一種花生四烯酸的制備方法
【專利摘要】一種花生四烯酸的制備方法，涉及花生四烯酸。對高山被孢霉產(chǎn)ARA的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基分批發(fā)酵，在優(yōu)化培養(yǎng)基中以酵母粉和玉米漿為氮源分批發(fā)酵，再以酵母粉為氮源進(jìn)行的發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)，對高山被孢霉在優(yōu)化培養(yǎng)基中以玉米漿和酵母粉為混合氮源進(jìn)行培養(yǎng)，將優(yōu)化培養(yǎng)基中的氮源替換為玉米漿和酵母粉，得混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基；對高山被孢霉在混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基中分批發(fā)酵；對高山被孢霉高糖馴化及對馴化后的菌種在混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基中分批發(fā)酵，在當(dāng)葡萄糖濃度降至10g/L時(shí)，流加600g/L葡萄糖，使殘?zhí)强刂圃?0g/L左右，培養(yǎng)168h后開始收獲干菌體、油脂和ARA。
【專利說明】一種花生四烯酸的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及花生四烯酸，尤其是涉及一種花生四烯酸的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]花生四烯酸(Arachidonic Acid,簡稱ARA,即5,8,11,14-二十碳四烯酸)屬于ω-6系列長鏈多不飽和脂肪酸，由于人體內(nèi)不具備相應(yīng)的酶系統(tǒng)來合成特定的不飽和雙鍵，因此被認(rèn)為是人體必需脂肪酸，是許多二十碳衍生物如前列腺素E2 (PGE2)、前列環(huán)素(PGI2)、血栓烷 A2 (TXA2)、白三烯 Leukotirene B4(LTB4)和 C4 (LTC4)的直接前體。ARA 還具有調(diào)節(jié)體內(nèi)多種離子通道作用，控制細(xì)胞膜的通透性，維持機(jī)體保水性等許多重要的生理功能。同時(shí)研究表明，花生四烯酸對嬰兒的大腦發(fā)育和視覺功能的完善有著極為重要的意義，花生四烯酸對高血壓、高血脂、糖尿病、病毒感染等疾病的預(yù)防與治療也有顯著的效果(Roger et al.Biotechnology Bioengineering, 2010，9 (20): 245-257)。因此，花生四烯酸既是一種營養(yǎng)強(qiáng)化劑，又是人類重要的保健品。ARA作為人體必需脂肪酸發(fā)揮著無可替代的作用，應(yīng)用前景廣闊。
[0003]ARA主要來源有植物、動物組織、魚油以及微生物和微藻類等，但ARA在動物組織中含量低，來源也有限，而微生物發(fā)酵法則為生產(chǎn)ARA開辟了新途徑，它具有不受原材料及氣候限制、生長周期短、培養(yǎng)工藝簡單、ARA含量高等特點(diǎn)，近年來已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。國際上開展產(chǎn)多不飽和脂肪酸(PFUAs)的微生物研究主要集中在以下幾個(gè)方面:(1)產(chǎn)PFUAs菌種的分離與選育；(2)培養(yǎng)條件及發(fā)酵工藝的優(yōu)化；(3)培養(yǎng)方式的研究(包括批式、補(bǔ)料、連續(xù)培養(yǎng)工藝等);(4)PFUAs的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定。目前，人們僅發(fā)現(xiàn)接合菌綱是比較具有研究價(jià)值的的一個(gè)綱，而且普遍看好被孢霉，認(rèn)為它是生產(chǎn)ARA、EPA、DHA最有潛力的菌種。目前，日本、美國等國家已經(jīng)先后問世了 ARA的發(fā)酵產(chǎn)品，國內(nèi)在這一領(lǐng)域的研究起步晚，雖對微生物發(fā)酵生產(chǎn)ARA方面作了一些研究，但還存在著生物量偏低，油脂含量較低等問題，離大規(guī)模的工業(yè)`化生產(chǎn)仍有一定的距離。
