一種獲取辣椒抗根結(jié)線蟲基因的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種獲取辣椒抗線蟲基因的方法，包括如下步驟，(1)通過辣椒葉片組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)轉(zhuǎn)錄中獲得的基因拼接，經(jīng)過篩選得到抗根結(jié)線蟲基因；(2)對(duì)篩選出的基因PCR擴(kuò)增，并測(cè)序獲得基因全長。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為，找出了一種新的抗根結(jié)線蟲基因，可以利用基因沉默技術(shù)證實(shí)了敲低降低該基因可以使辣椒抗根結(jié)線蟲作用顯著降低，我們可以利用得到的基因注入到辣椒中，使辣椒的每個(gè)品種都具有抗根結(jié)線蟲的作用，減少殺蟲劑的使用，就可使辣椒的食用更安全，提高辣椒的產(chǎn)量。
【專利說明】一種獲取辣椒抗根結(jié)線蟲基因的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物基因【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一種獲取辣椒抗根結(jié)線蟲基因的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]根結(jié)線蟲對(duì)植物的危害，根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)的寄主范圍很廣，超過3000種植物，其危害遍及糧食作物和蔬菜等，尤其以茄科、葫蘆科、十字花科植物等最為嚴(yán)重。最常見的為南方根結(jié)線蟲(M.1ncognita)、爪睡根結(jié)線蟲(M.javanica)、花生根結(jié)線蟲(M.arenaria)、和北方根結(jié)線蟲(M.hap I a)。
[0003]根結(jié)線蟲侵染植物的危害主要表現(xiàn)為兩個(gè)方面:一方面根結(jié)線蟲在植物的根系上形成根結(jié)，從而破壞水分和養(yǎng)分的吸收能力，導(dǎo)致減產(chǎn)。在這種情況下其危害與線蟲的密度緊密相關(guān)。另一方面根結(jié)線蟲與其他的病原物發(fā)生聯(lián)合侵染，形成復(fù)合病害加重對(duì)寄主的危害。在根結(jié)線蟲侵染時(shí)造成的傷口有利于疫病、枯萎病、及立枯病菌的侵染，在這種情況下根結(jié)線蟲往往很小的群體就可以造成嚴(yán)重的危害。植物寄生性線蟲每年造成的損失估計(jì)為1570億美元，特別是南方根結(jié)線蟲幾乎侵染所有的栽培植物。在感病番茄上至少要造成50%以上的損失。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)中根結(jié)線蟲基因的研究進(jìn)展，對(duì)于番茄和辣椒等茄科植物來說，防治根結(jié)線蟲主要采用抗線蟲育種的策略，因?yàn)樵诜押屠苯分幸呀?jīng)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)抗線蟲顯性基因，在一年生野生辣椒及其近緣種中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大約有100份材料對(duì)根結(jié)線蟲具有抗性，其中絕大多數(shù)都抗南方根結(jié)線 蟲。我國的辣椒資源豐富，但是缺乏系統(tǒng)的材料抗性鑒定，目前只有一個(gè)抗根結(jié)線蟲基因被報(bào)道。但是通過報(bào)道已經(jīng)證實(shí)，在茄科植物中，抗植物寄生性線蟲的R基因中NBS-LRR結(jié)構(gòu)為共同的保守區(qū)域，包括M1-1，Hero A, Gpa2，Grol和Ma等均屬于NBS-LRR基因家族。NBS結(jié)構(gòu)可與ATPase酶進(jìn)行結(jié)合進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞程序性死亡。
[0005]現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的抗根結(jié)線蟲的顯性基因:(I)N基因
[0006]Hare et al 1957在辣椒(C.annuum cv.Santaka)中已經(jīng)證實(shí)存在單一的顯性基因N,對(duì)三種主要的根結(jié)線蟲M.arenaria, M.javanica, M.1ncognita具有抗性,但是這種抗性在高于28°C時(shí)會(huì)有部分喪失。分別為含有N基因的辣椒品種。
[0007](2) Me 基因
[0008]一個(gè)主要的抗根結(jié)線蟲基因家族Me存在于在辣椒屬植物中，應(yīng)用雙單倍體辣椒株系多個(gè)Me基因已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，其中有6個(gè)為抗性熱穩(wěn)定型基因(Mel、Me3、Me7、Me4、Mechl、Mech2)，并且它們的基因簇被定位于P9染色體上，屬于同一個(gè)基因簇，基因組范圍內(nèi)從0_28cM,且這些基因與抗細(xì)菌的BS2抗細(xì)菌(Xanthomonas campestris)屬于同一簇，這些基因主要存在于三個(gè)辣椒材料中 PI322719，PI201234, CM334 (Criollo de Morelos334)。Djian-Caporalino等采用BSA和AFLP等方法對(duì)這6個(gè)基因成功的進(jìn)行了分子標(biāo)記。
