一種嗜熱一氧化碳鏈霉菌新菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種嗜熱一氧化碳鏈霉菌（Streptomyces?thermocarboxydus）新菌株CF1，其保藏號(hào)為CGMCC?No.6873，保藏日期為2012年11月23日，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。本發(fā)明還公開(kāi)了含有其的菌劑。在堆體中接種本發(fā)明的嗜熱一氧化碳鏈霉菌新菌株CF1，在北方低溫季節(jié)能迅速提高堆體溫度，且能使堆體保持50℃以上的高溫15天，縮短了發(fā)酵周期，能有效殺滅動(dòng)物糞便中的病原物和寄生蟲(chóng)。堆肥發(fā)酵結(jié)束后，堆肥產(chǎn)物養(yǎng)分含量高，pH8.0左右，可作為優(yōu)良的植物有機(jī)肥使用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種嗜熱一氧化碳鏈霉菌新菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于土壤肥料領(lǐng)域，具體涉及一種農(nóng)用微生物制劑及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，人們的生活水平不斷提高，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了巨大的變化，其中畜禽產(chǎn)品在飲食結(jié)構(gòu)中占據(jù)著不可缺少的重要作用，由此推動(dòng)了畜禽養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展。近二十年，一批集約化程度越來(lái)越高的養(yǎng)殖場(chǎng)紛紛在政府的大力支持下在方便運(yùn)輸?shù)某鞘薪h(yuǎn)郊建立，飼養(yǎng)數(shù)量由少變多，大量的畜禽糞便因沒(méi)有及時(shí)無(wú)害化處理而隨意丟棄在自然環(huán)境中，造成了資源的極大浪費(fèi)和環(huán)境污染。在滿足了人們對(duì)肉、蛋、乳需求的同時(shí)，給我國(guó)的自然生態(tài)環(huán)境帶來(lái)了巨大的壓力，導(dǎo)致嚴(yán)重的污染。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明首先提供嗜熱一氧化碳鏈霉菌(Streptomyces thermocarboxydus)新菌株CFl。
[0004]本發(fā)明還提供含有嗜熱一氧化碳鏈霉菌CFl的菌劑。
[0005]本發(fā)明的菌株分離與篩選過(guò)程如下:
[0006]①采用平板稀釋法分別從新鮮牛糞、高溫發(fā)酵階段牛糞以及腐熟后的牛糞中進(jìn)行微生物分離。稱(chēng)取各樣品各IOg分別放入裝有90mL無(wú)菌水的三角瓶中，在搖床上振蕩30min，使樣品充分分散，靜置20min后即為KT1稀釋液，然后連續(xù)稀釋制成10_2_10_8濃度的稀釋液備用。取100 μ L各濃度的稀釋液，采用常規(guī)涂抹法用涂布器在高氏I號(hào)固體培養(yǎng)基上涂布，每個(gè)濃度梯度三個(gè)重`復(fù)，分別置于25°C、30°C、50°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3d后挑取平板上長(zhǎng)出的單菌落，進(jìn)一步純化培養(yǎng)，并于4°C保存。
[0007]高氏I 號(hào)培養(yǎng)基為可溶性淀粉 20.0g/L、KN03 1.0g/L、K2HPO4 0.5g/L、MgSO4.7H20
0.5g/L、NaCl 0.5g/L、FeSO4 0.01g/L、水 1000ml, pH7.2-7.4、瓊脂 1.5%-2.0%。
[0008]②根據(jù)菌株在纖維素一剛果紅平板上形成透明圈的快慢、透明圈明晰程度、透明圈與菌落直徑比值(D/d)的大小，篩選出了 I株高溫菌，該菌株在培養(yǎng)的第2天即出現(xiàn)清晰的透明圈，在培養(yǎng)第5天D/d達(dá)到11.3。該菌株菌落近圓形，表面絨毛狀、松散、邊緣菌絲較緊密，呈灰色；基部顏色淺褐色。
[0009]③利用16SrDNA-PCR技術(shù)對(duì)該菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，測(cè)定了 16SrDNA的序列，序列如SEQ ID N0.1所示，與其它公布的嗜熱一氧化碳鏈霉菌的16SrDNA的序列同源性為99%,鑒定為嗜熱一氧化碳鏈霉菌(Streptomyces thermocarboxydus),命名為CFl,并于2012年11月23日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCCN0.6873。
