高效表達(dá)α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的基因工程菌及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種高效表達(dá)α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的基因工程菌株，所述基因工程菌株的宿主菌為黑曲霉（Aspergillus?niger），該基因工程菌株包含α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因表達(dá)盒。本發(fā)明基因工程菌不僅能高效表達(dá)α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶，而且調(diào)高了α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的分泌效率。同時(shí)，α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶分泌到胞外，降低了對α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶提取純化的成本，節(jié)約了工業(yè)用料，降低了生產(chǎn)成本，具有明顯的社會效益。而且，菌株經(jīng)發(fā)酵后獲得的粗酶液的酶活力比出發(fā)菌株酶活力提高了4.0~12.1倍，為α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用及工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，也打破了α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶依賴于進(jìn)口的瓶頸，具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益，具有廣闊市場開發(fā)前景。
【專利說明】高效表達(dá)Cl-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的基因工程菌及其構(gòu)建方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及基因工程菌株及其構(gòu)建方法，尤其是一種高效表達(dá)a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的基因工程菌株及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶(a -transglucosidase, EC 2.4.1.24),又稱 a -葡萄糖苷酶、 轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，它可以從低聚糖類底物的非還原性末端切開a-1，4糖苷鍵，釋放出葡萄糖，或?qū)⒂坞x出的葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到另一個(gè)糖類底物形成a-1，6糖苷鍵，從而得到非發(fā)酵性的功能低聚異麥芽糖(頂O)、糖脂或糖肽等。a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶是一種重要的工業(yè)用酶， 在食品、飼料、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域顯示了廣闊的應(yīng)用前景，特別是在MO生產(chǎn)中的巨大應(yīng)用潛力早已引起國內(nèi)外食品工業(yè)界的重視。
[0003]目前，我國還沒有規(guī)?；a(chǎn)a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的能力，工業(yè)上所用的a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶主要依賴于進(jìn)口，價(jià)格昂貴。國內(nèi)關(guān)于a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的研究也主要集中于產(chǎn)a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶菌株的篩選、誘變及培養(yǎng)條件優(yōu)化等方面，效果均不太理想，誘變株的穩(wěn)定性較差，酶產(chǎn)量還是偏低，并且難以純化。近幾年來，隨著基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展， 構(gòu)建和利用基因工程菌作為大規(guī)模生產(chǎn)a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的宿主，進(jìn)一步提高酶活及酶的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，成為研究該酶制劑的一種新途徑，并在世界范圍內(nèi)得到越來越廣泛的重視及應(yīng)用。1997年，Akira N等從黑曲霉工業(yè)菌株GN-3中克隆出a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因，并將該基因引入到Emericella nidulans中表達(dá),表達(dá)量為0.96 U/mg蛋白。1999年, Galichet A等從Thermococcus hydrothermal is AL662菌株中，通過建立基因文庫，克隆了 a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因，將該基因克隆到Sulfolobus solfataricus突變株TCY70中，但其表達(dá)量較低。2001年，Martino A等以硫磺礦硫化葉菌MT-4總DNA為模板，通過PCR將 a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因克隆到E.coli中表達(dá)，其表達(dá)量達(dá)到87.5 U/g濕菌體。2004年，蘇艷利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)黑曲霉a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，酶活高達(dá)226.8 U/mL。2008年，楊捷琳等從阪崎腸桿菌中克隆a -葡萄糖苷酶基因，重組到pET22b ( + )質(zhì)粒在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)及活性研究，目標(biāo)蛋白量約占菌體總蛋白量的18%。2009年，童星等以畢赤酵母KM71為宿主菌表達(dá)黑曲霉SG136 a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因，并對表達(dá)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)苷活性進(jìn)行測定，制備的粗酶液在最適PH和溫度下反應(yīng)24 h時(shí)，低聚異麥芽糖的總含量達(dá)到最大為26.0%。