[0009]其中，Mel、Me3、Me7三個(gè)基因的抗譜較廣，抗三種主要的根結(jié)線蟲M1、M j、Ma，Me4則只對(duì)南方根結(jié)線蟲Mi起作用，而Mechl、Mech2兩個(gè)抗檢疫性根結(jié)線蟲Mchitwoodi。Mel、Mech2存在于辣椒材料PM217中，并且輕微的連鎖。Me3、Me4存在于辣椒材料PM217中，并且連鎖。Me7、Mechl存在于辣椒材料PM704中。
[0010]Mel、Me3兩個(gè)基因雖然抗譜相近，但作用方式和對(duì)溫度的反應(yīng)卻大不相同。Mel的抗性反應(yīng)開始于線蟲在取食位點(diǎn)定居之后，抗性反應(yīng)較慢，主要發(fā)生在線蟲侵染后巨型細(xì)胞的形成過程中，在高溫下其抗性會(huì)部分喪失。而Me3發(fā)生在侵染的早期，在幼蟲與根接觸時(shí)就即刻產(chǎn)生過敏性壞死反應(yīng)，通過試驗(yàn)中超微結(jié)構(gòu)的觀察，證實(shí)含有Me3基因的植株對(duì)線蟲的侵染表現(xiàn)為侵染點(diǎn)附近的細(xì)胞的過敏性壞死，這種過敏性死亡與線蟲穿透和取食直接相關(guān)，并在42 C的聞溫下也能保持完全活性。
[0011 ] (2)Mi 基因
[0012]Mi基因是來源于番茄的抗根結(jié)線蟲基因，抗三個(gè)主要的根結(jié)線蟲M.arenaria,M.javanica, M.1ncognita。同時(shí)還具有抗馬鈴薯姆蟲(Macrosiphum euphorbiae)和煙粉風(fēng)(Bemisia tabaci)的作用。Mi基因是通過種間異型雜交法從野生種導(dǎo)入栽培番爺種中，在番茄抗根結(jié)線蟲育種中被成功的應(yīng)用。這種野生型番茄中存在著多種抗病基因，除M1-1外還發(fā)現(xiàn)了多個(gè)熱穩(wěn)定性抗根結(jié)線蟲基因和抗Mi毒性線蟲群體的基因，然而這種熱穩(wěn)定性的抗性基因和抗毒性線蟲群體的基因是否為同一個(gè)顯性基因，還是有著緊密的連鎖現(xiàn)在仍然不清楚。
[0013]Mi基因表現(xiàn)為侵染點(diǎn)附近細(xì)胞的過敏性壞死，最早的可見反應(yīng)發(fā)生在接種以后12h內(nèi)，正是線蟲開始誘導(dǎo)巨型細(xì)胞形成時(shí)。然而Mi基因具有熱敏感性，抗性在高溫下(高于28°C )可以消失，溫度試驗(yàn)證明決定抗性的溫度僅僅發(fā)生在侵染后的24-48h內(nèi)，超過這個(gè)時(shí)間段，即使溫度合適也不再表現(xiàn)為抗性。Mi基因在高溫下抗性降低可能由于超氧化物岐化酶和過氧化氫酶活性增加降低了超氧化物和過氧化氫的含量而使抗性降低，這兩種物質(zhì)與木質(zhì)素的合成緊密相關(guān)。現(xiàn)在，通過發(fā)現(xiàn)水楊酸和茉莉酸均與Mi基因的抗性表達(dá)相關(guān)。
[0014]Mi基因編碼含有1257個(gè)氨基酸的蛋白，屬于NBS / LRR結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)家族基因。Mi基因與其它植物抗病基因具有相似性，并且經(jīng)常與其它的抗性基因成簇存在，例如，Mi基因與抗真菌基因cf2和cf5的距離只有l(wèi)cM。且在根結(jié)線蟲侵染的根中可以同時(shí)表達(dá)多達(dá)6個(gè)具有NBS-LRR結(jié)構(gòu)的基因。
[0015]Mi基因是一個(gè)重要的抗根結(jié)線蟲基因家族，目前國際上在番茄中發(fā)現(xiàn)了 9個(gè)抗根結(jié)線蟲基因，原來的Mi抗性位點(diǎn)表示為M1-1，新發(fā)現(xiàn)的抗性基因分別稱作為M1-2?M1-9，其中以M1-3，M1-5，M1-9基因應(yīng)用價(jià)值較大。溫敏性的顯性基因M1-3與熱穩(wěn)定性基因M1-5、M1-9對(duì)南方根結(jié)線蟲的非毒性群體都表現(xiàn)抗性。M1-l、M1-9被定位于番茄6號(hào)染色體的短臂上；而M1-3，M1-5被定位在12染色體的遠(yuǎn)端，并且緊密連鎖。
[0016]Me基因和Mi基因的特性是相似，但是Me基因和Mi基因是兩類不同的抗根結(jié)線蟲基因，抗Mi基因的毒性根結(jié)線蟲株系不能侵染含Me基因的辣椒，同樣抗Me基因的毒性根結(jié)線蟲株系也不能侵染含Mi基因的番茄。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0017]目前根結(jié)線蟲發(fā)生嚴(yán)重，現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些抗性基因，但是有抗譜不夠廣泛，對(duì)高溫敏感等缺陷，所以需要發(fā)現(xiàn)更多的抗線蟲基因。本發(fā)明提供了一種獲取辣椒抗根結(jié)線蟲基因的方法，實(shí)現(xiàn)找到了新的一種抗根結(jié)線蟲的目的。[0018]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為，一種獲取辣椒抗根結(jié)線蟲基因的方法，該方法包括如下步驟，(I)通過辣椒葉片組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)轉(zhuǎn)錄中獲得的基因拼接，經(jīng)過篩選得到抗根結(jié)線蟲基因；(2)對(duì)篩選出的基因PCR擴(kuò)增，并測(cè)序獲得基因全長。根據(jù)設(shè)計(jì)的總思路，最終得到辣椒葉片組織中抗根結(jié)線蟲基因，該基因可以用于轉(zhuǎn)基因技術(shù)，為抗性育種提供了抗性基因資源。
