豬鏈球菌多肽和編碼其的多核苷酸以及它們在疫苗和診斷中的應用的制作方法

豬鏈球菌多肽和編碼其的多核苷酸以及它們在疫苗和診斷中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及鏈球菌的領域。更具體地，本發(fā)明涉及鑒定多肽，和編碼其的多核苷酸序列，其涉及豬鏈球菌的發(fā)病機制。本發(fā)明還涉及將這樣的多肽用于預防，治療和診斷豬鏈球菌相關疾病和由豬鏈球菌造成的感染的組合物和方法的應用。
【專利說明】豬鏈球菌多肽和編碼其的多核苷酸以及它們在疫苗和診斷中的應用
[0001]本申請是申請日為2006年9月I日的發(fā)明名稱為“豬鏈球菌多肽和編碼其的多核苷酸以及它們在疫苗和診斷中的應用”的中國專利申請No. 200680038555. 9的分案申請。
發(fā)明領域
[0002]本發(fā)明涉及鏈球菌（Streptococcus)領域。更具體地，本發(fā)明涉及鑒定多肽和編碼其的多核苷酸序列，其涉及豬鏈球菌（Streptococcus suis)的發(fā)病機制。本發(fā)明還涉及將所述多肽用于預防、治療和診斷與豬鏈球菌相關的疾病和由豬鏈球菌導致的感染的組合物和方法中的應用。
[0003]發(fā)明背景
[0004]豬鏈球菌是一種重要的豬病原體，其導致許多病理疾病諸如關節(jié)炎，心內膜炎，腦膜炎，肺炎和敗血?。?3，14)。其還是對于接觸污染的豬或它們的副產物的人的重要的動物傳染病病原體，導致腦膜炎和心內膜炎（1，36)。目前已知基于莢膜抗原的三十三種血清型(1-31型，33和1/2型）（9-11，15，17，31)。2型被認為是在染病的豬中最致命和最流行的類型。目前還不完全了解涉及豬鏈球菌的發(fā)病機理和致病力的機制（13)并且嘗試控制感染的努力被缺乏有效疫苗所阻礙。
[0005]已經(jīng)開展了一些方法來開發(fā)豬鏈球菌的疫苗。然而，取得的成功十分有限，因為保護是血清型或菌株依賴型的并且結果在大多數(shù)情形中是不可靠的（16，30)。例如，報道了一些用殺死的全細胞和活的無毒疫苗獲得的保護，但是這需要重復的免疫并且針對異種攻擊的保護是不確定的（18，38)。將幼豬暴露于活的致病力強的菌株顯示在減少豬鏈球菌感染的臨床體征特征上具有積極的效果，但是在減少中樞神經(jīng)體征和死亡率上則差強人意
(35)。由于豬鏈球菌莢膜在致病`力中具有重要作用，因此進行了基于莢膜物質開發(fā)疫苗的嘗試。然而，這種疫苗是不令人滿意的，因為莢膜多糖的免疫原性較差（7)。最近，已經(jīng)將興趣轉移到將豬鏈球菌的蛋白質抗原作為疫苗候選物上。已經(jīng)顯示，使用suilysin(20)，或MRP (溶菌酶-釋放蛋白質）和EF(細胞外蛋白質因子）（39)的亞單位疫苗保護豬免于同型和異型2型血清型菌株，但是它們的應用被這樣的事實所妨礙，即在一些地理區(qū)域中的顯著數(shù)量的致病力強的菌株并不表達這些蛋白質（8，12，29)。因此，鑒定其它的抗原因子，尤其是表面蛋白質可以有助于開發(fā)亞單位疫苗。
[0006]因此，有開發(fā)和應用用于預防、治療和診斷豬鏈球菌相關疾病和豬鏈球引起的疾病的新靶標的需要。
[0007]發(fā)明概述
[0008]本發(fā)明的目標滿足上述需要。更具體地，通過提供在SEQ ID NO: I提出的氨基酸序列的N端區(qū)域包含至少15個連續(xù)氨基酸的分離的多肽來實現(xiàn)該目標。
[0009]本發(fā)明的另一個目標還涉及編碼如上定義的多肽的多核苷酸。
[0010]本發(fā)明還涉及特異性結合于本發(fā)明的多肽的抗體。
[0011]本發(fā)明的另一個目的是提供包含如上定義的多核苷酸的載體。[0012]本發(fā)明的另一個目的是提供用于預防或治療豬鏈球菌相關疾病或由豬鏈球菌導致的感染的組合物，其包含可接受的載體和下列成分的至少一種：
[0013]-如上定義的多肽；
[0014]-如上定義的多肽；
[0015]-如上定義的抗體；
[0016]-如上定義的載體。
[0017]本發(fā)明的另一個目標涉及治療和/或預防動物中豬鏈球菌相關疾病或感染的方法，所述方法包括向動物施用如上定義的組合物的步驟。
[0018]另一個目標涉及檢測樣品中豬鏈球菌菌株的存在或不存在的方法，所述方法包括下列步驟：
[0019]a)在足以形成免疫復合物的條件下，將所述樣品與本發(fā)明的抗體接觸一段時間；和
[0020]b)檢測在a)中形成的免疫復合物的存在或不存在。
[0021]本發(fā)明的另一個目標涉及檢測樣品中針對豬鏈球菌菌株產生的抗體的存在或不存在的方法，所述方法包括下列步驟：
[0022]a)在足以形成免疫復合物的條件下，將所述樣品與本發(fā)明的多肽接觸一段時間；和
`[0023]b)檢測在a)中形成的免疫復合物的存在或不存在。
[0024]本發(fā)明還在另一個目的中提供用于檢測指示豬鏈球菌菌株的抗體的存在或不存在的診斷試劑盒，所述試劑盒包括：
[0025]-根據(jù)本發(fā)明的多肽；
[0026]-檢測多肽-抗體免疫復合物的試劑；
[0027]-缺乏與所述肽免疫性結合的抗體的生物參比樣品；和
[0028]-包含可以特異性結合于所述肽的抗體的比較樣品；
[0029]其中所述多肽，試劑，生物參比樣品，和比較樣品以足以進行所述檢測的量存在。
[0030]另一個目的是提供用于檢測指示豬鏈球菌菌株的抗體的存在或不存在的診斷試劑盒，其包括：
[0031]-本發(fā)明的抗體；
[0032]-檢測多肽-抗體免疫復合物的試劑；
[0033]-與所述抗體免疫結合的生物參比樣品多肽；和
[0034]-包含可以與所述肽特異性結合的多肽的比較樣品；
[0035]其中所述抗體，試劑，生物參比樣品，和比較樣品以足以進行所述檢測的量存在。
[0036]另一個目標是提供包含與SEQ ID NOll中提出的序列或其功能衍生物基本相同的氨基酸序列的分離的多肽，和編碼所述多肽的分離的多核苷酸，和它們在用于治療和/或預防動物中豬鏈球菌相關疾病或感染的組合物和/或方法中的應用。
[0037]附圖簡述
[0038]除非另外特別相反地指出，術語“SP1”和“Sao”交互使用。