[0010]本發(fā)明的嗜熱一氧化碳鏈霉菌CFl可制備成菌劑，其中，嗜熱一氧化碳鏈霉菌CFl的活菌數(shù)可為50億/克以上，優(yōu)選為100億/克以上。[0011]本發(fā)明還提供所述生物菌劑的制備方法，其為在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵嗜熱一氧化碳鏈霉菌CFl，將得到的發(fā)酵液即為生物菌劑。
[0012]其中，優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基為高氏I號(hào)液體培養(yǎng)基。
[0013]優(yōu)選的，所述的制備方法可具體包括如下步驟:
[0014]將嗜熱一氧化碳鏈霉菌CFl接種至高氏I號(hào)固體培養(yǎng)基斜面，于50°C恒溫條件培養(yǎng)48-72h得到斜面種子；
[0015]將斜面種子接種至高氏I號(hào)液體培養(yǎng)基，于50°C恒溫條件，120-200r/min轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)48-72h得到液體種子；
[0016]將液體種子以0.5-10% (V/V，即每100ml液體培養(yǎng)基接種0.5-lOml液體種子)接種量，接種到液體發(fā)酵罐中的生產(chǎn)培養(yǎng)基中，進(jìn)行菌種生產(chǎn)，于持續(xù)通氣條件下，50°C恒溫培養(yǎng)3-4天。培養(yǎng)結(jié)束后，將菌種盛放于滅菌的容器內(nèi)，置于陰涼干燥處保存。
[0017]優(yōu)選的，還可以根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)方法將制備的嗜熱一氧化碳鏈霉菌CFl發(fā)酵液進(jìn)行冷凍干燥，從而制備凍干粉形式的生物菌劑。
[0018]進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供一種用于動(dòng)物糞便發(fā)酵的復(fù)合菌劑，其包括枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和權(quán)利要求1所述的嗜熱一氧化碳鏈霉菌CFl。
[0019]其中，所述枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為10億/克以上，所述的巨大芽孢桿菌活菌數(shù)為20億/克以上，所述的嗜熱一氧化碳鏈霉菌CFl的活菌數(shù)為20億/克以上。
[0020]本發(fā)明的巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌均可市售獲得，如購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，巨大芽孢桿菌CICC 20611，枯草芽孢桿菌CICC 10090。當(dāng)然本發(fā)明不限于這兩種菌株。`
[0021]在堆體中接種本發(fā)明的嗜熱一氧化碳鏈霉菌新菌株CF1，能在北方低溫季節(jié)迅速提高堆體溫度，且能使堆體保持50°C以上的高溫15天，縮短了發(fā)酵周期，能有效殺滅動(dòng)物糞便中的病原物和寄生蟲(chóng)。堆肥發(fā)酵結(jié)束后，堆肥結(jié)束后養(yǎng)分含量高，PH8.0左右，可作為優(yōu)良的植物有機(jī)肥使用。
[0022]在堆體中接種包含本發(fā)明的嗜熱一氧化碳鏈霉菌新菌株CFl的復(fù)合菌劑，不僅在北方低溫季節(jié)能迅速提高堆體溫度，高溫期長(zhǎng)，發(fā)酵周期縮短，而且堆肥結(jié)束后養(yǎng)分含量損失少，產(chǎn)品的養(yǎng)分含量大幅提高，比接種市售EM菌劑和自然堆肥的產(chǎn)品養(yǎng)分含量顯著增加。
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0024]若無(wú)特別說(shuō)明，本發(fā)明中所述的“份”是指“重量份”；巨大芽孢桿菌菌株CICC20611,枯草芽孢桿菌CICC 10090菌株購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。
[0025]實(shí)施例1嗜熱一氧化碳鏈霉菌菌劑的制備
[0026]將嗜熱一氧化碳鏈霉菌CFl接種至高氏I號(hào)固體培養(yǎng)基斜面，于50°C恒溫條件培養(yǎng)72h得到斜面種子；
[0027]將斜面種子接種至高氏I號(hào)液體培養(yǎng)基，于50°C恒溫條件，180r/min轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)72h得到液體種子；
[0028]將液體種子以5% (V/V,即每100ml液體培養(yǎng)基接種5ml液體種子)接種量,接種到液體發(fā)酵罐中的生產(chǎn)培養(yǎng)基中，進(jìn)行菌種生產(chǎn)，于持續(xù)通氣條件下，50°C恒溫培養(yǎng)4天。培養(yǎng)后的發(fā)酵液即可作為菌劑使用。