[0004]中國專利CN101613724公開一種利用高山被孢霉菌絲體制備花生四烯酸的方法，包括有下述步驟:首先在恒溫?fù)u床中將高山被孢霉接種量的深層培養(yǎng)；再轉(zhuǎn)接于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的器皿中，培養(yǎng)后獲得發(fā)酵醪液，其中生長培養(yǎng)基或/和發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源以高山被孢霉菌柏代替部分常用氮源，高山被孢霉菌柏中的氮源替代比以質(zhì)量百分比計(jì)為10%-90% ;發(fā)酵醪液經(jīng)過濾，收集的霉菌生物體，經(jīng)洗滌、干燥、粉碎，采用非極性溶劑進(jìn)行浸提或壓榨，收獲油脂，收獲的油脂經(jīng)進(jìn)一步處理獲得目標(biāo)產(chǎn)品，霉菌生物體經(jīng)非極性溶劑浸提后剩余固體物質(zhì)，即為可循環(huán)使用的高山被孢霉菌柏，該發(fā)明利用高山被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)花生四烯酸過程中產(chǎn)生的廢棄物得到循環(huán)利用，避免了環(huán)境污染物的排放。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種花生四烯酸的制備方法。
[0006]本發(fā)明包括以下步驟:[0007]I)通過搖瓶實(shí)驗(yàn)對高山被孢霉產(chǎn)ARA的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，所述優(yōu)化的方法為取4mL種子液接入裝有50mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基(葡萄糖40g/L ;酵母粉5g/L ；MgS04-7H200.lg/L ；KH2PO40.5g/L ；CaC030.05g/L ；ZnS04-7H200.lg/L ；pH6.0)的 250mL 三角瓶，28 °C、150rpm培養(yǎng)5-6d，得到優(yōu)化培養(yǎng)基:葡萄糖60g/L ;酵母粉或玉米漿10g/L ;谷氨酸1.0g/L ；MgS04-7H200.lg/L ；KH2P042.0g/L ；CaCO30.05g/L ；ZnS04-7H200.lg/L ;混合微量元素 lmL/L ；混合維生素lmL/L ；pH調(diào)至6.0 ；
[0008]2)對高山被孢霉在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進(jìn)行了 2L分批發(fā)酵，培養(yǎng)至第168h，開始收獲菌體，獲得干菌體、油脂和ARA ；
[0009]3)對高山被孢霉在優(yōu)化培養(yǎng)基中分別以酵母粉和玉米漿為氮源進(jìn)行了 2L分批發(fā)酵，再以酵母粉為氮源進(jìn)行的發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)，菌體生長正常，未發(fā)生自溶現(xiàn)象，并獲得干菌體、油脂和ARA ；
[0010]4)對高山被孢霉在優(yōu)化培養(yǎng)基中以玉米漿和酵母粉為混合氮源進(jìn)行培養(yǎng)，將步驟O中的優(yōu)化培養(yǎng)基中的氮源替換為玉米漿和酵母粉，得混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基；
[0011]5)對高山被孢霉在混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基中進(jìn)行2L分批發(fā)酵，在2L發(fā)酵罐中裝入混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基，培養(yǎng)168h后收獲干菌體、油脂和ARA ；
[0012]6)對高山被孢霉進(jìn)行高糖馴化及對馴化后的菌種在混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基中進(jìn)行2L分批發(fā)酵，在當(dāng)葡萄糖濃度降至10g/L時(shí)，流加600g/L葡萄糖，使殘?zhí)强刂圃?0g/L左右，其余操作過程與步驟5)相同，培養(yǎng)168h后開始收獲干菌體、油脂和ARA。