[0039]圖I:本發(fā)明的優(yōu)選多核苷酸，即重組質粒pSS735的DNA插入物的示意圖和部分限制性酶切圖譜。數(shù)字指示從5’端的距離（以堿基對表示）。[0040]圖2:編碼本發(fā)明的第一個實施方案的優(yōu)選多肽，即豬鏈球菌的SPl (或Sao)蛋白質的基因的核苷酸序列和推導的氨基酸序列。SD序列以斜體字母和下劃線表示。以粗體顯示起始密碼子，ATG和終止密碼子，TAA。用下劃線表示SPl的N-和C端的兩個疏水片段。垂直箭頭指示可能的信號肽酶的裂解位點。Rl-RlO表示重復單位的起始。用虛線下劃線表示可能的細胞壁相關區(qū)域。用框表示LPVTG膜錨定基序，并且指示帶電荷的C端尾。
[0041]圖3: SPl 的 Lys319 到 Val6ci1 區(qū)域與水稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzaepv. oryzae)的AvrXa7無毒因子的氨基酸序列排比。垂直線表示具有相同殘基的位置。雙點表示保守替換，而單點表示功能替換。
[0042]圖4:MBP_SP1融合蛋白質在大腸桿菌（E. coli)XLl-Blue中的表達和重組成熟SPl的純化。用恢復期豬血清檢測的相應樣品的考馬斯藍染色的凝膠（A)和蛋白質印跡分析(B)顯示在用IPTG誘導前（泳道I)和后（泳道2)的大腸桿菌全細胞裂解物，細胞質的提取物（泳道3)，親和性純化的MBP-SPl融合蛋白（泳道4)，通過因子X裂解的SPl和MBP (泳道5)，和使用離子交換層析法純化的無MBP的重組SPl (泳道6)。在左邊顯示標準蛋白質的分子量。
[0043]圖5:豬鏈球菌的免疫電鏡顯微觀察（4500x)。使用單特異性SPl抗血清和金綴合的二抗（B)證實了 SPl在豬鏈球菌上的表面定位。在對照細菌細胞上沒有觀察到標記（A)。棒，200nm。
[0044]圖6:在小豬中用SPl接種疫苗后的抗體反應。⑷通過ELISA測量在血清中的總的SPl-特異性IgG，顯示單一 SPl注射激發(fā)顯著的IgG反應，其明顯由強化劑增強。（B)在SPl免疫的豬中對于血清IgG同種型的ELISA顯示IgGl水平持續(xù)比IgG2水平更高。將結果表示為吸光度的平均值和標準偏差。*:p < 0.05 [0045]圖7:在用Quil A和Quil A加SPl免疫的小鼠中的SPl -特異性總的體液IgG滴度。
[0046]圖8:在來自用重組SPl免疫的小鼠的血清中的IgG亞類。
[0047]圖9:用重組SPl接種疫苗保護小鼠免于豬鏈球菌攻擊感染。
[0048]圖10:用重組SPl接種疫苗保護小鼠免于豬鏈球菌引起的死亡。
[0049]圖11:本發(fā)明的優(yōu)選的功能性多核苷酸片段的核苷酸序列，即SPlA基因片段和推導的氨基酸序列。
[0050]圖12:重組噬菌體的示意圖和6. 3kb插入物的部分限制性酶切圖譜。數(shù)字指示從5’端的距離（以堿基對表示)。
[0051]圖13:編碼本發(fā)明的另一個實施方案的優(yōu)選多肽的基因的核苷酸序列和推導的氨基酸序列，即豬鏈球菌的SP2蛋白質。用下劃線表示SP2的N端的帶正電荷的簇。用虛線下劃線表示可能的N-端信號序列。用框表示LysM結構域，并且用箭頭指示重復單位的開始。
[0052]圖14:在不同的豬鏈球菌血清型中的SP2基因的分布。通過PCR從33個豬鏈球菌血清型參比菌株中的31個擴增SP2基因。
[0053]圖15:在大腸桿菌中的Trx-His-SP2融合蛋白的表達和重組成熟SP2的純化?？捡R斯藍染色凝膠顯示用IPTG誘導后的大腸桿菌全細胞裂解物，親和性純化的Trx-His-SP2融合蛋白，通過腸激酶裂解的SP2和Trx-His，通過陰離子交換層析法分離的成熟的SP2和Trx-His標記。在左邊表示分子量。
[0054]圖16:重組SP2的免疫原性和IgG-結合活性。a) SP2-特異性兔血清與豬鏈球菌S735的細胞制備物反應。b)重組SP2與恢復期豬血清反應。重組SP2與人（c)和豬（d)IgG結合。[0055]圖17:在小鼠中用重組SP2接種疫苗后的抗體反應。通過ELISA測量血清中的SP2-特異性IgG。
[0056]圖18:用重組SP2接種疫苗減緩了用致病力強的豬鏈球菌菌株攻擊的小鼠中的臨床體征。
[0057]圖19:用重組SP2接種疫苗保護小鼠免于豬鏈球菌引起的死亡。
[0058]圖20:用根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的組合物接種疫苗的豬，在攻擊后的體溫。
[0059]圖21:用根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的組合物接種疫苗的豬在攻擊后的臨床疾病。
[0060]圖22:用根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的組合物接種疫苗的豬在攻擊后的存活。
[0061]圖23:用根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的組合物接種疫苗的豬的血清總的IgG滴度。
[0062]圖24:從用根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的組合物接種疫苗的豬誘導的IgG亞類。
[0063]圖25:在根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的兩個SPl多肽，即SEQ ID NOl和2之間的氨基酸序列排比。
[0064]圖26:在根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的兩個SPl多肽，即SEQ ID NOl和3之間的氨基酸序列排比。
[0065]圖27:在根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的兩個SPl多肽，即SEQ ID N02和3之間的氨基酸序列排比。
