺激致敏的DC細(xì)胞加入到患者CIK細(xì)胞中，24小時(shí)后，收集CIK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，用患者腫瘤細(xì)胞作為祀細(xì)胞，測(cè)定殺傷活性。結(jié)果經(jīng)個(gè)體化腫瘤細(xì)胞系致敏的CIK細(xì)胞對(duì)患者腫瘤細(xì)胞的殺傷，在效靶比為5:1的條件下，可以達(dá)到28.6%，遠(yuǎn)高于未致敏組(13.7%)。
[0016]本發(fā)明的方法所構(gòu)建的腫瘤細(xì)胞系可以多次傳代，最大限度的保留了患者個(gè)體化的腫瘤抗原信息。本發(fā)明的主要特點(diǎn)是:分離、濃縮得到較高純度的腫瘤細(xì)胞，然后通過轉(zhuǎn)入bcl-2和erbB-Ι基因，高效的構(gòu)建個(gè)體化的腫瘤細(xì)胞系。由于腫瘤組織本身結(jié)構(gòu)以及組分的復(fù)雜性，導(dǎo)致從腫瘤組織構(gòu)建腫瘤細(xì)胞系的成功率較低，通常不超過10%，而一些種類的腫瘤得到細(xì)胞系的可能性甚至低于3%，而使用本發(fā)明的方法，構(gòu)建腫瘤細(xì)胞系的成功率可以達(dá)到70%以上，并可以用于持續(xù)的刺激DC細(xì)胞致敏。到目前為止，仍未見有通過慢病毒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染bcl-2和erbB-Ι基因構(gòu)建腫瘤細(xì)胞系的研究報(bào)道，本發(fā)明首次提供一種高效構(gòu)建個(gè)體化腫瘤細(xì)胞系，并用于刺激DC細(xì)胞致敏的方法。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的個(gè)體化腫瘤細(xì)胞系構(gòu)建方法進(jìn)行描述。
[0018]實(shí)施例1
[0019]1、從肝細(xì)胞癌手術(shù)樣品分離濃縮腫瘤細(xì)胞:用手術(shù)剪去除脂肪組織和血管；用RPMI 1640培養(yǎng)基沖洗剩余腫瘤組織；用手術(shù)剪將腫瘤組織剪成小塊，然后用粗頭吸管研磨并反復(fù)吹打，過100目篩網(wǎng)，去除剩余的較大的團(tuán)塊。將細(xì)胞懸液300g離心5分鐘，棄上清；細(xì)胞沉淀用5毫升的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸；將細(xì)胞懸液輕輕加在5毫升密度為1.055mg/ml的蔗聚糖一泛影葡胺分離液上，800g離心15分鐘；從液體界面中間收集白色細(xì)胞層，將細(xì)胞用腫瘤細(xì)胞專用培養(yǎng)基稀釋到2xl06個(gè)細(xì)胞/毫升，接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1.5毫升。[0020]為了獲得更好的培養(yǎng)效果，對(duì)培養(yǎng)基的組分及配比進(jìn)行了長(zhǎng)期的優(yōu)化，最終獲得如下的配方:硝酸鈣100mg/L，氯化鉀400.00mg/L，硫酸鎂48.80mg/L，氯化鈉6000.00mg/L,碳酸氫鈉2000mg/L,磷酸二氫鈉677.00mg/L>L-精氨酸200.00mg/L, L-天冬酰胺56.80mg/L, L-天冬氨酸 20.00mg/L, L-胱氨酸 49.8mg/L, L-谷氨酸 20.00mg/L,甘氨酸 10.00mg/L,L-組氨酸 15.00mg/L, L-輕脯氨酸 20.00mg/L, L-異亮氨酸 50.00mg/L, L-亮氨酸 50.0Omg/L, L-賴氨酸鹽酸鹽40.0mg/L, L-蛋氨酸15.00mg/L, L-苯丙氨酸15.00mg/L, L-脯氨酸 20.00mg/L, L-絲氨酸 30.00mg/L, L-蘇氨酸 20.00mg/L, L-色氨酸 5.00mg/L, L-酪氨酸20.00mg/L, L-繳氨酸20.00mg/L,對(duì)氨基苯甲酸1.00mg/L,生物素0.20mg/L,氯化膽堿 3.00mg/L,維生素 B120.005mg/L,葉酸 1.00mg/L,肌醇 35.00mg/L,煙酰胺 1.00mg/L,泛酸鈣0.25mg/L,鹽酸吡卩多醇1.00mg/L,核黃素0.20mg/L,鹽酸硫胺素1.00mg/L,葡萄糖2000.00mg/L，谷胱甘肽 1.0mg/L，酚紅 5.0mg/L。