[0013]在步驟I)中，所述混合微量元素可包括FeCl3.6H20,、H3B03、MnCl2.4H20、CoCl2.6H20、CuSO4.5H20、NiSO4.6H20等；所述混合維生素可包括維生素B12、生物素、維生素B1、泛酸鈣等。
[0014]在步驟2)中，所述發(fā)`酵的條件可為:將培養(yǎng)3d的液體種子，按10%接種量接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，裝液量1.5L，初始葡萄糖濃度為60g/L，在28°C，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，通氣量Ivvm ;所述干菌體可得18g/L,油脂可得7g/L, ARA可得2.7g/L。
[0015]在步驟3)中，所述發(fā)酵的條件可與步驟2)的發(fā)酵條件相同；所述干菌體可得21g/L,油脂可得9g/L，ARA可得3.8g/L。
[0016]在步驟4)中，所述培養(yǎng)的方法可與步驟I)中的培養(yǎng)方法相同；所述玉米漿和酵母粉的質(zhì)量比可為3: 8。
[0017]在步驟5)中，所述混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基的加入量可為1.5L ;所述混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基中葡萄糖的初始濃度為60g/L，接種量10%，初始pH用25%氨水控制在6.0-6.5，溫度28°C、轉(zhuǎn)速250rpm ;所述干菌體可得36g/L，油脂可得16g/L，ARA可得6.5g/L。
[0018]在步驟6)中，所述2L分批發(fā)酵的具體方法可為:首先采用固體培養(yǎng)基馴化，將菌種逐級涂布于梯度高糖平板(含糖量分別為2%、5%、7%、10%和15%)培養(yǎng)，挑選經(jīng)固體馴化后能耐受10%高糖濃度平板的菌種轉(zhuǎn)接到兩種含不同氮源的梯度高糖(含糖量分別為3%、4%、5%和6%)液體培養(yǎng)基中進(jìn)行馴化，接著對該馴化后的菌種，使用步驟4)中所述的混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基進(jìn)行分批發(fā)酵；所述干菌體可得58g/L，油脂可得28g/L，ARA可得16g/L。
[0019]所述高山被孢霉可以接種適量的被孢霉至載有培養(yǎng)基的搖瓶中，置于搖床上培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為100-300rpm，較好的為150-200rpm。
[0020]本發(fā)明涉及的培養(yǎng)基的組成成分，例如碳源、氮源可以有所不同。碳源可以使用蔗糖、麥芽糖、糊精、淀粉等，葡萄糖是較適宜的碳源，來源簡單，價(jià)格低廉，使用量為30-80g/L。對于搖瓶種子培養(yǎng)，一般將使用量降低至10-30g/L，可根據(jù)培養(yǎng)的時(shí)間及所要求的生物量密度來選擇用量。具體合適的用量選擇，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通過相關(guān)操作確定碳源的種類及合適用量。同時(shí)，可視微生物的生長情況，選擇一次性加入全部碳源或者分批補(bǔ)入。氮源可以選擇酵母粉、玉米漿、蛋白胨、大豆粉等中的至少一種，酵母粉或者玉米漿被認(rèn)為是比較好的氮源，添加濃度在5-15g/L，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作確定氮源的種類及用量。
[0021]可選擇使用單一氮源或混合氮源，更好的結(jié)果是使用混合氮源(玉米漿、酵母粉)為發(fā)酵罐培養(yǎng)的適宜氮源，且二者的質(zhì)量比例對于油脂的積累影響較大，可利用響應(yīng)面分析等統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)一步優(yōu)化碳氮源的組合，較好的兩種氮源比例為3:8 (w/w)0[0022]溫度低于20°C高山被孢霉將會開始大量產(chǎn)生EPA，而培養(yǎng)要求得到較高含量的ARA，同時(shí)盡量減低或避免產(chǎn)生EPA，培養(yǎng)溫度通常保持在25-30°C。微生物發(fā)酵生產(chǎn)PUFAs，其最高產(chǎn)量一般是在對數(shù)期后期或穩(wěn)定期前期，因此要在最短的時(shí)間內(nèi)獲得最大可能的生物量及總脂肪酸的含量，一般來說，最適收獲ARA的時(shí)間是在第5-6天。