[0066]圖28:在根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的三個SPl多肽，即SEQ ID NOU2和3之間的氨基酸序列排比。
[0067]發(fā)明簡述
[0068]發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)兩種新的豬鏈球菌多肽和編碼其的多核苷酸，其在豬鏈球菌發(fā)病機制中有所涉及。就此而論，本發(fā)明具體涉及它們的鑒定和所述多肽或多核苷酸在組合物和方法中的應用，所述組合物和方法用于預防，治療和診斷豬鏈球菌相關疾病或由豬鏈球菌導致的感染。
[0069]本發(fā)明的方法可以應用的豬鏈球菌相關疾病的非窮舉性列表包括那些，如關節(jié)炎，心內膜炎，腦膜炎，肺炎和敗血癥。
[0070]定義
[0071]術語“分離的”意為描述在不同于其中多核苷酸，多肽，抗體或宿主細胞天然存在的環(huán)境的環(huán)境中存在的多核苷酸，多肽或抗體。
[0072]術語“動物”指對鏈球菌菌株如豬鏈球菌感染敏感的任何動物。具體地，這樣的動物可以是，但不限于，小鼠，豬，山羊，馬和人。更具體地，所述動物由豬組成。
[0073]術語“治療”指通過其與鏈球菌菌株相關的感染或疾病的癥狀被緩和或完全消除的過程。用于本文時，術語“預防”指通過其與鏈球菌菌株相關的感染或疾病的癥狀被阻斷或延遲。[0074]術語“保護性反應”意為在動物中預防豬鏈球菌相關疾病或由豬鏈球菌導致的感染的發(fā)作或減輕存在的這樣的疾病的嚴重性。例如，可以通過指定如在實施例4中限定的臨床評分來評估“保護性反應”的水平。
[0075]表述“可接受的載體”意為包含通過本發(fā)明的方法獲得的化合物的賦形劑，其可以施用于動物宿主，而沒有不利副作用。本領域已知的適合的載體包括，但不限于，金顆粒，無菌水，鹽水，葡萄糖，右旋糖或緩沖溶液。載體可以包含助劑，包括但不限于，稀釋劑，穩(wěn)定劑(即，糖和氨基酸)，防腐劑，濕潤劑，乳化劑，PH緩沖劑，粘度增強添加劑，顏料等。
[0076]用于本文時，術語“片段”指這樣的多核苷酸序列(例如，cDNA)，其是人工構建(例如通過化學合成)或通過將天然產物裂解成多個小片段(使用限制性內切酶，或機械剪切)構建的本發(fā)明核酸的分離的部分，或通過PCR，DNA聚合酶或本領域公知的任何其它聚合技術合成的核酸的部分，或通過本領域技術人員公知的重組核酸技術在宿主細胞中表達的核酸的部分。
[0077]1、本發(fā)明的多核苷酸和多肽
[0078]在第一個實施方案中，本發(fā)明涉及分離的多肽，其由表面蛋白質，更具體地豬鏈球菌的C-端錨定表面蛋白，即所謂SPl或Sao組成。如在實施例部分中所顯示，當施用于動物，如豬時，SPl多肽有利地激發(fā)針對豬鏈球菌菌株攻擊的保護性反應。
[0079]具體地，本發(fā)明的第一個實施方案的分離的多肽在SEQ ID NO:1提出的氨基酸序列的N端區(qū)域包含至少1 5個或優(yōu)選地甚至25個或更優(yōu)選地甚至至少35個連續(xù)氨基酸。如本領域技術人員可理解的，當指Sao蛋白時，在本發(fā)明上下文中的術語“N-端區(qū)域”優(yōu)選地由跨越SEQ ID NO:1提出的氨基酸序列的氨基酸殘基1-293的區(qū)域組成。
[0080]根據(jù)一個優(yōu)選實施方案，第一個實施方案的分離的多肽可以還包含至少一個重復的氨基酸序列，如在圖2中所 顯示。更具體地，本發(fā)明所意欲的重復氨基酸序列由在SEQ IDN09中顯示的氨基酸序列組成，
[0081]其中
[0082]-Xaa1 是 Val, Thr 或 Ile;
[0083]-Xaa3 是 Lys 或 Glu;
[0084]-Xaa4 是 Lys 或 Glu;
[0085]-Xaa5 是 Ala 或 Gln;
[0086]-Xaa7 是 Thr 或 Pro;
[0087]-Xaa8 是 Gly, Ser 或 Val;
[0088]-Xaa9 是 Lys, Val, Ile 或 Asn;
[0089]-Xaa10 是 Glu 或 Val;
[0090]-Xaa11 是 Lys 或 Asn;
[0091]-Xaa12 是 Gly, Glu 或 Asp;
[0092]-Xaa13 是 Asn 或 Met;
[0093]-Xaa14 是 lie, Ala 或 Val;
[0094]-Xaa15 是 Glu 或 Val;
[0095]-Xaa16 是 Pro 或 Thr;
[0096]-Xaa18 是 Glu 或 Gln;[0097]-Xaa19 是 Lys 或 Glu;
[0098]-Xaa22 是 Thr 或 Ala;
[0099]-Xaa26 是 Lys 或 Asn;
[0100]-Xaa27 是 Asp 或 Glu;
[0101]-Xaa28 是 Asn 或 Lys;
[0102]-Xaa29 是 Ile 或 Val 和
[0103]-Xaa30 是 Glu 或 Val。
[0104]要理解，本發(fā)明的優(yōu)選的SPl多肽可以包含僅一個所述重復序列，而在一些其它情形中，本發(fā)明的優(yōu)選的SPl多肽可以包含至少兩個重復序列或甚至多于10個這樣的重復序列。
[0105]根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，分離的SPl多肽在SEQ ID N0:1提出的氨基酸序列的C端區(qū)域有利地包含至少15個或優(yōu)選地甚至25個或更優(yōu)選地甚至至少35個連續(xù)氨基酸。優(yōu)選地，C端區(qū)域包含膜錨定基序，如由在SEQ ID NOlO提出的氨基酸序列組成的膜錨定基序，即Lys Pro Val Thr Gly0
[0106]如本領域技術人員可以理解的，當指SPl蛋白時，在本發(fā)明的上下文中的術語“C-端區(qū)域”優(yōu)選地由跨越SEQ ID NO:1中提出的氨基酸序列的氨基酸殘基的593-670的區(qū)域組成。