[0004]我國關(guān)于a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的研究起步較晚，為了改變依賴于進(jìn)口這一現(xiàn)狀，尋求一條國產(chǎn)化的道路，本發(fā)明利用基因工程技術(shù)構(gòu)建基因工程菌株，進(jìn)一步提高酶的產(chǎn)量及活性，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
[0005]通過檢索，尚未發(fā)現(xiàn).與本發(fā)明專利申請相關(guān)的專利公開文獻(xiàn)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種增加了 a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因的拷貝數(shù)，有效提高了酶的表達(dá)量，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)的高效表達(dá)α -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的基因工程菌及其構(gòu)建方法，該構(gòu)建方法易于操作、方法簡單，而且可以構(gòu)建含有不同基因拷貝數(shù)和在基因組位置不同的工程菌。
[0007]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0008]一種高效表達(dá)α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的基因工程菌株，所述基因工程菌株的宿主菌為黑曲霉(Aspergillus niger)，該基因工程菌株包含α -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因表達(dá)盒。
[0009]而且，所述α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因表達(dá)盒中的α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因的來源為黑曲霉。
[0010]而且，所述α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因表達(dá)盒中含有糖化酶啟動子、糖化酶信號肽、α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶成熟肽基因和色氨酸終止子。
[0011]而且，所述α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因表達(dá)盒中的α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶成熟肽基因的N-末端融合了糖化酶信號肽。
[0012]如上所述的高效表達(dá)α -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的基因工程菌的構(gòu)建方法，步驟如下:
[0013]⑴根據(jù)GenBank中已報(bào)道的糖化酶啟動子序列為依據(jù)，設(shè)計(jì)引物，以黑曲霉基因組DNA為模板擴(kuò)增糖化酶啟動子序列；
[0014]⑵根據(jù)GenBank中已報(bào)道的α -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶mRNA序列、糖化酶信號肽序列為依據(jù)，設(shè)計(jì)引物，以黑曲霉總RNA為模板，利用RT-PCR擴(kuò)增得到含有糖化酶信號肽的α _葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的成熟肽基因；
[0015]⑶根據(jù)GenBank中已報(bào)道的色氨酸終止子序列為依據(jù)，設(shè)計(jì)引物，以質(zhì)粒pBI_hph為模板擴(kuò)增得到色氨酸終止子序列；
[0016]⑷將步驟⑴中糖化酶啟動子序列、步驟⑵中α -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶成熟肽基因和步驟⑶中色氨酸終止子序列經(jīng)酶切后依次與載體PT-Z連接，構(gòu)建完整的α -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因表達(dá)盒，隨后將其插入到pB1-hph的Hind III和Xba I位點(diǎn)之間，鑒定正確后，獲得雙元載體為 pB1-Glu ；
[0017](5)雙元載體pB1-Glu轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404中，利用農(nóng)桿菌陽性克隆子對黑曲霉進(jìn)行介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，構(gòu)建基因工程菌，黑曲霉轉(zhuǎn)化子經(jīng)鑒定正確后，測定黑曲霉轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)α -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的活力，篩選產(chǎn)酶活力比出發(fā)菌株活力提高了 4.(12.1倍的菌株即得高效表達(dá)α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的基因工程菌。
