一株淡紫灰鏈霉菌x33及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一株淡紫灰鏈霉菌X33（StreptomyceslavendulaeX33），其保藏編號為CCTCCNO.M2013163。該菌株及其發(fā)酵液可用于防治果蔬的綠霉病、青霉病和酸腐病，防治葡萄座腔菌(Botryosphaeriaspp.)引起樹木的潰瘍病和枯梢病病害。本發(fā)明的優(yōu)點在于：無毒、無副作用，可同時防治多種植物病害且防治效果顯著，制備工藝簡單、成本低，使用方法簡便。
【專利說明】一株淡紫灰鏈霉菌X33及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株淡紫灰鏈霉菌i^treptomyceslavendulae) X33 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人們對無污染、無公害綠色食品和環(huán)境保護呼聲日益提高，生物防治已成為繼農(nóng)業(yè)化學防治之后的又一重要防治方法，許多生物殺菌劑已相繼問世，并廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)，取得了顯著效果。鏈霉菌可以產(chǎn)生多種次生代謝物質(zhì)，在植物保護方面發(fā)揮了巨大作用，其產(chǎn)生的抗生素種類多，而且大多數(shù)已在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，可防治真菌、細菌、線蟲病及一些重要的害蟲，有的還有除草活性。淡紫灰鏈霉菌(Streptomyces lavendulae)是一種重要的抗生素產(chǎn)生菌。應(yīng)用淡紫灰鏈霉菌防治植物病害的報道有很多，有研究表明用淡紫灰鏈霉菌來防治番茄灰霉病、番茄葉霉病、葡萄白腐病、西瓜枯萎病和蘋果輪紋病等植物病害，均起到了顯著的效果。但迄今為止，還未見淡紫灰鏈霉菌應(yīng)用于果蔬青綠霉病、酸腐病、樹木潰瘍病和枯梢病的報道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明的目的旨在探尋果蔬保鮮劑和生物農(nóng)藥的新來源，利用土壤微生物資源而開發(fā)的一株可用于植物真菌病害防治的廣譜、高效、可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的淡紫灰鏈霉菌。
[0004]本發(fā)明還有一個目的是提供菌株X33及其發(fā)酵液在防治果蔬的綠霉病、青霉病和酸腐病以及防治葡萄座腔菌(Botryosphaeria spp.)引起樹木的潰瘍病和枯梢病病害中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案`為:一株淡紫灰鏈霉菌X33 {Streptomyces lavendulae X33),其保藏編號為CCTCC M 2013163。利用培養(yǎng)基培養(yǎng)所述淡紫灰鏈霉菌X33產(chǎn)生的發(fā)酵液及其菌體應(yīng)用于防治果蔬病害和樹木病害。生產(chǎn)該霉菌時所述培養(yǎng)基含一種或一種以上的碳源物質(zhì)、一種或一種以上的氮源物質(zhì)及無機或有機鹽類物質(zhì)，其中碳源物質(zhì)含量為2%-10%，氮源物質(zhì)含量為2%-10%，鹽類物質(zhì)含量為0.01%-0.1%，其余為組份水，所述的微生物培養(yǎng)在需氧條件下進行，發(fā)酵初始PH值為5.0- 10.0，發(fā)酵中后期調(diào)節(jié)pH值為6.0- 9.0，培養(yǎng)溫度為20- 35°C。碳源物質(zhì)包括淀粉、糖蜜、脂肪、有機酸、脂肪酸、纖維二糖、氨基酸、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖、肌醇、半乳糖、海藻糖、木糖、甘露醇、鼠李糖和阿拉伯糖。氮源物質(zhì)包括玉米漿、豆粉、蛹粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、尿素、銨鹽、硝酸鹽。無機或有機鹽類物質(zhì)包括磷酸鹽、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鐵鹽。應(yīng)用于果蔬保鮮劑，果蔬保鮮劑用于防治果蔬的綠霉病、青霉病和酸腐病。應(yīng)用于生物農(nóng)藥，生物農(nóng)藥用于防治葡萄座腔菌引起的樹木的潰瘍病和枯梢病病害。