`[0107]根據(jù)甚至更優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的SPl多肽包含與選自由SEQ ID N0S1-3或其功能衍生物組成的組的序列基本上相同的氨基酸序列。最優(yōu)選地，本發(fā)明的SPl多肽由與SEQ ID NOl顯示的序列或其功能衍生物基本上相同的氨基酸序列組成。
[0108]如本文一般理解和使用，“功能衍生物”指具有與完整蛋白/肽序列的生物活性基本類似的功能生物活性的蛋白/肽序列。換言之，其優(yōu)選地指當將所述功能衍生物施用于動物時，基本上保留了激發(fā)免疫應答，如針對豬鏈球菌菌株攻擊的保護性反應的能力的多肽或其片段。本發(fā)明所意欲的優(yōu)選的功能衍生物包含基本上與SEQ ID N04中提出的序列相同的氨基酸序列。更具體地，優(yōu)選的功能衍生物由SEQ ID NOl的315個氨基酸片段(S28-K342)組成。將這樣的片段或多肽稱為SPlA并且將其核苷酸和氨基酸序列顯示在圖11中。SPlA與恢復期豬血清在免疫印跡中強烈反應并且用重組SPlA進行的免疫在豬和小鼠中激發(fā)顯著的體液抗體反應，證實了 SPlA是高度免疫原性的(見，實施例5)。
[0109]根據(jù)第二個實施方案，本發(fā)明涉及另一種分離的豬鏈球菌多肽，即所謂SP2，其有利地激發(fā)動物中的保護性反應。
[0110]具體地，本發(fā)明的第二個實施方案的分離的多肽包含與在SEQ ID NO: 11中提出的序列，或其功能衍生物基本相同的氨基酸序列。
[0111]當指氨基酸序列時，“基本上相同”可以理解為本發(fā)明的多肽優(yōu)選地具有這樣的氨基酸序列，其與SEQ ID NOS1-4和11中所示的序列的部分或全部具有至少75%同源性，或甚至優(yōu)選地85%同源性，或甚至更優(yōu)選地95%同源性。
[0112]在該背景下的“同源性”意味著還包括與參比序列相同或類似，同時提供任何氨基酸的簡單替換/修飾?？梢杂肂LAST-P (基本局部排比檢索工具)，本領域技術人員公知的程序進行該方面的同源性檢索。對于相應的核酸序列，同源性涉及在本領域中已知的BLASTX和BLASTN程序。[0113]本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的優(yōu)選的SPl或優(yōu)選的SP2多肽的分離的多核苷酸。優(yōu)選地，當指SPl和SEQ ID N012時，當指SP2和它們的各個功能片段時，本發(fā)明的分離的多核苷酸包含與SEQ ID N0S5-7顯不的序列基本上相同的核苷酸序列。
[0114]當指核酸序列時，所謂“基本上相同”要理解的是本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選地具有這樣的核酸序列，其與SEQ ID N0S5-7和12或其功能片段的部分或全部具有至少65%相同，更特別地80%相同和甚至更特別地95%相同。
[0115]如本文一般理解和使用，“功能性片段”指編碼與完整核酸序列的生物活性基本相似的功能生物活性的核酸序列。換言之，在本發(fā)明的上下文中，其優(yōu)選地指基本上保留了編碼這樣的多肽/蛋白質能力的核酸或其片段，所述多肽/蛋白質當施用于動物時，激發(fā)針對豬鏈球菌菌株攻擊的免疫應答，和更優(yōu)選地保護性反應。例如，這樣的片段是在SEQ ID N08中顯示的多核苷酸，其編碼如上定義的SPlA多肽。
[0116]在另一個實施方案中，本發(fā)明還涉及載體(例如，克隆的或表達載體)，其包含本發(fā)明的如上定義的多核苷酸。
[0117]用于本文時，術語“載體”涉及被設計用于轉導/轉染一種或多種細胞類型的多核苷酸構建體。載體可以是，例如“克隆載體”，其被設計用于分離，增殖和復制插入的核苷酸，“表達載體”，其被設計用于在宿主細胞中表達核苷酸序列，或“病毒載體”，其被設計用于生產重組病毒或病毒樣顆粒，或“穿梭載體”，其包含不只一種類型的載體的性質。
[0118]公眾可獲得適合于穩(wěn)定轉染細胞和細菌的許多載體(例如，質粒，腺病毒，桿狀病毒，酵母桿狀病毒，植物病毒，腺伴隨病毒，反轉錄病毒，單純皰疹病毒，α病毒，慢病毒)，還可以獲得構建這樣的細胞系的方法。要理解的是，本發(fā)明包括包含本發(fā)明的任何多核苷酸分子的任何類型的載體。
[0119]2.抗體`
[0120]在另一個實施方案中，本發(fā)明的特征是特異性結合本發(fā)明的多肽的抗體。更具體地，所述抗體是特異性結合于如上定義的優(yōu)選豬鏈球菌多肽的純化的多克隆或單克隆抗體。
[0121]本發(fā)明的抗體可以通過本領域技術人員已知的多種方法進行制備。例如，本發(fā)明的多肽可以施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。備選地，如上所述，如本文所述使用的抗體可以是單克隆抗體，其使用已知的雜交瘤技術進行制備(見，例如Ha_erling等，在 Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (單克隆抗體和 T 細胞雜交瘤)中，Elsevier, NY, 1981; Charland, N., M.Jacques, S.1acouture 和 M.Gottschalk.1997.Characterization and protective activity of a monoclonal antibody against acapsular epitope shared by Streptococcus suis 血清型 1，2andl/2 (針對豬鏈球菌血清型1，2和1/2共享的莢膜表型的單克隆抗體的特征和保護活性).Microbiology (微生物學)143(Ptll):3607-14)。
[0122]關于本發(fā)明的抗體，術語“特異性結合于”指以相對較高親和性與本發(fā)明的SPl或SP2多肽的一個或多個表位結合的抗體，但是其未基本識別并且結合除了本發(fā)明的SPl或SP2多肽的分子。如本文所用，術語“相對較高的親和性”意味著在抗體和SPl或SP2多肽之間的結合親和性為至少IO6M'和優(yōu)選地至少約IO7M'和甚至更優(yōu)選地IO8M4到IOwM'優(yōu)選地，在對于是本領域技術人員公知常識的標準的競爭結合免疫測定條件下進行這樣的親和性的確定。