[0018]而且，所述步驟⑷的具體步驟為:
[0019]糖化酶啟動子序列的PCR產(chǎn)物經(jīng)Kpn I與Nco I酶切后，切膠回收該啟動子片段，插入經(jīng)連接酶連接pUCm-T質(zhì)粒后形成的閉合環(huán)狀的pT-Z質(zhì)粒的Kpn I與Nco I位點(diǎn)之間，獲得重組質(zhì)粒ρΤ_Ρ ；
[0020]PCR擴(kuò)增的色氨酸終止子序列電泳回收后，用Xba I與BgI II進(jìn)行酶切回收并連接到同樣酶切的PT-P質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)上，獲得重組質(zhì)粒pT-P-C ；
[0021]把連接到T載體上含有糖化酶信號肽的α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶成熟肽基因利用BgI II與Nco I酶切并電泳回收后，插入到pT-P-C質(zhì)粒的BgI II與Nco I位點(diǎn)之間，獲得重組質(zhì)粒 pT-P-a -C ；
[0022]質(zhì)粒pT-P- a -C經(jīng)Hind ΙΙΙ/Xba I雙酶切，獲得α -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因表達(dá)盒，將該基因片段插入質(zhì)粒pB1-hph的Hind III和Xba I位點(diǎn)之間，構(gòu)建雙元載體pB1-Glu。[0023]而且，所述高效表達(dá)a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的基因工程菌經(jīng)發(fā)酵所測粗酶液酶活力比出發(fā)菌株酶活力提高了 12.1倍。
[0024]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果如下:
[0025]1、本發(fā)明基因工程菌不僅能高效表達(dá)a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶，而且提高了 a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的分泌效率。同時(shí)，a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶分泌到胞外，降低了對a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶提取純化的成本，節(jié)約了工業(yè)用料，降低了生產(chǎn)成本，具有明顯的社會效益。而且，菌株經(jīng)發(fā)酵后獲得的粗酶液的酶活力比出發(fā)菌株酶活力提高了 4.(T12.1倍，為a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用及工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，也打破了 a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶依賴于進(jìn)口的瓶頸， 具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益，具有廣闊市場開發(fā)前景。
[0026]2、本發(fā)明方法首次利用基因工程技術(shù)，將糖化酶的信號肽融合到a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶成熟肽的N-末-端，構(gòu)建了高效分泌表達(dá)a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的黑曲霉基因工程菌；該方法采用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因表達(dá)盒插入到黑曲霉基因組中，不僅轉(zhuǎn)化方法簡單，易于操作，而且可以構(gòu)建含有不同基因拷貝數(shù)和在基因組位置不同的工程菌，證明了插入位點(diǎn)(即在黑曲霉基因組中的位置)和基因拷貝數(shù)是影響a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶高效表達(dá)的原因之一，為進(jìn)一步構(gòu)建高產(chǎn)的a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶工程菌奠定了理論基礎(chǔ)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027]圖1為本發(fā)明的擴(kuò)增電泳圖，其中:A為糖化酶啟動子序列PCR擴(kuò)增結(jié)果圖，其中， M:1 kb DNA Marker，1:PCR獲得的糖化酶啟動子序列；B為a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因PCR擴(kuò)增結(jié)果圖，其中，M:1 kb DNA Marker, 1:PCR獲得的a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因；C為色氨酸終止子序列PCR擴(kuò)增結(jié)果圖，其中，M:1 kb DNA Marker, 1:PCR獲得的色氨酸終止子序列；
[0028]圖2為本發(fā)明雙元載體pB1-Glu的結(jié)構(gòu)圖；
[0029]圖3為本發(fā)明雙元載體pB1-Glu的酶切驗(yàn)證圖，其中，M:1.5 kb DNA ladder ；1: pB1-Glu/Hind III 酶切產(chǎn)物；2:pBI_Glu/Xba I 酶切產(chǎn)物；3: pB1-Glu/Hind III+ Xba I 酶切產(chǎn)物；4:pT-P-a-C/Hind III+ Xba I 酶切回收產(chǎn)物；5: pB1-hph/Hind III+ Xba I 酶切回收產(chǎn)物；
[0030]圖4為本發(fā)明黑曲霉.基因工程菌PCR驗(yàn)證圖，其中，M:1 kb DNA ladder ;1:野生型菌株P(guān)CR結(jié)果；2-14:轉(zhuǎn)化子PCR結(jié)果；
