一種高抗絲黑穗病的蛋白ZmWAK及其編碼基因和其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種玉米ZmWAK蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。該蛋白ZmWAK，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)：1）序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸殘基序列；2）將序列表中的SEQ ID №.2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗絲黑穗病相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的蛋白和其編碼基因可用來培育高抗絲黑穗病的玉米，為轉(zhuǎn)基因植物的培育奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】-種高抗絲黑穗病的蛋白ZmWAK及其編碼基因和其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種高抗絲黑穗病的蛋白及其編碼基因和其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 絲黑穗病是一種土傳性系統(tǒng)病害，嚴(yán)重危害玉米和高粱的生產(chǎn)，最早報(bào)道于1914 年，如今已成為世界各個(gè)主要玉米產(chǎn)區(qū)的嚴(yán)重病害。在我國(guó)，絲黑穗病主要發(fā)生在東北的春 玉米產(chǎn)區(qū)，以及西北、內(nèi)蒙等地。90年代初由于感病品種的種植，絲黑穗病發(fā)生率逐年升高， 每年造成產(chǎn)量損失達(dá)30萬噸左右。2002年，東北地區(qū)玉米產(chǎn)區(qū)絲黑穗病大面積爆發(fā)，發(fā)病 面積達(dá)100萬hm2以上，占東北三省總種植面積的20%左右，造成10-15%的玉米產(chǎn)量的損 失。
[0003] 絲黑穗病是由絲軸黑粉菌（Sporisoriumreilianum)特異引起的真菌性病害，發(fā) 病植株病癭上的冬孢子進(jìn)入土壤越冬，成為來年的主要初始侵染源。絲軸黑粉菌的冬孢子 在土壤中可以保持活力3-5年，萌發(fā)不需要生理休眠后熟過程。在土壤中不同親和交配 型的冬孢子交配形成2倍體的侵染菌絲，進(jìn)而侵染玉米幼苗。冬孢子侵染的最適溫度為 23-30°C，土壤含水量較低或中等。
[0004] 玉米感染絲黑穗病后，前期并不表現(xiàn)出明顯的癥狀，但是某些發(fā)病較重的植株在 早期可能出現(xiàn)植株矮化、分蘗增多的現(xiàn)象。成熟期的發(fā)病植株也只在雌雄穗上表現(xiàn)出典型 病征。雄穗被侵染后，不散粉，可形成病癭，內(nèi)部充滿孢子。如果雌穗發(fā)病，表現(xiàn)為不吐花 絲，膨大增生，除苞葉外內(nèi)部被冬孢子取代。在生育后期部分苞葉破裂散出黑粉孢子，內(nèi)部 夾雜絲狀寄主維管組織。除此之外，還經(jīng)?？梢姲l(fā)病植株的雄穗和雌穗表現(xiàn)畸形生長(zhǎng)，雌雄 同生，雌穗葉狀化等異常現(xiàn)象。由于絲黑穗病最終破壞的是玉米的花器官，因此它屬于嚴(yán)重 破壞生產(chǎn)的絕產(chǎn)型病害，一旦發(fā)病，對(duì)產(chǎn)量影響巨大。
[0005] 使用化學(xué)殺真菌劑可以對(duì)絲黑穗病進(jìn)行一定程度的防治，但是效果有限，并且增 加了農(nóng)民的成本以及對(duì)環(huán)境的危害，因此培育和推廣種植抗病品種是對(duì)絲黑穗病進(jìn)行控制 的持續(xù)有效手段。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種高抗絲黑穗病的蛋白及其編碼基因。所述高抗絲黑穗病 的蛋白命名為ZmWAK,來源于玉米（Zea mays)。
[0007] 本發(fā)明提供的蛋白，是如下1)或2)的蛋白：
[0008] 1)序列表中的SEQIDNs.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0009] 2)將序列表中的SEQIDNs. 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的 取代和/或缺失和/或添加且與植物抗絲黑穗病相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
[0010] 序列表中SEQIDN2 . 2所示的氨基酸序列由730個(gè)氨基酸殘基組成。
[0011]上述1)和2)所述的ZmWAK蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物 表達(dá)得到。上述1)和2)所述的ZmWAK蛋白的編碼基因可通過將序列表中SEQIDNs. 1的 第70-2259位核苷酸所示的DNA序列缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一 個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變后得到。