[0021]為了加速腫瘤細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng)，在上述的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基另外添加了表皮生長(zhǎng)因子0.0lmg/L,胰島素8mg/L,轉(zhuǎn)鐵蛋白50mg/L,三碘甲腺原氨酸0.005mg/L。[0022]上述培養(yǎng)基是 申請(qǐng)人:長(zhǎng)期優(yōu)化獲得的，在同樣的培養(yǎng)條件下，與常規(guī)的PRMI1640培養(yǎng)基相比，可以將原代腫瘤細(xì)胞的貼壁時(shí)間提前I~2天，貼壁細(xì)胞的比例提高25%左右。[0023]2、基因轉(zhuǎn)染:將bcl-2 (基因的核苷酸序列為SEQ ID NO: 1，氨基酸序列為SEQ IDN0:2)和erbB-l基因(基因的核苷酸序列為SEQ ID NO:3，氨基酸序列為SEQ ID NO:4)片段分別插入到慢病毒載體pEFlalpha-1RES Vector (購(gòu)自clontech)的兩個(gè)多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建目的基因載體；提前24小時(shí)將5\106個(gè)1^社丨42931'包裝細(xì)胞接種到10厘米的培養(yǎng)皿中；將適量的目的基因載體與36微升Lent1-X HTX Packaging Mix, 7.5微升Xfect Polymer,1150微升Xfect Reaction Buffer混合后，室溫靜置10分鐘，然后加入到培養(yǎng)皿中；將培養(yǎng)皿至于37°C 二氧化碳培養(yǎng)箱中過夜；更換新的培養(yǎng)基；48小時(shí)后，收集上清液，過0.45微米的無(wú)菌濾膜，過濾液即為含有目的基因的病毒懸液；檢測(cè)病毒滴度為5.2 X IO7單位/毫升。[0024]腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)4天后，觀察細(xì)胞貼壁良好，狀態(tài)穩(wěn)定。將步驟2中的病毒懸液加入到腫瘤細(xì)胞的24孔培養(yǎng)板中，500微升/孔。[0025]擴(kuò)大培養(yǎng):在轉(zhuǎn)染3天后，觀察到細(xì)胞開始快速增殖。用0.25%胰蛋白酶酶解，進(jìn)行細(xì)胞傳代；每3天進(jìn)行一次傳代操作。[0026]抗性篩選:進(jìn)行5次傳代培養(yǎng)后，開始抗性篩選。因?yàn)閜EFlalpha-1RES Vector中帶有neo抗性基因，所以在細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入800單位/毫升的G418抗生素，每次傳代或更換培養(yǎng)液時(shí)均補(bǔ)充800單位/毫升的G418，持續(xù)2周，此時(shí)沒有轉(zhuǎn)染目的基因的細(xì)胞因?yàn)闆]有抗性基因，被G418抗生素殺死，所以剩余細(xì)胞全部是成功轉(zhuǎn)入bcl-2和erbB-Ι基因的細(xì)胞。[0027]3、建立腫瘤細(xì)胞系:細(xì)胞進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核較大，核漿比倒置，存在三級(jí)/多級(jí)有絲分裂現(xiàn)象；軟瓊脂培養(yǎng)結(jié)果顯示，篩選后細(xì)胞在低濃度條件下可在軟瓊脂中形成克隆團(tuán)集落；動(dòng)物致瘤性試驗(yàn)結(jié)果顯示，裸鼠皮下接種5X IO8篩選后細(xì)胞，2周后，可以形成實(shí)體瘤塊。綜上，篩選后細(xì)胞可以鑒定為腫瘤細(xì)胞。[0028]待腫瘤細(xì)胞擴(kuò)增到一定數(shù)量后，收集IO7腫瘤細(xì)胞，用5毫升培養(yǎng)基重懸，然后反復(fù)凍融，使細(xì)胞徹底裂解，將裂解液加入提前培養(yǎng)到第6天的患者DC細(xì)胞中，48小時(shí)后，收集刺激致敏的DC細(xì)胞加入到患者CIK細(xì)胞中，24小時(shí)后，收集CIK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，用患者腫瘤細(xì)胞作為祀細(xì)胞，測(cè)定殺傷活性。結(jié)果經(jīng)個(gè)體化腫瘤細(xì)胞系致敏的CIK細(xì)胞對(duì)患者腫瘤細(xì)胞的殺傷，在效靶比為5:1的條件下，可以達(dá)到28.6%，遠(yuǎn)高于未致敏組(13.7%)。