[0023]真菌生長的pH范圍較廣，更偏好于在偏酸環(huán)境中生長，pH在4.0至8.0之間均可以正常生長，本發(fā)明的實(shí)施過程中發(fā)現(xiàn)，初始pH6.0-6.5，培養(yǎng)過程中pH在7-8之間有利于ARA的積累；pH4-5之間有利于生物量的積累，在培養(yǎng)過程中可分階段的調(diào)節(jié)pH水平以適應(yīng)所要求的生長環(huán)境。
[0024]接種量可以在2%至14%(V/V)，接種量低，生物量達(dá)不到所要求的水平，接種量高，在生物量積累到一定程度將會抑制菌體的繼續(xù)生長，在搖瓶培養(yǎng)中，接種控制在3%-5%(V/V)，而在發(fā)酵罐培養(yǎng)中，接種量控制在8%-10%(V/V)能得到較好的結(jié)果。
[0025]培養(yǎng)基中碳氮比影響真菌油脂的積累，碳氮比在10:1至60:1之間，較好的是40:1至50: 1，在培養(yǎng)過程中可以選擇滅菌前一次性加入或培養(yǎng)開始后分批加入。
[0026]微生物的生長需要維生素等生長因子，當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境中缺乏維生素時(shí)，細(xì)胞內(nèi)RNA、DNA以及蛋白質(zhì)的含量會下降。添加維生素B1、維生素B12、生物素及泛酸鈣最有利于ARA的積累，其用量分別在50-150mg/L、300-600μ g/L、400-600 μ g/L及80-150mg/L之間。谷氨酸可以提高細(xì)胞中G6TOH的活性，為被孢霉細(xì)胞的生長提供核酸原料，從而與花生四烯酸的合成緊密相關(guān)，在培養(yǎng)基中添加0.5-2g/L的谷氨酸有利于ARA的積累。
[0027]為了提高高山被孢霉的耗糖能力及保存過程中的穩(wěn)定性，可對菌種進(jìn)行了高糖馴化培養(yǎng)，馴化后的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌種的耗糖能力及產(chǎn)油能力明顯提升，ARA的含量呈倍數(shù)增長。
[0028]發(fā)酵培養(yǎng)過程可采用分批發(fā)酵或補(bǔ)料-分批發(fā)酵，分批發(fā)酵要求營養(yǎng)物質(zhì)一次性加入，營養(yǎng)物含量過高可能在培養(yǎng)前期抑制真菌的生長而延長延滯期，發(fā)酵周期隨之延長，而營養(yǎng)物含量過低，在培養(yǎng)后期無法滿足真菌生長需要的營養(yǎng)補(bǔ)充。本領(lǐng)域的技術(shù)人員，可以通過一系列實(shí)驗(yàn)操作確定適宜的碳氮營養(yǎng)物含量；補(bǔ)料-分批發(fā)酵培養(yǎng)過程中，必須對培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行檢測，特別是當(dāng)葡萄糖濃度小于5g/L時(shí)，需要及時(shí)補(bǔ)充葡萄糖，這是需要分別滅菌的。上述兩種培養(yǎng)方式，在實(shí)施過程中，可能會出現(xiàn)起泡現(xiàn)象，這是不希望出現(xiàn)的，可以選擇在滅菌之間加入適量消泡劑或者在起泡現(xiàn)象出現(xiàn)時(shí)，適時(shí)地加入消泡劑防止產(chǎn)生過量泡沫。
[0029]根據(jù)上述優(yōu)化高山被孢霉的發(fā)酵條件，能夠獲得較高的生物量及總油脂含量，可以每12h或24h取樣測定生物量、油脂及ARA含量，或者培養(yǎng)結(jié)束收獲生物質(zhì)測定。
[0030]可以用多種方法對生物質(zhì)體進(jìn)行收獲，例如過濾、真空抽濾、離心、膜分離、絮凝沉淀等，一般的，選擇成本低且方便操作的過濾或真空抽濾收獲生物質(zhì)體。收獲后，可以選擇采用干菌體或濕菌體進(jìn)行油脂的萃取，本實(shí)施過程中，對菌體進(jìn)行干燥至含水量小于4%，此時(shí)，使用丙酮、乙醇、異丙醇等醇類、烷烴如正己烷、正庚烷等萃取油脂是較適宜的，但正己烷最佳。干燥后的菌體加入正己烷，進(jìn)行研磨、勻漿或減法破壁萃取，得到的萃取液進(jìn)行離心分離取上層，蒸發(fā)除去其中的有機(jī)溶劑，得到總油脂即粗油。
[0031]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果:原料易購、價(jià)格適中、培養(yǎng)基配制方便、發(fā)酵工藝簡便、花生四烯酸合成穩(wěn)定、油脂產(chǎn)量為16~28g/L，其中花生四烯酸產(chǎn)量在