[0012] 編碼所述ZmWAK蛋白的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0013] 所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸分子也可以 是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
[0014] 所述蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0015] 所述蛋白的編碼基因具有下述核苷酸序列之一：
[0016] 1)序列表中SEQIDNs:1第70-2259位的核苷酸序列；
[0017] 2)編碼序列表中SEQIDN2 :2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸序列；
[0018] 3)序列表中SEQIDNs:3所示的核苷酸序列；
[0019] 4)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQIDNs:1或SEQIDNs:3限定的DNA序列 雜交的核苷酸序列；
[0020] 5)與1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能 蛋白質(zhì)的DNA序列；具體的，所述同源性為95%以上；再具體的為96%以上；再具體的為97% 以上；再具體的為98%以上；再具體的為99%以上。
[0021] 上述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為用6XSSC，0. 5%SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0· 1%SDS和IXSSC，(λ1%SDS各洗膜一次。
[0022] 其中，序列表中的SEQIDN2 :1由2517個(gè)核苷酸組成，其開放閱讀框架（ORF)為 自5'末端第70-2259位核苷酸，編碼序列表中SEQIDN2 :2所示的蛋白質(zhì)，即本發(fā)明所述 的ZmWAK蛋白。
[0023] 含有所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或宿主菌也屬于本發(fā)明保 護(hù)的范圍。
[0024] 所述重組載體具體為重組表達(dá)載體或重組克隆載體。
[0025] 所述重組表達(dá)載體可用現(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建。所述表達(dá)載體還可包含外源基因的 3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。 所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3'端。使用所述基因構(gòu)建重組表達(dá) 載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng) 子，它們可單獨(dú)使用或與其它的啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載 體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物 進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入在植物中表達(dá)可產(chǎn)生顏色變化 的酶或發(fā)光化合物的基因（GUS基因、GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記 物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等）或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因（如抗除莠劑基因）等。 從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0026] 所述重組表達(dá)載體具體為在出發(fā)載體PCAMBIA1300的多克隆位點(diǎn)插入具有SEQ IDNs:3所示核酸序列的DNA片段所得的質(zhì)粒。
[0027] 擴(kuò)增本發(fā)明所述編碼基因全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0028] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述蛋白、所述編碼基因或所述的重組載體、表達(dá)盒、 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或宿主菌在增強(qiáng)植物抗絲黑穗病中的應(yīng)用。
[0029] 所述的應(yīng)用中，所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述單子葉植物具體為玉 米。
[0030] 本發(fā)明的還一個(gè)目的是提供所述蛋白、所述編碼基因或所述的重組載體、表達(dá)盒、 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或宿主菌在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用；所述轉(zhuǎn)基因植物與所述目的植物相 t匕，所述轉(zhuǎn)基因植物對(duì)絲黑穗病的抗性增強(qiáng)。