[0029]實(shí)驗(yàn)例2
[0030]從胃腺癌手術(shù)樣品分離濃縮腫瘤細(xì)胞:用手術(shù)剪去除脂肪組織和血管；用RPMI1640培養(yǎng)基沖洗剩余腫瘤組織；用手術(shù)剪將腫瘤組織剪成小塊，然后用粗頭吸管研磨并反復(fù)吹打，過100目篩網(wǎng)，去除剩余的較大的團(tuán)塊。將細(xì)胞懸液300g離心5分鐘，棄上清；細(xì)胞沉淀用5毫升的RPMI1640培養(yǎng)基重懸；將細(xì)胞懸液輕輕加在5毫升密度為1.055mg/ml的蔗聚糖一泛影葡胺分離液上，800g離心15分鐘；從液體界面中間收集白色細(xì)胞層，將細(xì)胞用腫瘤細(xì)胞專用培養(yǎng)基稀釋到2xl06個(gè)細(xì)胞/毫升，接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1.5毫升。
[0031]2、基因轉(zhuǎn)染:將bcl-2和erbB-Ι基因片段分別插入到慢病毒載體pEFlalpha-1RESVector (購(gòu)自clontech)的兩個(gè)多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建目的基因載體；提前24小時(shí)將5X IO6個(gè)Lent1-X293T包裝細(xì)胞接種到10厘米的培養(yǎng)皿中；將適量的目的基因載體與36微升Lent1-X HTX Packaging Mix, 7.5 微升 Xfect Polymer, 1150 微升 Xfect Reaction Buffer混合后，室溫靜置10分鐘，然后加入到培養(yǎng)皿中；將培養(yǎng)皿至于37° 二氧化碳培養(yǎng)箱中過夜；更換新的培養(yǎng)基；48小時(shí)后，收集上清液，過0.45微米的無(wú)菌濾膜，過濾液即為含有目的基因的病毒懸液；檢測(cè)病毒滴度為5.2 X IO7單位/毫升。
[0032]腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)4天后，觀察細(xì)胞貼壁良好，狀態(tài)穩(wěn)定。將步驟2中的病毒懸液加入到腫瘤細(xì)胞的24孔培養(yǎng)板中，500微升/孔。
[0033]擴(kuò)大培養(yǎng):在轉(zhuǎn)染3天后，觀察到細(xì)胞開始快速增殖。用0.25%胰蛋白酶酶解，進(jìn)行細(xì)胞傳代；每3天進(jìn)行一次傳代操作。
[0034]抗性篩選:進(jìn)行5次傳代培養(yǎng)后，開始抗性篩選。因?yàn)閜EFlalpha-1RES Vector中帶有neo抗性基因，所以在細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入800單位/毫升的G418抗生素，每次傳代或更換培養(yǎng)液時(shí)均補(bǔ)充800單位/毫升的G418，持續(xù)2周，此時(shí)沒有轉(zhuǎn)染目的基因的細(xì)胞因?yàn)闆]有抗性基因，被G418抗生素殺死，所以剩余細(xì)胞全部是成功轉(zhuǎn)入bcl-2和erbB-Ι基因的細(xì)胞。
[0035]篩選后細(xì)胞鑒定:篩選后的細(xì)胞進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核較大，核漿比倒置，存在三級(jí)/多級(jí)有絲分裂現(xiàn)象；軟瓊脂培養(yǎng)結(jié)果顯示，篩選后細(xì)胞在低濃度條件下可在軟瓊脂中形成克隆團(tuán)集落；動(dòng)物致瘤性試驗(yàn)結(jié)果顯示，裸鼠皮下接種5 X IO8篩選后細(xì)胞，2周后，可以形成實(shí)體瘤塊。綜上，篩選后細(xì)胞可以鑒定為腫瘤細(xì)胞。
[0036]待腫瘤細(xì)胞擴(kuò)增到一定數(shù)量后，收集IO7腫瘤細(xì)胞，用5毫升培養(yǎng)基重懸，然后反復(fù)凍融，使細(xì)胞徹底裂解，將裂解液加入提前培養(yǎng)到第6天的患者DC細(xì)胞中，48小時(shí)后，收集刺激致敏的DC細(xì)胞加入到患者CIK細(xì)胞中，24小時(shí)后，收集CIK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，用患者腫瘤細(xì)胞作為祀細(xì)胞，測(cè)定殺傷活性。結(jié)果經(jīng)個(gè)體化腫瘤細(xì)胞系致敏的CIK細(xì)胞對(duì)患者腫瘤細(xì)胞的殺傷，在效靶比為5:1的條件下，可以達(dá)到34.1%，遠(yuǎn)高于未致敏組(14.5%)。