6.5~16g/L，解決了花生四烯酸的發(fā)酵生產(chǎn)效率和產(chǎn)量低的問題、適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0032]圖1為高山被孢霉在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的發(fā)酵結(jié)果。
[0033]圖2高山被孢霉在添加了維生素、氨基酸和微量元素的培養(yǎng)基中的發(fā)酵結(jié)果。
[0034]圖3高山被孢霉在實(shí)施例3培養(yǎng)基中添加了混合氮源的發(fā)酵結(jié)果。
[0035]圖4馴化后的高山被孢霉在實(shí)施例4中的培養(yǎng)基中的發(fā)酵結(jié)果。
[0036]圖1~4分別為實(shí)施例2~5中不同培養(yǎng)基對高山被孢霉的生物量、總油脂和ARA產(chǎn)量的影響結(jié)果。在圖1~4中，橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間(h)，左縱坐標(biāo)為葡萄糖消耗情況Glucose ( , g/L),右縱坐標(biāo)分別為生物量Biomass (., g/L),總油脂Total fattyacid ( ★，g/L)和 ARA 產(chǎn)量(▲，g/L)。
【具體實(shí)施方式】
[0037]以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0038]實(shí)施例1.利用高山被孢霉生產(chǎn)ARA
[0039]在一個(gè)250mL搖瓶中培養(yǎng)高山被孢霉，載液量為50mL的活化培養(yǎng)基，150rpm，28°C，活化3天。再將活化后的菌株接入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，裝液量250mL的搖瓶裝入50mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，接種量10%(v/v)，于28°C往復(fù)式搖床培養(yǎng)5~6d，轉(zhuǎn)速150rpm，28°C，培養(yǎng)5d后收獲，抽濾收獲生物質(zhì)，將其恒溫干燥至恒重，用正己烷研磨萃取油脂，蒸發(fā)除去有機(jī)容劑后，得到總油脂5g/L。
[0040]活化培養(yǎng)基組成(g/L ):
[0041]
葡萄糖30
醇母粉4
[0042]KH2PO40.1
MgS04-7H200.3.H:余為水，pH6.0。
[0043]基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成(g/L):
[0044]葡萄糖40
醉母粉5
M g S (6.)..1 -7H2O0.1
KH2PO40.5
CaCO'0.05
ZnS04-7H200.1
[0045]其余為水，pH6.0.[0046]實(shí)施例2.利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基在發(fā)酵罐培養(yǎng)高山被孢霉生產(chǎn)ARA
[0047]2L發(fā)酵罐培養(yǎng)，裝液量1.5L基礎(chǔ)培養(yǎng)基(如實(shí)施例1)，將初始葡萄糖濃度定為60~65g/L，單獨(dú)滅菌，發(fā)酵溫度維持在28°C，初始攪拌轉(zhuǎn)速150~200rpm，通氣量Ivvm的條件下對高山被孢霉菌進(jìn)行分批發(fā)酵培養(yǎng)，滅菌前將PH調(diào)節(jié)至6.5~7.0，滅菌后的初始pH在6.0~6.5，培養(yǎng)12h后溶氧開始迅速下降，生長進(jìn)入對數(shù)期，培養(yǎng)48h之后生長開始進(jìn)入穩(wěn)定期，在整個(gè)生長周期中，初始PH值為6.0~6.5，過程中pH值先升高后降低再升高，隨著穩(wěn)定期的到來，最后PH值穩(wěn)定在7.0~7.9之間；溶氧隨著生物量的增加迅速下降，在對數(shù)生長期維持溶氧在0.5%~10%。
[0048]培養(yǎng)期間每12h取樣進(jìn)行生物質(zhì)及脂肪酸的分析。培養(yǎng)至第168h，開始收獲菌體，采用實(shí)施例1的方法，獲得干菌體18g/L，總油脂7g/L, ARA2.7g/L，發(fā)酵液中的葡萄糖濃度從初始的60g/L降至15g/L,具體結(jié)果如圖1所示。