[0123]3.治療的方法和組合物
[0124]可以以許多方式，將SPl和SP2多肽，編碼其的多核苷酸和本發(fā)明的抗體用于治療和/或預防豬鏈球菌相關疾病或由豬鏈球菌導致的感染。
[0125] 例如，按照本發(fā)明的一方面，可以將本發(fā)明的SPl和/或SP2多肽用作免疫原，以生產用于治療和/或預防豬鏈球菌感染的特異性抗體。適合的抗體可以使用適合的篩選方法進行確定，例如通過測量特異性抗體在測試模型中被動保護豬鏈球菌感染的能力。動物模型的實例是在本文的實施例中所述的小鼠和豬模型。
[0126]按照另一個方面，編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸或其衍生物可以用于DNA免疫方法。即，它們可以結合到載體中，所述載體在注射后可以復制并且可以表達由此體內生產抗原性多肽。例如，多核苷酸可以結合到在CMV啟動子控制下的質粒載體中，其在真核細胞中發(fā)揮功能。優(yōu)選地，所述載體通過肌內注射。
[0127]本發(fā)明的多核苷酸在遺傳免疫中的應用優(yōu)選地使用適合的遞送的方法或系統(tǒng)如直接將質粒DNA注射到肌肉中[Wolf等.H M G (1992) 1:363，Turnes等,Vaccine(疫苗)(1999), 17:2089, Le 等,Vaccine(疫苗)(2000) 18:1893, Alves等，Vaccine (疫苗)(2001) 19:788]，與或不與佐劑一起注射質粒DNA [Ulmer等,Vaccine (疫苗)(1999) 18:18, MacLaughlin 等,J.Control Release (控制釋放雜志)(1998) 56:259，Hartikka 等，Gene Ther(基因治療).(2000) 7:1171-82，Benvenisty 和Reshef, PNAS USA (1986) 83:9551，Singh 等，PNAS USA (2000) 97:811],通過遞送與特異性載體復合的DNA靶向細胞[Wa等，J Biol Chem(生物化學雜志)(1989) 264:16985，Chaplin等，Infect.1mmun.(感染免疫學)(1999)67:6434],注射復合或包封在各種形式的脂質體中的質粒[Ishii 等，AIDS Research and Human Retroviruses (AIDS 研究和人逆轉錄病毒)(1997) 13:142，Perrie 等，Vaccine (疫苗)(2001) 19:3301],用不同的轟擊方法施用 DNA[Tang 等，Nature (1992) 356:152，Eisenbraun 等，DNA Cell Biol (DNA細胞生物學)(1993) 12:791, Chen 等，Vaccine(疫苗)(2001) 19:2908],和用活的載體施用 DNA[Tubulekas 等,Gene (基因)(1997) 190:191, Pushko 等,Virology (病毒學)(I"7)239:389, Spreng 等 FEMS (2OOO) 27:2"，Dietrich 等，Vaccine (疫苗)(2001)19:2506]。
[0128]本發(fā)明的另一個方面是使用針對本發(fā)明的多肽的抗體進行被動免疫?？梢允褂帽旧暾堉兴龅目贵w。
[0129]在這個方面，本發(fā)明的另一個實施方案涉及用于預防或治療這樣的疾病或感染的組合物。本發(fā)明的組合物有利地包含可接受的載體和本發(fā)明的SPl和/或SP2多肽。備選地，本發(fā)明的組合物可以包含本發(fā)明的抗體和/或多核苷酸和/或表達載體。
[0130]在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物還包含佐劑。用于本文時，術語"佐劑"指加入到本發(fā)明的組合物中以增加組合物的免疫原性的物質。佐劑怎樣發(fā)揮功能的機制尚不完全清楚。據(jù)信，一些佐劑通過緩慢釋放抗原增加免疫應答(體液和/或細胞應答)，而其它的佐劑本身是強免疫原性的并且據(jù)信它們協(xié)同發(fā)揮功能。已知的佐劑包括，但不限于:油和水乳狀液(例如，完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑)，Corytzebacte1-1um parvuin,
Quil A，細胞因子如IL12，Eimilsigen-Phis?,卡介苗，氫氧化鋁，葡聚糖，硫酸葡聚糖，氧化鐵，藻酸鈉，Bacto佐劑，某些合成聚合物如聚氨基酸和氨基酸的共聚物，皂草苷，石蠟油，和胞壁酰二肽。佐劑還包括遺傳佐劑如在共接種的DNA中編碼的免疫調控分子或作為CpG寡核苷酸。共接種的DNA可以在相同的質粒構建體中如質粒免疫原或在單獨的DNA載體中。
[0131]本發(fā)明的另一個實施方案是提供治療和/或預防動物中豬鏈球菌相關疾病或感染的方法。本發(fā)明的方法包含向動物施用根據(jù)本發(fā)明的組合物的步驟。
[0132]可以將其它的試劑加入本發(fā)明的組合物。例如，本發(fā)明的組合物還可以包含試劑如藥物，免疫刺激劑(如α-干擾素，β-干擾素，Y-干擾素，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2 (IL2))，抗氧化劑，表面活性劑，著色劑，揮發(fā)性油，緩沖劑，分散劑，推進劑和防腐劑。為了制備這樣的組合物，可以使用本領域公知的方法。本發(fā)明的組合物的成分或組分的量優(yōu)選地是治療有效量。所意欲成分的治療有效量是容許其在組合物施用的宿主中發(fā)揮它們的免疫學作用而不導致過度副作用所必需的量。所用的成分和待施用的組合物的精確的量將根據(jù)因素如治療的疾病的類型，待治療的動物的類型和年齡，施用的方式，以及組合物中的其它成分而變化。