[0006]本發(fā)明提供的淡紫灰鏈霉菌X33屬淡紫灰鏈霉菌lavendulae),并已于2013年4月28日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC N0.M 2013163，保藏單位地址:中國武漢市武漢大學。[0007]本發(fā)明的淡紫灰鏈霉菌X33，為發(fā)明人從柑橘根系土壤中分離而得。該菌株的形態(tài)特征、生理生化特征如下:
1、形態(tài)特征:在光學顯微鏡下，菌株X33由高氏一號培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲發(fā)育良好,分支廣泛，氣生菌絲無橫隔、不斷裂；孢子絲長直，少數(shù)波曲，頂端大螺旋。在掃描電子顯微鏡下，菌株X33孢子呈柱狀，表面光滑，孢子寬度約為6 u m，這些顯微形態(tài)均符合鏈霉菌屬的典型特征。
[0008]2、生理生化特征及碳源利用如下:
生理生化特征:菌株X33不產(chǎn)生H2S和黑色素，不液化明膠，不分解纖維素，可水解淀粉，不凝固牛奶但可胨化。
[0009]碳源利用:容易利用蔗糖、乳糖、肌醇、半乳糖、海藻糖、D-果糖、D-木糖、D-甘露醇、L-鼠李糖和L-阿拉伯糖，較難利用麥芽糖，對D-葡萄糖利用可疑。
[0010]本發(fā)明所述的淡紫灰鏈霉菌，其培養(yǎng)方法為深層液體或固體培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含有常用于微生物培養(yǎng)的碳源、氮源及其他無機鹽類與生長因子。其中碳源可為淀粉、糖蜜、有機酸、脂肪酸、葡萄糖、蔗糖、果糖等含碳有機或無機化合物，氮源可為玉米漿、豆粉、蛹粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、花生粉、銨鹽、尿素、硝酸鹽以及其他有機或無機含氮化合物；適當添加無機或有機鹽類物質(zhì)，如磷酸鹽、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鐵鹽等，必要時可添加一些動、植、礦物油等作為消泡劑。對溫度、pH、時間等培養(yǎng)條件并無嚴格的限制，以適于產(chǎn)生菌的生產(chǎn)為準，并以選擇活性最高的條件為好。微生物培養(yǎng)在需氧條件下進行，發(fā)酵初始PH值為
5.0~10.0，以接近中性為好，發(fā)酵中后期調(diào)節(jié)pH值為6.(T 9.0，溫度為20~35°C。這些培養(yǎng)基的組份、通氣條件、pH、培養(yǎng)溫度等均應(yīng)根據(jù)實際情況進行適當?shù)恼{(diào)整，以獲得最好的效果。
[0011]本發(fā)明的優(yōu)點在于:無毒、無副作用，可同時防治多種植物病害且防治效果顯著，制備工藝簡單、成本低，使用方法簡便。
【具體實施方式】
[0012]下面用實例來進一步詳述本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
[0013]實施例一:菌株X33的篩選和鑒定
通過皿內(nèi)抑菌試驗，以指狀青霉為指示菌，從柑橘根系土壤中分離放線菌，其中菌株X33抑菌活性最強。測定菌株X33抗菌譜發(fā)現(xiàn)其無菌發(fā)酵濾液對6種細菌，4種酵母菌和6種植物病原真菌均具有顯著的抑制效果，且菌株X33具有良好的傳代抑菌穩(wěn)定性，根據(jù)培養(yǎng)特征、顯微形態(tài)、生理生化特征及16SrDNA序列分析等，將菌株X33鑒定為淡紫灰鏈霉菌(Strep tomyces lavendulae)。
[0014]實施例二:菌株X33的250mL搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)