[0031] 所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述單子葉植物具體為玉米。
[0032] 本發(fā)明的還一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將所述編碼基因或權(quán) 利要求4所述的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或宿主菌導(dǎo)入目的植物，得到轉(zhuǎn)基因植 物；所述轉(zhuǎn)基因植物與所述目的植物相比，所述轉(zhuǎn)基因植物對(duì)絲黑穗病的抗性增強(qiáng)。
[0033] 所述方法中，所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述單子葉植物具體為玉米。
[0034] 本發(fā)明的還一個(gè)目的是提供一種分子標(biāo)記，為下述1)或2):
[0035] 1) -條引物具有序列表中SEQIDN2 :4所示的核苷酸序列，另一條引物具有序列 表中SEQIDNs:5所不的核苷酸序列；
[0036] 2) -條引物的核酸序列為序列表中SEQIDN2 :4所示的核苷酸序列的反向互補(bǔ) 序列，另一條引物的核酸序列為序列表中SEQIDN2 :5所示的核苷酸序列的反向互補(bǔ)序 列。
[0037] 本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供所述分子標(biāo)記物在鑒定和/或檢測(cè)所述編碼基因或 待測(cè)植物是否抗絲黑穗病中的應(yīng)用。
[0038] 所述應(yīng)用中，所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述單子葉植物具體為玉米。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0039] 圖1為使用分子標(biāo)記genoWAK2進(jìn)行轉(zhuǎn)ZmWAK基因玉米鑒定的結(jié)果圖。
[0040] 圖2為轉(zhuǎn)ZmWAK基因玉米與非轉(zhuǎn)基因玉米的表型鑒定結(jié)果圖。
[0041] 圖3為轉(zhuǎn)ZmWAK基因玉米與非轉(zhuǎn)基因玉米的抗病率統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0043] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0044] 下述實(shí)施例中所用的材料Ji1037、絲軸黑粉菌和高感絲黑穗病自交系Huangza〇4 見文獻(xiàn)ChenY,ChaoQ,TanG,ZhaoJ,ZhangM,JiQ,etal.Identificationand fine-mappingofamajorQTLconferringresistanceagainstheadsmutinmaize. TheorApplGenet2008:117:1241-52.和ZhaoX，TanG，XingY，WeiL，ChaoQ，ZuoW，et al.Marker-assistedintrogressionofqHSRltoimprovemaizeresistancetohead smut.MolecularBreeding2012;30:1077-88.的報(bào)道，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得上述材 料。
[0045] 下述實(shí)施例中所用的玉米材料HiII見文獻(xiàn)ArmstrongC，GreenC，Phillips R.DevelopmentandavailabilityofgermplasmwithhighTypeIIcultureformation response.Maizegeneticscooperationnewsletterl991.的報(bào)道，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大 學(xué)獲得上述材料。
[0046] 實(shí)施例I、玉米基因ZmWAK的制備
[0047] 1、總RNA的提取
[0048] 收集上一年發(fā)病植株病纓，置陰涼干燥處避光保存，作為第二年的接種源。利用 100目的篩子對(duì)病纓進(jìn)行初篩，過濾掉植物殘留的維管組織，收集黑粉孢子用于接種。將 高抗絲黑穗病玉米自交系Jil〇37接種絲軸黑粉菌48h后，使用Invitrogen公司提供的 TriZol試劑提取接種后的Ji1037根部組織總RNA。
[0049] 2、ZmWAK基因全長(zhǎng)cDNA的獲得
[0050] 第一鏈cDNA的合成使用試劑盒BDSMART?RACEcDNAAmplificationKit，RACE 所用引物序列為：
[0051] WAK-3'RACE: 5 ' -AACTACACCTTCAAGGCATCCGACC-3 '
[0052] WAK-5'RACE:5' -GACTTCGAACTGGAACCTGATCTCG-3'