[0133]可以通過各種給藥途徑向動物給藥本發(fā)明的組合物。例如，所述組合物可以以無菌可注射制劑形式進行施用，如無菌可注射的水性或油性混懸液。這些混懸液可以使用適合的分散劑或濕潤劑和懸浮劑根據(jù)本領域已知的技術進行配制。無菌可注射制劑還可以是在無毒腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或混懸液。它們可以通過腸胃外給藥，例如通過靜脈內，肌內或皮下，通過注射，通過輸注或口服的方式。適合的劑量將根據(jù)因素如組合物中每種成分的量，需要的效果(短或長期)，施用的途徑，待治療的動物的年齡和體重而變化?？梢允褂帽绢I域公知的任何其它方式來施用本發(fā)明的組合物。
[0134]4.檢測或診斷方法和試劑盒
[0135]還可以以不同方式 將本發(fā)明的SPl和/或SP2多肽，編碼其的多核苷酸和抗體用于檢測和診斷豬鏈球菌相關疾病或由豬鏈球菌引起的感染。
[0136]在該方面和在另一個實施方案中，本發(fā)明提供檢測樣品中豬鏈球菌菌株的存在或不存在的方法，所述方法包括下列步驟:
[0137]a)在足以形成復合物的的條件下，將所述樣品與如上定義的抗體接觸一段時間；和
[0138]b)檢測在a)中形成的復合物的存在或不存在。
[0139]用于本文時，術語〃樣品〃指獲自動物的各種樣品類型并且可以用于診斷或檢測測試。該定義還包括生物起源的血液和其它液體樣品，固體組織樣品如活組織檢查樣品或組織培養(yǎng)物或來自其中的細胞。
[0140]在另一個實施方案中，本發(fā)明提供檢測樣品中針對豬鏈球菌菌株產生的抗體的存在或不存在的方法，所述方法包括下列步驟:
[0141]a)在足以形成免疫復合物的條件下，將所述樣品與如上定義的多肽接觸一段時間；和
[0142]b)檢測在a)中形成的免疫復合物的存在或不存在。
[0143]本領域技術人員將認識到該診斷測試可以采取多種形式，包括免疫測試如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)或放射性免疫測定，以基本確定特異于蛋白質(如SPl和/或SP2)的抗體是否在生物中存在。[0144]本發(fā)明還提供用在任何上述診斷方法中的試劑盒。這些試劑盒典型地包含兩種或多種進行診斷測試所需要的成分。成分可以是化合物，試劑，容器和/或設備。例如，在試劑盒中的一個容器可以包含特異性結合于本發(fā)明的SPl或SP2多肽的抗體或其片段。一種或多種另外的容器還包括組分，如用在所述測試中的試劑或緩沖劑。
[0145]在該方面，本發(fā)明還提供用于檢測指示豬鏈球菌菌株的抗體的存在或不存在的診斷試劑盒，所述試劑盒包括:
[0146]-根據(jù)本發(fā)明的SPl和/或SP2多肽；
[0147]-檢測多肽-抗體免疫復合物的試劑；
[0148]-缺乏與所述肽免疫性結合的抗體的生物參比樣品；和
[0149]-包含可以特異性結合于所述肽的抗體的比較樣品；
[0150]其中所述多肽，試劑，生物參比樣品，和比較樣品以足以進行所述檢測的量存在。
[0151]優(yōu)選地意欲的另一種診斷試劑盒是用于檢測指示豬鏈球菌菌株的存在或不存在的試劑盒，其包括:
[0152]-根據(jù)本發(fā)明的抗體；
[0153]-檢測多肽-抗體免疫復合物的試劑；
[0154]-與所述抗體免疫結合的生物參比樣品多肽；和
[0155]-包含可以與所述肽特異`性結合的多肽的比較樣品；
[0156]其中所述抗體，試劑，生物參比樣品，和比較樣品以足以進行所述檢測的量存在。實施例
[0157]參考下面的實施例，本發(fā)明將更容易理解。這些實施例舉例說明本發(fā)明的廣泛的應用性并且不傾向于限制其范圍?？梢栽诓槐畴x本發(fā)明的精神和范圍的前提下對其進行各種修飾和改進。盡管與本文所述的那些相似或等價的任何方法和材料可以用在實施本發(fā)明的測試中，在下面描述的是優(yōu)選的方法和材料。
[0158]實施例1
[0159]鑒定豬鏈球菌的表面蛋白并評價其在豬中的免疫原性和保護能力
[0160]鑒定一種新的豬鏈球菌表面蛋白，其與來自被2型豬鏈球菌臨床感染豬的恢復期血清反應。命名為SPl的表觀分子量為IlOkDa的蛋白質顯示革蘭氏陽性細菌的膜錨定表面蛋白的典型特征如信號序列和LPVTG膜錨定基序。此外，檢測到經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于植物病原體的保守的無毒結構域。使用SPl特異性的抗血清進行電鏡顯微檢查證實SPl蛋白在豬鏈球菌上的表面定位。SPl特異性抗體在免疫印跡中與大多數(shù)豬鏈球菌血清型和2型分離株的細胞裂解物反應，證實了其在豬鏈球菌物種中的高度保守性。用重組SPl通過肌內途徑免疫小豬激發(fā)了顯著量的總免疫球蛋白G(IgG)抗體反應。然而，抗體反應沒有被反映在豬的保護中，所述豬用致病力強的菌株以我們常規(guī)的接種模型進行氣管內攻擊。
[0161]材料和方法
[0162]細菌菌株，噬菌體，質粒和培養(yǎng)基。將2型血清型豬鏈球菌的參比菌株S735用于基因組文庫構建。將33種血清型(1-31，33和1/2型)的參比菌株，來自不同來源的2型血清型的26種菌株以及5種野生(field)其它的革蘭氏陽性生物列于表1中。噬菌體λ ZapII 和大腸桿菌(Escherichia coli)XLl-Blue MRF菌株獲自商業(yè)來源(Stratagene, LaJolla, Calif.)。將豬鏈球菌在37°C，5%C02下，培養(yǎng)在Todd-Hewitt鏈球菌肉湯培養(yǎng)基(THB, Difco,底特律，密歇根州.)或瓊脂培養(yǎng)平板(Quelab實驗室，蒙特利爾，加拿大)上，而將其它的革蘭氏陽性細菌如ATCC目錄推薦進行培養(yǎng)。將大腸桿菌在單獨的LB培養(yǎng)基中或補充了 2g麥芽糖/升的LB培養(yǎng)基中，在37°C進行培養(yǎng)。如果適合，將大腸桿菌在50 μ g氨芐青霉素/ml和0.8mM異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)存在下進行培養(yǎng)。將pMal?_p載體(新英格蘭生物實驗室(New England BioLabs))用于生產MBP-SP1融合蛋白。