[0019]所述步驟(I)的具體操作方法為，①利用trizol方法提取辣椒葉片組織的總RNA，進(jìn)行高通量測(cè)序獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并采用反轉(zhuǎn)錄酶獲得第一鏈CDNA ;②對(duì)轉(zhuǎn)錄中獲得的基因進(jìn)行拼接，從中篩選具有NBS-LRR結(jié)構(gòu)的候選基因，將這些候選基因利用NCBI BLAST與番茄抗線蟲基因序列Mi進(jìn)行同源對(duì)比，其中同源度高的基因即為所要得到的抗根結(jié)線蟲基因。
[0020]所述步驟(2)的具體操作方法為，①根據(jù)(I)步得到的抗根結(jié)線蟲基因設(shè)計(jì)上游引物和下游引物，上游引物的序列是atggcatttatttgtacata,下游引物的序列是ctacttaaataaggggatatt ;②對(duì)(I)步得到的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系包括如下成份:
[0021]
【權(quán)利要求】
1.一種獲取辣椒抗根結(jié)線蟲基因的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟，(I)通過辣椒葉片組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)轉(zhuǎn)錄中獲得的基因拼接，經(jīng)過篩選得到抗根結(jié)線蟲基因；(2)對(duì)篩選出的基因PCR擴(kuò)增，并測(cè)序獲得基因全長。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獲取辣椒抗根結(jié)線蟲基因的方法，其特征在于，所述步驟(I)的具體操作方法為，①利用trizol方法提取辣椒葉片組織的總RNA，進(jìn)行高通量測(cè)序獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并采用反轉(zhuǎn)錄酶獲得第一鏈CDNA ;②對(duì)轉(zhuǎn)錄中獲得的基因進(jìn)行拼接，從中篩選具有NBS-LRR結(jié)構(gòu)的候選基因，將這些候選基因利用NCBI BLAST與番茄抗線蟲基因序列Mi進(jìn)行同源對(duì)比，其中同源度高的基因即為所要得到的抗根結(jié)線蟲基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獲取辣椒抗根結(jié)線蟲基因的方法，其特征在于，所述步驟(2)的具體操作方法為，①根據(jù)(I)步得到的抗根結(jié)線蟲基因設(shè)計(jì)上游引物和下游引物，上游引物的序列是atggcatttatttgtacata,下游引物的序列是ctacttaaataaggggatatt ;②對(duì)(I)步得到的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系包括如下成份:
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從辣椒中獲取抗根結(jié)線蟲基因的方法，其特征在于，對(duì)所述⑵得到的基因進(jìn)行驗(yàn)證是否有抗根結(jié)線蟲作用的具體操作方法為:①從步驟(2)得到的抗根結(jié)線蟲基因中，選取首端、尾端特異區(qū)域的基因序列，首端特異區(qū)域的基因序列記為PNR1、尾端特異區(qū)域的基因序列記為PNR2 ;②結(jié)合基因沉默表達(dá)載體PTVOO的BamH1、KpnI酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)PNRl和PNR2的特異引物，PNRl的上游引物序列為gagacaacctggttaattag,PNRl 的下游引物序列為 aattcaaattatttcgaact ；PNR2 的上游引物序列為attggttcccgaaattg,下游引物序列為ttccttaatcttccgagctg ;③用帶有酶切位點(diǎn)的上述兩對(duì)引物，采用高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增，最終得到擴(kuò)增出PNRl片段和PNR2片段的抗根結(jié)線蟲基因，PCR擴(kuò)增體系均包括如下成份:
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103436527SQ201310386575
【公開日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年8月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月30日
【發(fā)明者】茆振川, 王剛, 凌鍵, 陳國華, 楊宇紅, 謝丙炎 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所