[0053] 將上述5'和3'RACE產(chǎn)物克隆到pEASY-Tl載體(購(gòu)買自北京全式金生物技術(shù)有限 公司）上，選擇陽(yáng)性克隆分別測(cè)序、拼接后即可獲得ZmWAK基因全長(zhǎng)cDNA的序列，如序列表 SEQIDNs:l所示，共2517bp，其中編碼區(qū)長(zhǎng)2190bp，該編碼區(qū)序列如序列表中SEQIDNs: 1中第70-2259位核苷酸所示，編碼序列表中SEQIDN2 :2所示的氨基酸序列，共730個(gè)氨 基酸殘基。
[0054] 利用以下引物從Jil037的cDNA中擴(kuò)增可得到ZmWAK編碼區(qū)全長(zhǎng)的cDNA轉(zhuǎn)錄本。
[0055] fIcWAKL: 5，-ATGTCATCACTCCTGTTGCGAG-3，
[0056] flcWAKR:5, -ATGTGCCGACCGACCATTC-3，
[0057] 經(jīng)測(cè)序，上述引物對(duì)擴(kuò)增出的核酸片段具有序列表中SEQIDNs:1的第70-2350 位核苷酸所示核酸序列，包含ZmWAK基因編碼區(qū)核酸序列。
[0058] 實(shí)施例2、玉米基因ZmWAK的功能驗(yàn)證
[0059] (一 )、表達(dá)載體的構(gòu)建
[0060] 通過對(duì)M〇17BAC文庫(kù)的篩選，獲得了一個(gè)包含候選區(qū)段的陽(yáng)性克隆MO-J12。利用Sau3AI對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行部分酶切，選擇電泳分離后片段大于IOkb的片段進(jìn)行純化回收。同 時(shí)，利用BamHI對(duì)pCAMBIA1300載體進(jìn)行酶切純化回收。將目的基因片段和載體酶切產(chǎn)物 用T4DNA連接酶，16°C連接過夜，電擊轉(zhuǎn)化。選擇陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明插入載體的 序列為序列表中SEQIDNs:3所不的核酸序列，該序列包含有ZmWAK基因的基因組序列。將 該在PCAMBIA1300載體的BamHI酶切位點(diǎn)插入具有SEQIDNs:3所示核酸序列的DNA片段 的質(zhì)粒命名為P1300-WAK。將該具有序列表中SEQIDNs:3第4001-10000位核苷酸序列的 片段命名為ZmWAK。
[0061] (二)、互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)
[0062] UHiII(感玉米絲黑穗?。┑墨@得
[0063] 玉米材料HiII為親本A和B的雜交F1，經(jīng)過鑒定親本A和B都感玉米絲黑穗病。
[0064] 2、表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化
[0065] 將上述制備得到的表達(dá)載體P1300-WAK轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo) 法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入感絲黑穗病玉米材料HiII的幼胚中，利用潮霉素對(duì)轉(zhuǎn)化陽(yáng)性愈傷進(jìn) 行篩選，最后得到轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。同時(shí)設(shè)置轉(zhuǎn)空載體對(duì)照。
[0066] 3、轉(zhuǎn)ZmWAK基因玉米的鑒定
[0067] 使用分子標(biāo)記gen〇WAK2對(duì)轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行鑒定
[0068] 取玉米幼苗時(shí)期的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組植株葉片，提取待測(cè)植株基因組DNA，以該基因 組DNA為模板，以CldH2O為空白對(duì)照，未轉(zhuǎn)染表達(dá)載體的玉米材料HiII基因組DNA為陰性 對(duì)照，表達(dá)載體質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，PCR擴(kuò)增時(shí)所用引物序列為：
[0069]genoWAK2F:5, -TTAAGGCCTAGGCAACGCTC-3,；
[0070]genoWAk2R:5，-GCGTGAGCCTATCTAGCGAC-3，。
[0071] 上述genoWAK2F的核酸序列見序列表中SEQIDNs:4所示；genoWAk2R的核酸序列 見序列表中SEQIDNs:5所示。上述genoWAK2F和genoWAk2R組成的引物對(duì)是根據(jù)ZmWAK 基因編碼鏈的反向互補(bǔ)鏈設(shè)計(jì)的。
[0072] 將擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示，上述選取的實(shí)驗(yàn)組植 株和表達(dá)載體質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照組中均可以檢測(cè)到約446bp的條帶，而CldH2O空白對(duì)照和未轉(zhuǎn) 染表達(dá)載體的玉米材料HiII陰性對(duì)照組中均未檢測(cè)到相應(yīng)的DNA分子片段，說明ZmWAK基 因已整合到上述實(shí)驗(yàn)組玉米材料HiII的基因組中。