[0163]抗血清從臨床感染了 2型豬鏈球菌菌株S735的豬中收集了恢復期豬血清。通過用230μ g以0.5ml的弗氏不完全佐劑乳化的純化的SPl靜脈內免疫的新西蘭白兔獲得單特異性抗-SPl血清。所述兔以相同劑量的SP1，以2周間隔接受了兩次強化注射，并接著在最后一次強化免疫后10天采血。在_20°C貯存血清直到使用。
[0164]spl基因的鑒定，克隆和測序.如以前所述(33)分離豬鏈球菌S735菌株的染色體DNA。用限制性酶EcoRI部分消化純化的染色體DNA，并將得到的片段在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳。從凝膠中提取6-10kb大小的片段并與λ ZapII載體的EcoRI臂連接，使用Gigapack II包裝提取物(Stratagene)將載體進行包殼作用。將重組曬菌體用于感染大腸桿菌XLl-Blue MRF’，接著將所述大腸桿菌接種到LB瓊脂上。將得到的噬菌斑轉移到硝化纖維素膜上(Bio-Rad, Mississauga, Ontario,加拿大)。使用具有2%脫脂乳的Tris-鹽水緩沖液(TBS)封閉膜并用來自豬鏈球菌2型血清型感染的恢復期豬血清，過氧化物酶綴合的兔抗豬免疫球蛋白G(IgG)抗血清(Jackson免疫研究實驗室公司，West Grove, Pa.)和鄰苯二胺順序溫育。將陽性曬菌斑純化到均質。用ExAssist輔助曬菌體(Stratagene)Jg據(jù)生產商的說明書切除重組的PBluescript質粒。使用T3和T7啟動子作為引物，在DNA測序儀器，Maine大學(Orono，ME，USA)中確定插入物的序列。使用網(wǎng)上可獲得的程序分析核苷酸和從開發(fā)閱讀框(ORFs)推導的氨基酸序列。
[0165]將編碼成熟SPl的 序列從菌株S735的純化的染色體DNA通過PCR引物Pl [0166](5，-ATGGATCCATTGAAGGCCGCTCGGCACAAGAAGTAAAA-3’ ;
[0167]SEQ ID NO 13)
[0168]和P2 (5，-CCAAGTCGACTTATAATTTACGTTTACGTGTA-3’ ; SEQ ID NO 14)進行擴增，所述引物分別包含BamHI和Sal I限制性位點。如下進行PCR:在94°C 5分鐘，隨后進行30個循環(huán)的在94°C I分鐘，560C 30秒和在72°C I分鐘。將得到的PCR片段克隆到pMAL-p表達載體的Bam HI和Sal I位點。將包含spl基因的重組質粒命名為p0RF3。
[0169]重組SPl蛋白的表達和純化通過用Genepulse II儀器(Bio-Rad),按照生產商的推薦進行電穿孔，將純化的質粒P0RF3用于轉化大腸桿菌XLl-Blue菌株。將該重組菌株培養(yǎng)在加入2g葡萄糖/L和50 μ g氨芐青霉素/ml的LB培養(yǎng)基中。對于過度表達，將培養(yǎng)物從其起始0D_被調整為0.1的過夜培養(yǎng)物進行接種。將培養(yǎng)物進行溫育，伴隨攪拌直到OD600為約0.8，并接著加入IPTG以誘導生產MBP-SPl融合蛋白。2小時的誘導后，在細菌周質以及細胞質中發(fā)現(xiàn)融合蛋白。確定使用細菌裂解物的提取物來純化SPl蛋白。
[0170]使用直鏈的淀粉樹脂(新英格蘭生物實驗室)，按照生產商的說明書，通過親和層析法純化融合蛋白。將大腸桿菌細胞沉淀物懸浮在親和性柱結合緩沖液(20mMTris-HCl, 50mM NaCl, pH7.4)中并使用弗氏細胞壓碎器(SLM儀器公司)裂解細胞。在用0.45 μ m膜過濾后，將上清液經(jīng)過直鏈淀粉樹脂。用在結合緩沖液中的1%麥芽糖洗脫MBP-SPl融合蛋白，并通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確定包含蛋白質的級分。將純化的融合蛋白用蛋白酶因子Xa(新英格蘭生物實驗室)，以20 μ g/mg蛋白質的濃度進行裂解,并將其應用到mono-Q柱上(阿莫仙藥物生物技術(AmershamPharmacia Biotech), Baie d’ Urfee,加拿大)。通過使用線性 NaCl 梯度(在 20mMTris-HCl, pH7.4中的0_0.4M NaCl)將無MBP載體的重組SPl從柱上洗脫。將包含SPl-的級分進行合并并針對PBS緩沖液進行透析。通過SDS-PAGE評估重組SPl的純度，并通過Bradford蛋白質測定(Bio-Rad),根據(jù)生產商的說明書來確定蛋白質的濃度。
[0171]SDS-PAGE和蛋白質免疫印跡。如Laemmli (21)所述進行SDS-PAGE。在10%丙烯酰胺凝膠上分離總的細胞提取物或純化的蛋白，并接著用考馬斯亮藍R250(希格瑪(Sigma), St.Louis, Mo)對凝膠進行染色。將預染色的低分子量標記物(Bio-Rad)用于確定蛋白質的表觀分子量。備選地，基本上如Burnette (5)所述進行被轉移到硝化纖維素膜上的蛋白質的蛋白質印跡。
[0172]免疫電鏡術.將豬鏈球菌S735菌株在5ml的THB上培養(yǎng)過夜，離心并重懸在500 μ I的PBS (ρΗ8.0)中。將20 μ I的細菌混懸液置于鎳-透明載網(wǎng)(INRS，InstitutArmand Frappier,拉瓦勒，加拿大)上并容許部分風干。用在稀釋緩沖液(PBS_1%牛白蛋白-1%吐溫20，pH8.0)中的10%正常驢血清封閉30分鐘后，將所述載網(wǎng)在室溫浸沒在50 μ I的在稀釋緩沖液中稀釋1/25的SPl -特異性兔血清或對照兔抗-MBP血清(新英格蘭生物實驗室(New England BioLabs))中達2小時。將載網(wǎng)在PBS_1%吐溫20中洗滌3次并接著將其轉移到在稀釋緩沖液中稀釋1/30的50 μ I的12nm膠體金-親和純的驢抗兔-1gG(Jackson 免疫研究實驗室(Jackson ImmunoResearch Laboratories))中，并在室溫溫育I小時。用PBS-1%吐溫20洗滌3次，并用蒸餾水洗滌一次后，將細菌用1%磷鎢酸染色并用電子顯微鏡(菲利普(Philips)201)以60kV的加速電壓進行檢查。