[0049]實(shí)施例3.氨基酸、維生素和微量元素對高山被孢霉生物量及ARA油脂含量的影響
[0050]在實(shí)施例2的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加了生長因子(維生素、氨基酸)，以及微量元素來提
高產(chǎn)量。
[0051]加入的生長因子包括:
[0052]
維生素B1100~300pg/L
維生素B12501 ~65()Hg/L
生物紊5漏~7W)pg/L
泛酸鈣120~180mg/L
將扠酸0.5~2 g/L
[0053]維生素配成500X濃縮液，使用0.2 μ m無菌過濾膜過濾除菌，并放置4°C冰箱保存，待接種前直接加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加量為2mL/L。谷氨酸在滅菌前配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基時(shí)加入，隨培養(yǎng)基一同滅菌。
[0054]加入的微量元素包括(g/L):
[0055]FeCl3-6H20
H3BO3
0.5-0.75
MnCl2-4H20
0.8 ~1.0
CoCb-6H20
CuSO4-SH2O
0,002 ~0.004
NiS04-6H20
[0056]微量元素配成1000Χ濃縮液(即IL培養(yǎng)基中加入ImL微量元素濃縮液)，調(diào)至ΡΗ7。使用0.2 μ m無菌過濾膜過濾除菌，并放置4°C冰箱保存，待接種前直接加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。
[0057]為了制備接種菌體，將使用的種子接種在3個(gè)含50mL活化培養(yǎng)基的搖瓶中，在280C、150rpm培養(yǎng)3天后，菌體在發(fā)酵液中呈現(xiàn)的形態(tài)為球狀，直徑為2~4mm，或松散的菌絲聚集體。接種至載液量為1.5L的2L發(fā)酵罐，接種量10% (V/V)，若種子在搖瓶中生長的密度較低，則在接種至發(fā)酵罐時(shí)適當(dāng)?shù)脑黾咏臃N量。發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基為添加了生長因子(維生素、氨基酸)和微量元素的優(yōu)化培養(yǎng)基，進(jìn)行分批發(fā)酵培養(yǎng)。其中初始葡萄糖濃度為60~65g/L,分開滅菌，12CTC滅菌30min。
[0058]發(fā)酵罐的參數(shù)如下:溫度:28°C ;通氣:0.5~lvvm ；pH:用25%氨水維持在6.0左右；初始攪拌轉(zhuǎn)速:150rpm。
[0059]第12h，溶氧開始迅速下降，pH也開始下降，菌體生長進(jìn)入對數(shù)期，將轉(zhuǎn)速調(diào)至200rpm，此后I~2h內(nèi)開始產(chǎn)生泡沫，加入適量消泡劑。此后將轉(zhuǎn)速調(diào)至250rpm。
[0060]接種時(shí)，發(fā)酵罐中的菌體是直徑為I~2mm的小球狀，外緣光滑，培養(yǎng)至12h開始，球體開始變大，至24h，球體形狀更清晰，繼續(xù)變大，48h開始罐內(nèi)菌體密度增大，至72h，球體外緣顯得蓬松，且出現(xiàn)類似羽毛絮狀的松散菌絲體，這可能由于較大的球狀菌體開始解體,至120h,球的直徑在2~4mm之間，同時(shí)形成了許多松散的菌絲聚集體。每隔12h對發(fā)酵罐進(jìn)行取樣進(jìn)行生物量及脂肪酸的分析，168h后發(fā)酵結(jié)束，罐內(nèi)發(fā)酵液的最終體積為
1.2L。獲得干菌體21g/L，總油脂9g/L，ARA3.8g/L，發(fā)酵液中的葡萄糖濃度從初始的65g/L降至13g/L，具體結(jié)果如圖2所示。
[0061]實(shí)施例4.混合氮源對高山被孢霉高山被孢霉生物量及ARA油脂含量的影響
[0062]這一組實(shí)驗(yàn)通過使用混合氮源來進(jìn)一步提高產(chǎn)量，過程與實(shí)施例3基本相同，添加的混合氮源的組成成分及比例通過一系列實(shí)驗(yàn)得到。
[0063]添加的混合氮源包括(g/L):
[0064]玉米漿3
[0065]酵母粉7