[0029]所述的高氏I號(hào)固體培養(yǎng)基成分為:每1000ml蒸餾水中加入可溶性淀粉20.0g,KNO3 1.0g, K2HPO4 0.5g, MgSO4.7H20 0.5g, NaCl 0.5g, FeSO4 0.01g，瓊脂 20.0g，調(diào)節(jié) pH為7.2-7.4。分裝入試管中，每管5-10ml，塞上棉塞，高溫高壓滅菌20min，之后擺成斜面。
[0030]所述的高氏I號(hào)液體培養(yǎng)基成分為:每1000ml蒸餾水中加入可溶性淀粉20.0g,KNO3 1.0g, K2HPO4 0.5g，MgSO4.7H20 0.5g, NaCl 0.5g, FeSO4 0.01g，調(diào)節(jié) pH 為 7.0。分裝Λ 500ml三角瓶中，每瓶150ml,塞上棉塞，高溫高壓滅菌20min。
[0031]實(shí)施例2
[0032]將新鮮牛糞與粉碎秸桿以干重6:1的比例進(jìn)行混合，或根據(jù)牛糞、鋸末的理化性質(zhì)適當(dāng)調(diào)整比例，使混合物的C/N為30，含水量為60%。
[0033]將實(shí)施例1生產(chǎn)的菌劑按照質(zhì)量比5%。接種到堆料混合物中，定期翻堆通氣，進(jìn)行發(fā)酵堆肥發(fā)酵。同時(shí)以不接入本發(fā)明的菌劑的堆體為對(duì)照。
[0034]接種本發(fā)明所述微生物菌劑的牛糞與自然堆肥的牛糞相比，升溫速度快，堆體最高溫度高，發(fā)酵周期短，其C/N下降迅速，這些結(jié)果表明向牛糞中接種本發(fā)明所述的微生物菌劑能夠加快牛糞堆肥的腐熟程度。
[0035]通過(guò)對(duì)比分析接種本發(fā)明所述微生物菌劑的牛糞與自然堆肥的牛糞堆肥結(jié)束后堆料的養(yǎng)分含量，發(fā)現(xiàn)接種本發(fā)明所述微生物菌劑的牛糞堆肥結(jié)束后，其全氮、全磷、全鉀以及有機(jī)質(zhì)含量均顯著高于自然堆肥的牛糞，這表明向牛糞中接種本發(fā)明所述的菌劑更有利于堆肥中養(yǎng)分轉(zhuǎn)化與保存。接種本發(fā)明所述微生物菌劑的牛糞與自然堆肥的牛糞在腐熟程度和養(yǎng)分含量各指標(biāo)上的差別見(jiàn)表1和表2。
[0036]表1本發(fā)明所述微生物菌劑對(duì)堆肥腐熟程度的影響
菌刺達(dá)到55?fC?I堆配結(jié)束后
處理天數(shù)t取咼溫程’C/N
[0037]_建_下天數(shù)_
CFl21.565 -2314.8
CK685 8''C3620.4
[0038]堆肥初期菌劑促進(jìn)分解堆體中游離的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可以使堆體溫度迅速上升，進(jìn)而又促進(jìn)微生物的繁殖，對(duì)溫度上升和微生物繁殖起良性循環(huán)作用，推動(dòng)溫度達(dá)到最高溫度，溫度達(dá)到最高的時(shí)候，是微生物反應(yīng)最激烈的時(shí)候，大量有機(jī)質(zhì)被降解，碳源被轉(zhuǎn)化為CO2,而導(dǎo)致堆體質(zhì)量下降。溫度是堆體內(nèi)部反應(yīng)情況的外在表現(xiàn)。溫度上升越快、高溫持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)，堆體內(nèi)部被充分反應(yīng)得越充分，越有利于被固定的養(yǎng)分的釋放。在最高溫階段反應(yīng)越充分，被消耗的游離的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和可降解的有機(jī)物質(zhì)就會(huì)越少，不會(huì)導(dǎo)致有機(jī)肥在施肥后出現(xiàn)燒苗現(xiàn)象。大量有機(jī)物在高溫階段被降解后，只有少量的可降解的物質(zhì)在后面后熟階段被分解。前期分解的物質(zhì)越多越充分，后熟分解的就越少越緩和，溫度就會(huì)越低，最終溫度會(huì)接近室溫。同時(shí)高溫持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，能夠徹底的殺滅動(dòng)物糞便中的病原物。因此，本發(fā)明篩選的嗜熱一氧化碳鏈霉菌CFl是一種優(yōu)良的高溫菌。
[0039]堆肥結(jié)束后及時(shí)取樣，用小土鉆鉆取堆體表層下40~50cm處樣品，風(fēng)干后研磨，測(cè)定有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀含量，見(jiàn)表2。
[0040]表2堆肥樣品的養(yǎng)分含量
I全氮(%)全磷(%)全鉀(%)Iif
[0041] [0042]實(shí)施例3用于動(dòng)物糞便發(fā)酵的復(fù)合菌劑
[0043]取過(guò)夜培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌種子液IOmL轉(zhuǎn)接入500ml發(fā)酵培養(yǎng)基，28°C發(fā)酵20小時(shí)，轉(zhuǎn)速為180rpm。
[0044]枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:蔗糖10g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏3g/L，酵母浸粉lg/L，七水合硫酸鎂0.5g/L，硫酸錳0.0005g/L, pH7.0。