[0037]實(shí)驗(yàn)例3
[0038]從非小細(xì)胞肺癌分離濃縮腫瘤細(xì)胞:用手術(shù)剪去除脂肪組織和血管；用RPMI1640培養(yǎng)基沖洗剩余腫瘤組織；用手術(shù)剪將腫瘤組織剪成小塊，然后用粗頭吸管研磨并反復(fù)吹打，過100目篩網(wǎng)，去除剩余的較大的團(tuán)塊。將細(xì)胞懸液300g離心5分鐘，棄上清；細(xì)胞沉淀用5毫升的RPMI1640培養(yǎng)基重懸；將細(xì)胞懸液輕輕加在5毫升密度為1.055mg/ml的蔗聚糖一泛影葡胺分離液上，800g離心15分鐘；從液體界面中間收集白色細(xì)胞層，將細(xì)胞用腫瘤細(xì)胞專用培養(yǎng)基稀釋到2xl06個(gè)細(xì)胞/毫升，接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1.5毫升。
[0039]病毒制備:將bcl-2和erbB-Ι基因片段分別插入到慢病毒載體pEFlalpha-1RESVector (購(gòu)自clontech)的兩個(gè)多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建目的基因載體；提前24小時(shí)將5X IO6個(gè)Lent1-X293T包裝細(xì)胞接種到10厘米的培養(yǎng)皿中；將適量的目的基因載體與36微升Lent1-X HTX Packaging Mix, 7.5 微升 Xfect Polymer, 1150 微升 Xfect Reaction Buffer混合后，室溫靜置10分鐘，然后加入到培養(yǎng)皿中；將培養(yǎng)皿至于37° 二氧化碳培養(yǎng)箱中過夜；更換新的培養(yǎng)基；48小時(shí)后，收集上清液，過0.45微米的無(wú)菌濾膜，過濾液即為含有目的基因的病毒懸液；檢測(cè)病毒滴度為5.2 X IO7單位/毫升。
[0040]基因轉(zhuǎn)染:腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)4天后，觀察細(xì)胞貼壁良好，狀態(tài)穩(wěn)定。將步驟2中的病毒懸液加入到腫瘤細(xì)胞的24孔培養(yǎng)板中，500微升/孔。
[0041]擴(kuò)大培養(yǎng):在轉(zhuǎn)染3天后，觀察到細(xì)胞開始快速增殖。用0.25%胰蛋白酶酶解，進(jìn)行細(xì)胞傳代；每3天進(jìn)行一次傳代操作。
[0042]抗性篩選:進(jìn)行5次傳代培養(yǎng)后，開始抗性篩選。因?yàn)閜EFlalpha-1RES Vector中帶有neo抗性基因，所以在細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入800單位/毫升的G418抗生素，每次傳代或更換培養(yǎng)液時(shí)均補(bǔ)充800單位/毫升的G418，持續(xù)2周，此時(shí)沒有轉(zhuǎn)染目的基因的細(xì)胞因?yàn)闆]有抗性基因，被G418抗生素殺死，所以剩余細(xì)胞全部是成功轉(zhuǎn)入bcl-2和erbB-Ι基因的細(xì)胞。
[0043]篩選后細(xì)胞鑒定:篩選后的細(xì)胞進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核較大，核漿比倒置，存在三級(jí)/多級(jí)有絲分裂現(xiàn)象；軟瓊脂培養(yǎng)結(jié)果顯示，篩選后細(xì)胞在低濃度條件下可在軟瓊脂中形成克隆團(tuán)集落；動(dòng)物致瘤性試驗(yàn)結(jié)果顯示，裸鼠皮下接種5X IO8篩選后細(xì)胞，2周后，可以形成實(shí)體瘤塊。綜上，篩選后細(xì)胞可以鑒定為腫瘤細(xì)胞。
[0044]待腫瘤細(xì)胞擴(kuò)增到一定數(shù)量后，收集IO7腫瘤細(xì)胞，用5毫升培養(yǎng)基重懸，然后反復(fù)凍融，使細(xì)胞徹底裂解，將裂解液加入提前培養(yǎng)到第6天的患者DC細(xì)胞中，48小時(shí)后，收集刺激致敏的DC細(xì)胞加入到患者CIK細(xì)胞中，24小時(shí)后，收集CIK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，用患者腫瘤細(xì)胞作為祀細(xì)胞，測(cè)定殺傷活性。結(jié)果經(jīng)個(gè)體化腫瘤細(xì)胞系致敏的CIK細(xì)胞對(duì)患者腫瘤細(xì)胞的殺傷，在效靶比為5:1的條件下，可以達(dá)到22.9%，遠(yuǎn)高于未致敏組(12.2%)。