淡紫灰鏈霉菌X33接種于高氏一號斜面培養(yǎng)基上，待斜面孢子成熟后，按5~10%接種量接種于含30mL種子培養(yǎng)液的250mL三角瓶中，32°C、200r/min條件下震蕩培養(yǎng)48h。將培養(yǎng)好的種子液按5~10%接種量接種于含30mL發(fā)酵培養(yǎng)液的250mL三角瓶中，先在32°C、200r/min條件下震蕩培養(yǎng)48h，然后再在28°C、180r/min條件下震蕩培養(yǎng)24h。
[0015]各種培養(yǎng)基配方如下:
斜面培養(yǎng)基:可溶性淀粉 2%, KNO30.1%，NaCl0.05%, MgSO40.05%, K2HPO40.05%,FeSO4 ? 7H200.001%,瓊脂 2%, pH7.2-7.4。
[0016]種子培養(yǎng)基:可溶性淀粉2%，牛肉膏0.3%，蛋白胨0.5%,KNO30.1%,K2HPO40.05%，初始 pH7.0。
[0017]發(fā)酵培養(yǎng)基:可溶性淀粉1%，蔗糖2%，玉米粉1%，黃豆粉2%，(NH4) 2S040.3%，K2HPO40.02%, MgSO40.05%, FeSO40.001%, CaCO30.5%，初始 pH7.0。
[0018]實施例三:淡紫灰鏈霉菌X33菌株的50L發(fā)酵培養(yǎng)
斜面和種子培養(yǎng)方式同實施例二。 50L發(fā)酵罐接種量5~10%，發(fā)酵溫度30°C，罐壓
0.05Mpa，攪拌轉(zhuǎn)速300r/min，通氣比為0.6-1.2vvm,溶氧控制在10_80%，發(fā)酵液pH維持在
6.5-7.5之間，發(fā)酵時間72h。測定發(fā)酵液效價。
[0019]實施例四:淡紫灰鏈霉菌X33菌株發(fā)酵液對植物病原菌的抑制。
[0020]采用菌絲生長速率法驗證發(fā)酵液對不同植物病原真菌的抑制效果。實驗使用雙層平板，平板下層為15mL PDA培養(yǎng)基，上層為IOmL含有發(fā)酵液的PDA培養(yǎng)基。上層培養(yǎng)基加入稀釋10倍發(fā)酵液lmL，并以上層培養(yǎng)基加入ImL無菌水為對照。用打孔器打取培養(yǎng)好的植物病原真菌菌塊，放置雙層平板中心點，28°C恒溫培養(yǎng)，每處理3次重復(fù)。待對照組中心菌落將要長滿整個培養(yǎng)皿時，用十字交叉法測量并記錄各組的菌落直徑，按如下公式計算菌絲生長抑制率:
抑制率=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/ (對照組菌落直徑-菌餅直徑)淡紫灰鏈霉菌X33發(fā)酵液對白地霉的抑制率高達100%，對指狀青霉、意大利青霉和葡萄坐腔菌的抑制率分別為8`8%、86%和98%。
[0021]實施例五:淡紫灰鏈霉菌X33發(fā)酵液對采后果蔬綠霉病的病害防治
以柑橘為例，將實施例二培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物經(jīng)過濾后取上清液，以無菌水稀釋3、5、10倍，取用75%酒精處理晾干后的新鮮柑橘，先用解剖刀于果實腰部刺一傷口(3mm*3mm)，在傷口處預(yù)先滴加15ML的發(fā)酵上清液進行處理，以無菌水處理作為對照，將各處理后的果實置于保鮮盒內(nèi)，于室溫放置24h后，再分別接種15ML的綠霉病菌孢子懸液(以無菌水洗下培養(yǎng)基上生長的綠霉病菌菌落，過濾，調(diào)整孢子終濃度為IO6個/mL，塑料袋密封保鮮盒后置于28°C下保濕培養(yǎng)。重復(fù)3次試驗。無菌水對照組柑橘綠霉病發(fā)病率為100%，3、5、10倍稀釋的發(fā)酵液處理后的柑橘綠霉病發(fā)病率分別為13%、20%、31%。
[0022]表明本發(fā)明的淡紫灰鏈霉菌X33的培養(yǎng)物對果蔬綠霉病菌有很好的防治效果。
[0023]實施例六:淡紫灰鏈霉菌X33發(fā)酵液對采后果蔬青霉病的病害防治
以臍橙為例，處理方法同實施例五，臍橙的無菌水對照組青霉病發(fā)病率為97.8%，3、5、10倍稀釋的發(fā)酵液處理后的柑橘綠霉病發(fā)病率分別為11%、20%、33%。
[0024]表明本發(fā)明的淡紫灰鏈霉菌X33的培養(yǎng)物對果蔬青霉病菌有很好的防治效果。
[0025]實施例七:淡紫灰鏈霉菌X33發(fā)酵液對采后果蔬酸腐病的病害防治
選取柑橘例，處理方法同實施例五，柑橘的無菌水對照組酸腐病發(fā)病率為100%，3、5、10倍稀釋的發(fā)酵液處理后的柑橘酸腐病發(fā)病率分別為7%、16%、28%。