[0066]發(fā)酵罐在第Ilh，溶氧開始迅速下降，在約第14h開始產(chǎn)生少量泡沫，通過人工加入消泡劑控制。至24h，菌體為直徑I~2mm的球狀，至48h，菌體為直徑2~3mm的球狀，外緣光滑，至72h，開始出現(xiàn)松散的羽毛絮狀菌絲聚集體，球體外緣松散。每隔12h對發(fā)酵罐進(jìn)行取樣進(jìn)行生物量及脂肪酸的分析，168h后收獲，獲得干菌體36g/L，總油脂16g/L，ARA6.5g/L，發(fā)酵液中的葡萄糖濃度從初始的60g/L降至5g/L，具體結(jié)果如圖3所示。[0067]實(shí)施例5.利用馴化后的高山被孢霉生產(chǎn)ARA
[0068]為使高山被孢霉在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收更為充分，減少原料的浪費(fèi)，提高菌種耗糖能力，對菌種進(jìn)行了馴化，主要通過固體培養(yǎng)基及液體培養(yǎng)基的逐級高糖馴化，提高菌體的耗糖能力，且馴化后的菌種均呈現(xiàn)為有利于油脂積累的外緣帶刺狀的松散球體。利用該馴化后的菌種，使用實(shí)施例4中所述的優(yōu)化后培養(yǎng)基進(jìn)行分批補(bǔ)料培養(yǎng)，及當(dāng)葡萄糖濃度降至10g/L左右，流加600g/L葡萄糖，使殘?zhí)强刂圃?0g/L左右，其余操作過程與實(shí)施4相同。
[0069]發(fā)酵過程中用25%氨水調(diào)節(jié)控制pH在6.0-6.5。
[0070]第12h，菌體開始生長，菌體為外緣刺狀的小球,直徑I-2mm，之后隨著菌體大量生長，呈現(xiàn)為外緣刺狀的松散的球狀，直徑2-5mm，此時(shí)pH開始下降，這是糖代謝先產(chǎn)生酮酸等有機(jī)酸，而后被利用再逐漸上升，此時(shí)，允許PH降至4.5，至72h，pH會隨著菌體進(jìn)入穩(wěn)定期緩慢回升，此時(shí)菌體主要為外緣刺狀的松散的球狀，其次為羽毛絮狀的菌絲聚集體，至98h，將pH緩慢升至6.5-7.5之間，但不高于8.0。每隔12h對發(fā)酵罐進(jìn)行取樣進(jìn)行生物量及脂肪酸的分析，[0071]培養(yǎng)168h后開始收獲，獲得干菌體58g/L，總油脂28g/L，ARA16g/L，發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液中的葡萄糖濃度趨于零。根據(jù)本實(shí)施例進(jìn)行的分批發(fā)酵結(jié)果顯示，ARA產(chǎn)量較之前已有大幅度提高，具體結(jié)果如圖4所示。
【權(quán)利要求】
1.一種花生四烯酸的制備方法，其特征在于包括以下步驟:1)通過搖瓶實(shí)驗(yàn)對高山被孢霉產(chǎn)ARA的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，所述優(yōu)化的方法為取4mL種子液接入裝有50mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基(葡萄糖40g/L ;酵母粉5g/L ；MgS04-7H200.lg/L ；KH2PO40.5g/L ；CaCO30.05g/L ；ZnS04-7H200.lg/L ；pH6.0)的 250mL 三角瓶，28 °C、150rpm培養(yǎng)5-6d，得到優(yōu)化培養(yǎng)基:葡萄糖60g/L ;酵母粉或玉米漿10g/L ;谷氨酸1.0g/L ；MgS04-7H200.lg/L ；KH2P042.0g/L ；CaCO30.05g/L ；ZnS04-7H200.lg/L ;混合微量元素 lmL/L ；混合維生素lmL/L ；pH調(diào)至6.0 ；2)對高山被孢霉在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進(jìn)行了2L分批發(fā)酵，培養(yǎng)至第168h，開始收獲菌體，獲得干菌體、油脂和ARA ；3)對高山被孢霉在優(yōu)化培養(yǎng)基中分別以酵母粉和玉米漿為氮源進(jìn)行了2L分批發(fā)酵，再以酵母粉為氮源進(jìn)行的發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)，菌體生長正常，未發(fā)生自溶現(xiàn)象，并獲得干菌體、油脂和ARA;4)對高山被孢霉在優(yōu)化培養(yǎng)基中以玉米漿和酵母粉為混合氮源進(jìn)行培養(yǎng)，將步驟I)中的優(yōu)化培養(yǎng)基中的氮源替換為玉米漿和酵母粉，得混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基；5)對高山被孢霉在混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基中進(jìn)行2L分批發(fā)酵，在2L發(fā)酵罐中裝入混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基，培養(yǎng)168h后收獲干菌體、油脂和ARA ；6)對高山被孢霉進(jìn)行高糖馴化及對馴化后的菌種在混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基中進(jìn)行2L分批發(fā)酵，在當(dāng)葡萄糖濃度降至10g/L時(shí)，流加600g/L葡萄糖，使殘?zhí)强刂圃?0g/L左右，其余操作過程與步驟5)相同，培養(yǎng)168h后開始`收獲干菌體、油脂和ARA。
2.如權(quán)利要求1所述一種花生四烯酸的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述混合微量元素包括 FeCl3.6H20,、H3BO3> MnCl2.4H20、CoCl2.6H20、CuSO4.5H20、NiSO4.6H20。
3.如權(quán)利要求1所述一種花生四烯酸的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述混合維生素包括維生素B12、生物素、維生素B1、泛酸鈣。
4.如權(quán)利要求1所述一種花生四烯酸的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述發(fā)酵的條件為:將培養(yǎng)3d的液體種子，按10%接種量接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，裝液量1.5L，初始葡萄糖濃度為60g/L，在28°C，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，通氣量lvvm。
5.如權(quán)利要求1所述一種花生四烯酸的制備方法，其特征在于在步驟3)中，所述發(fā)酵的條件與步驟2)的發(fā)酵條件相同。
6.如權(quán)利要求1所述一種花生四烯酸的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述培養(yǎng)的方法與步驟I)中的培養(yǎng)方法相同。
7.如權(quán)利要求1所述一種花生四烯酸的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述玉米漿和酵母粉的質(zhì)量比為3: 8。
8.如權(quán)利要求1所述一種花生四烯酸的制備方法，其特征在于在步驟5)中，所述混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基的加入量為1.5L ;所述混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基中葡萄糖的初始濃度為60g/L，接種量10%，初始pH用25%氨水控制在6.0-6.5，溫度28°C、轉(zhuǎn)速250rpm。
9.如權(quán)利要求1所述一種花生四烯酸的制備方法，其特征在于在步驟6)中，所述2L分批發(fā)酵的具體方法為:首先采用固體培養(yǎng)基馴化，將菌種逐級涂布于梯度高糖平板培養(yǎng)，挑選經(jīng)固體馴化后能耐受10%高糖濃度平板的菌種轉(zhuǎn)接到兩種含不同氮源的梯度高糖液體培養(yǎng)基中進(jìn)行馴化，接著對該馴化后的菌種，使用步驟4)中所述的混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基進(jìn)行分批發(fā)酵。
10.如權(quán)利要求9所述一種花生四烯酸的制備方法，其特征在于所述梯度高糖平板的含糖量分別為2%、5%、7%、10%和15% ;所述兩種含不同氮源的梯度高糖的含糖量分別為3%、4%、5% 和 6% ο
【文檔編號】C12P7/64GK103451247SQ201310416765
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月13日
【發(fā)明者】盧英華, 曾思鈺, 凌雪萍, 敬科舉, 吳意珣, 陳翠雪 申請人:廈門大學(xué)