[0073](三)、轉(zhuǎn)ZmWAK基因玉米的表型
[0074] 將上述鑒定為陽(yáng)性的Ttl代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行自交得到T1代。將T1代陽(yáng)性植株與高 感絲黑穗病自交系Huangza〇4進(jìn)行雜交得到T1F1后代。對(duì)T1F1代進(jìn)行自交得T1F2代；T1F1 代與高感絲黑穗病自交系回交得BC1T1Fiq
[0075] 使用分子標(biāo)記gen〇WAK2對(duì)T1Fp I\F2、BC1T1F1代植株進(jìn)行基因型鑒定。鑒定過程 同本實(shí)施例中轉(zhuǎn)ZmWAK基因玉米的鑒定過程一樣，不同的是將上述實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組植物更 換為T1Fp T1F2JC1T1F1代植株。
[0076] 使用分子標(biāo)記gen〇WAK2進(jìn)行基因型鑒定的部分結(jié)果見圖1所示。圖1中，M表示 2-kbmarker，泳道1的模板為表達(dá)載體質(zhì)粒，泳道2的模板為親本A的基因組DNA，泳道 3的模板為親本B的基因組DNA，泳道4為CldH2O空白對(duì)照，泳道5-16的模板為#17-2轉(zhuǎn) 基因事件Tl代陽(yáng)性植株。
[0077] 按照基因型鑒定結(jié)果將后代分為兩種類型：
[0078] 將可檢測(cè)到446bp條帶的植株定義為帶有轉(zhuǎn)ZmWAK基因插入片段的后代，根據(jù)檢 測(cè)結(jié)果，屬于此類型的植株包括：# 17-2、#9-21的T1F1代植株、植株# 17-2的T1F2代和BC1T1F1 代植株含有轉(zhuǎn)基因插入片段的分離后代單株；
[0079] 將未檢測(cè)到446bp條帶的植株定義為不帶轉(zhuǎn)基因插入片段的后代，根據(jù)檢測(cè)結(jié) 果，屬于此類型的植株包括：#17-2、#9-21的T1F1代植株、植株#17-2的T1F2代和BC1T1F1代 植株不帶轉(zhuǎn)基因片段的同胞分離后代單株。
[0080] 對(duì)上述兩種類型的后代進(jìn)行表型鑒定。對(duì)于玉米絲黑穗病，單株表型鑒定準(zhǔn)確，具 體鑒定標(biāo)準(zhǔn)為：將玉米雌雄穗含有黑粉孢子或是表現(xiàn)出畸形生長(zhǎng)的植株定為感病，所有表 現(xiàn)正常的植株為抗病。然后對(duì)上述兩種類型的后代進(jìn)行的抗病率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，最后計(jì)算兩種 類型的后代在抗病率上是否存在顯著差異，以鑒定基因的功能。同時(shí)設(shè)置轉(zhuǎn)空載體對(duì)照。
[0081] 表型鑒定過程：取上一年病株的病纓，收集黑粉孢子避光通風(fēng)貯藏，作為來年的接 種源。將需要鑒定的玉米種子播種于育苗盤中，種子上覆蓋含有1%。黑粉孢子的土壤進(jìn)行人 工接種。在育苗盤中接種生長(zhǎng)一個(gè)月后，將接種的幼苗移栽入地里繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育。在玉米 乳熟期進(jìn)行性狀鑒定。鑒定時(shí)觀察玉米的雌穗和雄穗是否出現(xiàn)典型癥狀，必要時(shí)需要將雌 穗的苞葉剝開，觀察內(nèi)部是否存在黑粉病纓。
[0082] 表型鑒定結(jié)果見圖2。圖2結(jié)果顯示#17-2的分離后代BC1T1F1代中，帶有轉(zhuǎn)基因 的插入片段的單株（見圖2中標(biāo)記為轉(zhuǎn)基因的植株），其雌穗表現(xiàn)正常，能夠順利吐絲授粉。 而分離后代BC1T1F1代中不帶有轉(zhuǎn)基因插入片段的單株(見圖2中標(biāo)記為非轉(zhuǎn)基因的植株)， 其雌穗被病菌的黑粉孢子取代，不能正常吐絲授粉。轉(zhuǎn)空載體對(duì)照的表型與圖2中標(biāo)記為 非轉(zhuǎn)基因的植株的表型一致。
[0083] 抗病率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖3。圖3結(jié)果顯示，兩個(gè)轉(zhuǎn)基因事件#17-2和#9-21的T1代 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株與黃早四雜交的分離后代T1F1代中帶有轉(zhuǎn)ZmWAK基因插入片段的植株(見 圖3A中標(biāo)記為轉(zhuǎn)基因的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，**表示p〈0. 01)，以及植株#17-2的T1F1代中轉(zhuǎn)基因陽(yáng) 性植株與黃早四雜交的BC1T1F1代植株(見圖3B中標(biāo)記為轉(zhuǎn)基因的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，*表示p〈0. 05) 和自交后代T1F2代植株(見圖3C中標(biāo)記為轉(zhuǎn)基因的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，**表示p〈0. 01)中帶有轉(zhuǎn) ZmWAK基因插入片段的植株，其絲黑穗抗性顯著高于其同世代中不帶有轉(zhuǎn)ZmWAK基因插入 片段的同胞植株(見圖3A-C中標(biāo)記為非轉(zhuǎn)基因的統(tǒng)計(jì)結(jié)果)。