[0026]表明本發(fā)明的淡紫灰鏈霉菌X33的培養(yǎng)物對果蔬酸腐病菌有很好的防治效果。
[0027]實施例八:淡紫灰鏈霉菌X33發(fā)酵液在果蔬貯藏中的應(yīng)用
實驗設(shè)兩個處理，每處理3箱(每箱20公斤，約160個果實)，重復(fù)處理三次，在柑橘基本成熟期采果，剛采下的果實分別用清水和稀釋5倍的淡紫灰鏈霉菌X33發(fā)酵液浸果lmin，將果實晾干，1-2天后將將處理過的果實用聚乙烯薄膜單果包裝，置于紙箱內(nèi)，紙箱外覆聚乙烯薄膜，貯藏室為自然室溫(貯藏室消毒和管理參照《柑橘一生產(chǎn)技術(shù)與科學實驗》，科學出版社，1977年版)，試驗貯藏周期定為120天。從柑橘果實處理后入庫開始，每天記錄、觀察柑橘果實感病(重點是柑橘青霉病、綠霉病和酸腐病)的發(fā)生時間和狀況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)清水浸果的柑橘青霉病、綠霉病和酸腐病發(fā)病率分別為50%、30%、12% ;稀釋5倍的淡紫灰鏈霉菌X33發(fā)酵液浸果的 柑橘青霉病、綠霉病和酸腐病發(fā)病率分別為20%、11%、5%。
【權(quán)利要求】
1.一株淡紫灰鏈霉菌X33(lavendulae X33),其保藏編號為 CCTCC N0.M2013163。
2.一株淡紫灰鏈霉菌X33的應(yīng)用，其特征在于:利用培養(yǎng)基培養(yǎng)所述淡紫灰鏈霉菌X33產(chǎn)生的發(fā)酵液及其菌體應(yīng)用于防治果蔬病害和樹木病害。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的淡紫灰鏈霉菌X33的應(yīng)用，其特征在于:生產(chǎn)該霉菌時所述培養(yǎng)基含一種或一種以上的碳源物質(zhì)、一種或一種以上的氮源物質(zhì)及無機或有機鹽類物質(zhì)，其中碳源物質(zhì)含量為2%-10%，氮源物質(zhì)含量為2%-10%，鹽類物質(zhì)含量為0.01%-0.1%，所述的微生物培養(yǎng)在需氧條件下進行，發(fā)酵初始pH值為5.0- 10.0，發(fā)酵中后期調(diào)節(jié)pH值為6.0- 9.0，培養(yǎng)溫度為 20- 35
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的淡紫灰鏈霉菌X33的應(yīng)用，其特征在于:碳源物質(zhì)包括淀粉、糖蜜、脂肪、有機酸、脂肪酸、纖維二糖、氨基酸、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖、肌醇、半乳糖、海藻糖、木糖、甘露醇、鼠李糖和阿拉伯糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的淡紫灰鏈霉菌X33的應(yīng)用，其特征在于:氮源物質(zhì)包括玉米漿、豆粉、蛹粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、尿素、銨鹽、硝酸鹽。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的淡紫灰鏈霉菌X33的應(yīng)用，其特征在于:無機或有機鹽類物質(zhì)包括磷酸鹽、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鐵鹽。
7.權(quán)利要求2所述的淡紫灰鏈霉菌X33的應(yīng)用，其特征在于:應(yīng)用于果蔬保鮮劑，果蔬保鮮劑用于防治果蔬的綠霉病、青霉病和酸腐病。
8.權(quán)利要求2所述的淡紫灰鏈霉菌X33的應(yīng)用，其特征在于:應(yīng)用于生物農(nóng)藥，生物農(nóng)藥用于防治葡萄座腔菌引起的樹木的潰瘍病和枯梢病病害。
【文檔編號】C12R1/56GK103602607SQ201310327536
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月31日
【發(fā)明者】吳曉玉, 張宇坤, 段栓成, 陳金 申請人:江西農(nóng)業(yè)大學