[0031]圖5為黑曲霉工程菌的產(chǎn)a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的活力，其中，A:黑曲霉野生型菌株， A-1——A-13:黑曲霉轉(zhuǎn)化子；
[0032]圖6為本發(fā)明黑曲霉基因工程菌Southern blot鑒定圖，其中，A-1—A-13:轉(zhuǎn)化子雜交結(jié)果；A:野生型菌株雜交結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0033]下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)一步說明，下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的， 不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0034]本發(fā)明的主要思想為:a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因克隆出來放到其他宿主菌株進(jìn)行異源表達(dá)，因?yàn)樘腔年P(guān)系，轉(zhuǎn)苷酶的性質(zhì)會發(fā)生改變，影響MO的轉(zhuǎn)化率，同時(shí)異源表達(dá)還存在密碼子偏愛性問題，只有把它導(dǎo)入自身的宿主菌種，在原菌株中進(jìn)行同源表達(dá)，才能既提高其產(chǎn)量，又不改變其性質(zhì)。黑曲霉(Aspergillus niger)作為α -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶生產(chǎn)菌株，不僅是優(yōu)良的表達(dá)系統(tǒng)，還是食品級安全生產(chǎn)菌，具有很強(qiáng)的蛋白分泌能力。因此，通過基因工程的方法構(gòu)建黑曲霉的高產(chǎn)α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶工程菌在學(xué)術(shù)和應(yīng)用上都具有重要的價(jià)值和意義。
[0035]本發(fā)明以大量生產(chǎn)α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶為目的，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建重組菌株，實(shí)現(xiàn)α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的大量分泌表達(dá)。本發(fā)明所用的α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因來源是黑曲霉,本發(fā)明中的宿主細(xì)胞也為黑曲霉。
[0036]本發(fā)明將糖化酶啟動子、融合有糖化酶信號肽的α -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因和色氨酸終止子構(gòu)建成分泌表達(dá)α -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因的表達(dá)盒并將其插入到質(zhì)粒pB1-hph中構(gòu)建雙元載體pB1-Glu，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化黑曲霉菌株，構(gòu)建高產(chǎn)α -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的生產(chǎn)菌株，并能有效分泌表達(dá)α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶。
[0037]一種高效表達(dá)α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的基因工程菌株，所述基因工程菌株的宿主菌為黑曲霉(Aspergillus niger),該基因工程菌株包含α -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因表達(dá)盒，所述α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因表達(dá)盒中含有糖化酶啟動子序列、α -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因和色氨酸終止子序列，所述α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因表達(dá)盒中的α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因的來源為黑曲霉，該α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因表達(dá)盒中的α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶成熟肽基因前引入了糖化酶信號肽序列。
[0038]一種高效表達(dá)α -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的基因工程菌的構(gòu)建方法，步驟如下:
[0039]1、糖化酶啟動子序列的擴(kuò)增
[0040]根據(jù)GenBank中已報(bào)道的糖化酶啟動子序列為依據(jù)，設(shè)計(jì)引物，以黑曲霉基因組DNA為模板對糖化酶啟動子序列.進(jìn)行擴(kuò)增:
[0041]上游引物PgF:
[0042]5，-GGGGGTACCAAGCTTGGATCCGAACTCCAACCGGGG-3，，酶切位點(diǎn)為 Hind III 和 KpnI ;
[0043]下游引物PgR: 5 ’ -CCGGCCATGGCTGAGGTGTAATGATGCTGGGG-3 ’，酶切位點(diǎn)為 Nco I。
[0044]以提取黑曲霉基因組為模板，以上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件如下:
[0045]PCR 擴(kuò)增體系(20 μι):
[0046]
Buffer2 pL
d\TP1,6 pL
h游引物inL
下游引物IpL
模板2 pL
聚合_0.2 μ?
CldH2O12.2 μ?