[0045]本發(fā)明所制備的個(gè)體化腫瘤細(xì)胞系，可以傳代15次以上。將此細(xì)胞系用于刺激患者DC細(xì)胞致敏，致敏后的DC細(xì)胞將抗原遞呈CIK細(xì)胞后，可以使CIK細(xì)胞的殺傷活性提高超過100%。
【權(quán)利要求】
1.一種腫瘤細(xì)胞系的構(gòu)建方法，包括如下的步驟: O從腫瘤組織分離濃縮腫瘤細(xì)胞:用RPMI 1640培養(yǎng)基沖洗腫瘤組織；再用將腫瘤組織剪碎研磨后離心收集腫瘤細(xì)胞；用RPMI 1640培養(yǎng)基重懸腫瘤細(xì)胞制成細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液加在腫瘤細(xì)胞分離液上，離心后從液體界面中間收集白色細(xì)胞層，將收集細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋后接種到細(xì)胞培養(yǎng)板中； 2)基因轉(zhuǎn)染:細(xì)胞貼壁后，將含有特定基因的慢病毒加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，病毒滴度大于IO7單位/毫升； 3)將基因轉(zhuǎn)染后的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)3-5天后，將培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞用胰蛋白酶酶解，進(jìn)行細(xì)胞傳代建立腫瘤細(xì)胞系。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟2)中特定基因?yàn)閎cl-2基因和erbB-Ι基因，所述的bcl-2基因核苷酸序列為SEQ ID NO:1 ;erbB_l基因核苷酸序列為SEQID NO:3。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟3)中的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基，其配方組成如下:硝酸韓100mg/L,氯化鉀400.00mg/L,硫酸鎂48.80mg/L,氯化鈉6000.00mg/L,碳酸氫鈉 2000mg/L，磷酸二氫鈉 677.00mg/L、L-精氨酸 200.00mg/L, L-天冬酰胺 56.80mg/L, L-天冬氨酸 20.00mg/L, L-胱氨酸 49.8mg/L, L-谷氨酸 20.00mg/L,甘氨酸 10.00mg/L,L-組氨酸 15.00mg/L, L-輕脯氨酸 20.00mg/L, L-異亮氨酸 50.00mg/L, L-亮氨酸 50.0Omg/L, L-賴氨酸鹽酸鹽40.0mg/L, L-蛋氨酸15.00mg/L, L-苯丙氨酸15.00mg/L, L-脯氨酸 20.00mg/L, L-絲氨酸 30.00mg/L, L-蘇氨酸 20.00mg/L, L-色氨酸 5.00mg/L, L-酪氨酸20.00mg/L, L-繳氨酸20.00mg/L,對(duì)氨基苯甲酸1.00mg/L,生物素0.20mg/L,氯化膽堿 3.00mg/L,維生素 B120.005mg/L,葉酸 1.00mg/L,肌醇 35.00mg/L,煙酰胺 1.00mg/L,泛酸鈣0.25mg/L,鹽酸吡卩多醇1.00mg/L,核黃素0.20mg/L,鹽酸硫胺素1.00mg/L,葡萄糖2000.00mg/L，谷胱甘肽 1.0.mg/L，酚紅 5.0mg/L。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中添加了表皮生長(zhǎng)因子0.01mg/L,胰島素8mg/L,轉(zhuǎn)鐵蛋白50mg/L,三碘甲腺原氨酸0.005mg/L。
【文檔編號(hào)】C12N15/867GK103468746SQ201310452611
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月28日
【發(fā)明者】徐矯健, 孫威 申請(qǐng)人:青島麥迪賽斯生物科技有限公司