[0084] 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，玉米基因ZmWAK可顯著增強(qiáng)玉米對(duì)絲軸黑粉菌的抗性，可用 于制備高抗絲黑穗病玉米。
【權(quán)利要求】
1. 一種蛋白，是如下1)或2)的蛋白： 1) 序列表中的SEQ ID Ns. 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； 2) 將序列表中的SEQ ID Ns . 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代 和/或缺失和/或添加且與植物抗絲黑穗病相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2. 權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于：所述編碼基因具有下述核苷酸序列 之一： 1) 序列表中SEQ ID Ns :1第70-2259位的核苷酸序列； 2) 編碼序列表中SEQ ID Ns :2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸序列； 3) 序列表中SEQ ID Ns :3所示的核苷酸序列； 4) 在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID Ns:l或SEQ ID Ns:3限定的DNA序列雜交 的核苷酸序列； 5) 與1)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白 質(zhì)的DNA序列；具體的，所述同源性為95%以上；再具體的為96%以上；再具體的為97%以 上；再具體的為98%以上；再具體的為99%以上。
4. 含有權(quán)利要求2或3所述的編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或宿主菌； 所述重組載體具體為重組表達(dá)載體或重組克隆載體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于：所述重組表達(dá)載體具體為在出 發(fā)載體PCAMBIA1300的多克隆位點(diǎn)插入具有SEQ ID N2:3所示核酸序列的DNA片段所得的 質(zhì)粒。
6. 擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述編碼基因全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)。
7. 權(quán)利要求1所述的蛋白和權(quán)利要求2-3任一所述的編碼基因和權(quán)利要求4所述的重 組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或宿主菌在增強(qiáng)植物抗絲黑穗病中的應(yīng)用； 或，在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用；所述轉(zhuǎn)基因植物與所述目的植物相比，所述轉(zhuǎn)基因植 物對(duì)絲黑穗病的抗性增強(qiáng)。
8. -種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2-3任一所述的編碼基因或權(quán)利要求4 所述的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或宿主菌導(dǎo)入目的植物，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn) 基因植物與所述目的植物相比，所述轉(zhuǎn)基因植物對(duì)絲黑穗病的抗性增強(qiáng)。
9. 一種分子標(biāo)記，為下述1)或2): 1) 一條引物具有序列表中SEQ ID Ns :4所7]^的核昔酸序列，另一條引物具有序列表中 SEQ ID Ns :5所示的核苷酸序列； 2) -條引物的核酸序列為序列表中SEQ ID Ns :4所示的核苷酸序列的反向互補(bǔ)序列， 另一條引物的核酸序列為序列表中SEQ ID N2:5所示的核苷酸序列的反向互補(bǔ)序列。
10. 權(quán)利要求9所述的分子標(biāo)記物在鑒定和/或檢測(cè)權(quán)利要求2或3所述編碼基因或 待測(cè)植物是否抗絲黑穗病中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/29GK104341494SQ201310346549
【公開日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2013年8月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月9日
【發(fā)明者】徐明良, 左為亮, 譚國(guó)慶, 晁青, 陳永勝, 趙賢容, 張楠, 邢躍先, 魏萊, 趙晶, 張博琦, 夏遠(yuǎn)峰 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)