[0047]PCR反應(yīng)條件:[0048]
【權(quán)利要求】
1.一種高效表達(dá)a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的基因工程菌株，其特征在于:所述基因工程菌株的宿主菌為黑曲霉(Aspergillus niger)，該基因工程菌株包含a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因表達(dá)盒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效表達(dá)a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的基因工程菌，其特征在于:所述a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因表達(dá)盒中的a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因的來源為黑曲霉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效表達(dá)a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的基因工程菌，其特征在于:所述a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因表達(dá)盒中含有糖化酶啟動子、糖化酶信號肽、a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶成熟肽基因和色氨酸終止子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效表達(dá)a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的基因工程菌，其特征在于:所述a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因表達(dá)盒中的a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶成熟肽基因的N-末端融合了糖化酶信號肽。
5.一種如權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的高效表達(dá)a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟如下:⑴根據(jù)GenBank中已報(bào)道的糖化酶啟動子序列為依據(jù)，設(shè)計(jì)引物，以黑曲霉基因組DNA 為模板擴(kuò)增糖化酶啟動子序列；⑵根據(jù)GenBank中已報(bào)道的a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶mRNA序列、糖化酶信號肽序列為依據(jù)， 設(shè)計(jì)引物，以黑曲霉總RNA為模板，利用RT-PCR擴(kuò)增得到含有糖化酶信號肽的a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的成熟肽基因；⑶根據(jù)GenBank中已報(bào)道的色氨酸終止子序列為依據(jù)，設(shè)計(jì)引物，以質(zhì)粒pBI_hph為模板擴(kuò)增得到色氨酸終止子序列；⑷將步驟⑴中糖化酶啟動子序列、步驟⑵中a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶成熟肽基因和步驟⑶中色氨酸終止子序列經(jīng)酶切后依次與載體PT-Z連接，構(gòu)建完整的a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因表達(dá)盒，隨后將其插入到pB1-hph的Hind III和Xba I位點(diǎn)之間，鑒定正確后，獲得雙元載體為 pB1-Glu ；(5)雙元載體pB1-Glu轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404中，利用農(nóng)桿菌陽性克隆子對黑曲霉進(jìn)行介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，構(gòu)建基因工程菌，黑曲霉轉(zhuǎn)化子經(jīng)鑒定正確后，測定黑曲霉轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的活力，篩選產(chǎn)酶活力比出發(fā)菌株活力提高了 4.(T12.1倍的菌株即得高效表達(dá) a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的基因工程菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述 的高效表達(dá)a-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于:所述步驟⑷的具體步驟為:糖化酶啟動子序列的PCR產(chǎn)物經(jīng)Kpn I與Nco I酶切后，切膠回收該啟動子片段，插入經(jīng)連接酶連接PUCm-T質(zhì)粒后形成的閉合環(huán)狀的pT-Z質(zhì)粒的Kpn I與Nco I位點(diǎn)之間，獲得重組質(zhì)粒pT_P ；PCR擴(kuò)增的色氨酸終止子序列電泳回收后，用Xba I與BgI II進(jìn)行酶切回收并連接到同樣酶切的PT-P質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)上，獲得重組質(zhì)粒pT-P-C ；把連接到T載體上含有糖化酶信號肽的a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶成熟肽基因利用BgI II與 Nco I酶切并電泳回收后，插入到pT-P-C質(zhì)粒的BgI II與Nco I位點(diǎn)之間，獲得重組質(zhì)粒 pT-P-a -C ；質(zhì)粒pT-P-a-C經(jīng)Hind III/Xba I雙酶切，獲得a -葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因表達(dá)盒，將該基因片段插入質(zhì)粒pB1-hph的Hind III和Xba I位點(diǎn)之間，構(gòu)建雙元載體pBI_Glu。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6任一項(xiàng)所述的高效表達(dá)α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于:所述高效表達(dá)α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的基因工程菌經(jīng)發(fā)酵所測粗酶液酶活力比出發(fā)菌株 酶活力提高了 12.1倍。
【文檔編號】C12N1/15GK103436454SQ201310334134
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月31日
【發(fā)明者】黎明, 路福平, 劉萌 申請人:天津科技大學(xué)