[0045]取過(guò)夜培養(yǎng)的巨大芽孢桿菌種子液20mL轉(zhuǎn)接入500ml發(fā)酵培養(yǎng)基，30°C條件下，培養(yǎng)48h。轉(zhuǎn)速為180rpm。
[0046]巨大芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:牛肉膏5g/L，蛋白胨5g/L，氯化鈉5g/L，pH7.0。
[0047]按實(shí)施例1的方法制備嗜熱一氧化碳鏈霉菌CFl的發(fā)酵液。
[0048]將制備的枯草芽孢 桿菌發(fā)酵液、巨大芽孢桿菌的發(fā)酵液和嗜熱一氧化碳鏈霉菌CFl的發(fā)酵液按重量比1:1:2進(jìn)行混合，即得用于動(dòng)物糞便發(fā)酵的復(fù)合菌劑。
[0049]將新鮮牛糞與鋸末以干重6:1的比例進(jìn)行混合，或根據(jù)牛糞、鋸末的理化性質(zhì)適當(dāng)調(diào)整比例，使混合物的C/N為30，含水量為60%。
[0050]接種前述的復(fù)合菌劑，接種量為0.8%，并以市售的EM菌劑為陽(yáng)性對(duì)照，以不接種菌劑作為陰性對(duì)照。結(jié)果見(jiàn)表3和表4。
[0051]表3本發(fā)明所述復(fù)合微生物菌劑對(duì)堆肥腐熟程度的影響
菌劑達(dá)到飢維=。c 一曰堆肥躲后
處理天數(shù) 3最尚溫程，rfil°CW CM __下天數(shù)_ [0055]由表3可知，接種包含本發(fā)明所述的嗜熱一氧化碳鏈霉菌CFl的復(fù)合菌劑，堆體可在23天以?xún)?nèi)完成發(fā)酵，比接種市售EM菌劑和自然堆肥提前10-12天完成發(fā)酵，且高溫持續(xù)期長(zhǎng)，堆肥結(jié)束后腐熟程度好。由表4可知，接種包含本發(fā)明所述的嗜熱一氧化碳鏈霉菌CFl的復(fù)合菌劑，堆肥結(jié)束后堆料中有機(jī)質(zhì)含量、全氮、全磷和全鉀含量均高于接種市售EM菌劑和自然堆肥的堆料。其中接種包含本發(fā)明所述的嗜熱一氧化碳鏈霉菌CFl的復(fù)合菌劑的堆肥產(chǎn)品其有機(jī)質(zhì)含量和總養(yǎng)分含量均高于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(有機(jī)肥料NY-525-2012)中的規(guī)定，而接種市售EM菌劑的堆肥產(chǎn)品，剛剛達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(有機(jī)肥料NY-525-2012)，自然堆肥的產(chǎn)品未達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(有機(jī)肥料NY-525-2012 )。
[0056]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。`
【權(quán)利要求】
1.一種嗜熱一氧化碳鏈霉菌(Streptomyces thermocarboxydus)新菌株CFl,其保藏號(hào)為 CGMCC N0.6873。
2.含有權(quán)利要求1所述菌株的生物菌劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物菌劑，其中嗜熱一氧化碳鏈霉菌CFl的活菌數(shù)為50億/克以上。
4.制備權(quán)利要求2或3所述的生物菌劑的方法，其為在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵嗜熱一氧化碳鏈霉菌CF1，將得到的發(fā)酵液即為生物菌劑。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其還包括將嗜熱一氧化碳鏈霉菌CFl發(fā)酵液進(jìn)行冷凍干燥，制備成的凍干粉為生物菌劑。
6.一種用于動(dòng)物糞便發(fā)酵的復(fù)合菌劑，其包括枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和權(quán)利要求I所述的嗜熱一氧化碳鏈霉菌CFl。
7.如權(quán)利要求6所述的菌劑，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌的活菌數(shù)為10億/克以上，所述的巨大芽孢桿菌活菌數(shù)為20億/克以上，所述的嗜熱一氧化碳鏈霉菌CFl的活菌數(shù)為20億/克以上。`
【文檔編號(hào)】C12R1/125GK103484396SQ201310356764
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年8月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月15日
【發(fā)明者】劉克鋒, 王順利, 王紅利, 高程達(dá), 石愛(ài)平 申請(qǐng)人:北京農(nóng)學(xué)院