[0173]免疫和保護研究。`在VIDO(薩斯卡通，加拿大)，根據(jù)加拿大動物管理委員會(Canadian Council on Animal Care)的“實驗動物管理和使用的指南”中提出的原則，使用由動物管理大學委員會(University Committee on Animal Care) (37)批準的方法,將豬用于進行免疫和保護測試。將來自畜群的平均重量8.23kg的無2型血清型豬鏈球菌的3周齡小豬隨機分為兩組，每組8只。以3周的間隔，用Iml的與30%的Emulsigen-Plus (MVP實驗室，Ralston, Nebr.)佐劑混合的100 μ g純化的SPI或作為對照的在生理鹽水中的30%Emulsigen-Plus,以3周間隔對豬進行肌內注射2次。第二次注射后11天,通過Iml (4.6x106CFU)的豬鏈球菌致病力強的菌株166的對數(shù)期培養(yǎng)物的氣霧劑攻擊免疫的和對照動物。所述菌株166已經(jīng)被證實是高度致病的(3)。在每次注射前，攻擊和實驗結束時收集血液樣品來確定抗體反應。在攻擊后10天，每天監(jiān)測豬的臨床體征，體溫和死亡率。通過尸體檢查研究所有的豬的宏觀病理學，并培養(yǎng)血液以監(jiān)測豬鏈球菌菌血癥的存在。
[0174]ELISA.通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)來測定免疫的小豬的血清SPl -特異性總 IgG 和 IgG 同種型(IgGl 和 IgG2)。在 4°C,將 Polysorb 板(Nunc-1mmunoplates，羅徹斯特，紐約，美國)用100 μ I/孔的純化的重組SPl，以在碳酸鹽緩沖液中0.3 μ g/ml的濃度包被過夜。用包含0.05%吐溫20的PBS (PBST)洗滌三次后，將板用在PBST中的5%的脫脂乳，于37°C進行封閉I小時。為了測定總的IgG，將來自對照和接種疫苗組的豬血清在PBST中稀釋1/5000并以100 μ I/孔，一式二份地加入適合的孔中。在37°C溫育I小時并洗滌3次后，通過在37 °C，用過氧化物酶綴合的山羊抗豬IgG(H+L)抗血清(Jackson免疫研究實驗室(Jackson Immuno Research Laboratories))溫育I小時來檢測結合的抗體。對于IgGl和IgG2檢測，將來自接種疫苗組的1/500稀釋的豬血清以100 μ I/孔加入。將小鼠抗豬IgGl或IgG2(Serotec, Kidlington,牛津，英國)用作一抗，并將過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠 IgG(H+L) (Serotec)用作二抗。用 TMB 底物(Zymed, S.San Francisco,美國)顯影所述板。在450nm，在ELISA閱讀器(Power Wave340，Bio-Tek儀器公司)上測量吸光度。將結果表示為平均值土S.D。用斯氏t檢驗確定統(tǒng)計學顯著性。
[0175] 核苷酸序列登記號將編碼豬鏈球菌的SPl蛋白的基因的序列顯示在圖2中并確定其 GenBank 登記號為 AY864331。
[0176]結果
[0177]鑒定spl基因。豬鏈球菌染色體文庫用入2々?11，從豬鏈球菌3735菌株進行構建，并使用來自豬鏈球菌2型血清型感染動物的恢復期豬血清進行篩選。選擇這樣的一個克隆進行進一步的表征，所述克隆表達具有表觀分子量(MW)IlOkDa的蛋白質，其對恢復期豬血清具有強烈反應性。將命名為PSS735的重組pBluescript質粒從噬菌體臂上切下，并將其示意性結構表示于圖1中。PSS735的6057-bp插入物的DNA序列分析顯示四個0RF。該基因簇見于具有相同結構的豬鏈球菌加拿大菌株89/1591 (NZ_AAFA00000000)和歐洲菌株P1/7(NC_004549)的部分測序的基因組中。ORFl和0RF2的推導的氨基酸序列顯示與糖基轉移酶具有50-80%范圍的同一性，0RF4的推導的氨基酸序列顯示與來自許多細菌種類的代謝物控制蛋白A具有50-75%范圍的同一性，所述許多細菌大多數(shù)屬于鏈球菌屬(Streptococcus)。0RF3編碼被命名為SPl的670個氨基酸的蛋白，具有預期的pI6.0和計算的分子量74.8kDa。將SPl的氨基酸序列與在可獲得的數(shù)據(jù)庫中的那些進行比較揭示與其它的蛋白沒有顯著的同源性。在pMal-p載體中的spl序列的亞克隆分析揭示SPl與恢復期豬血清強烈反應，證實SPl是免疫原性蛋白質。
[0178]SPl是新的豬鏈球菌C端錨定表面蛋白.2010bp的spl基因以ATG密碼子起始，以TAA密碼子終止，推定的SD序列(GAAAGGA)在所述ATG密碼子前，其位于起始密碼子上游IObp處(圖2)。預期的SPl氨基酸序列的分析揭示在N端的15個氨基酸的疏水核心和在Ala29和Gln3tl之間的推定的信號肽酶裂解位點。在蛋白質的羧基半部分中檢測到以3個氨基酸殘基間隔區(qū)分隔的具有強共有模式的27個氨基酸序列的10個重復序列。緊接重復區(qū)域的C端的是細胞壁相關區(qū)域，其跨越49個氨基酸殘基并且特征是高百分比的蘇氨酸殘基(20.4%)。緊隨這種富含蘇氨酸的區(qū)域之后的是許多革蘭氏陽性細菌的膜錨定表面蛋白典型的LPVTG共有基序。從膜錨定基序的C端4個氨基酸開始，鑒定了 16個氨基酸的第二疏水片段，其后是在蛋白質的C端末端的四個帶正電荷的氨基酸殘基(圖2)。
[0179]分析氨基酸組成揭示在Glu272和Thr63°之間不存在芳香族殘基的區(qū)域，其跨越所有的重復序列。此外，使用BLAST的保守結構域檢索鑒定了在Lys319到Val6tl1區(qū)域中的無毒結構域，其顯示與來自植物病原體水稻黃單胞菌(Xanthomonas oryzae pv.0ryzae)的AvrXa7無毒因子(41)具有20%同一性的相似性(圖3)。如果考慮保守的氨基酸替換，相似性為48%。
[0180]生產重組SPl.通過PCR擴增編碼成熟SPl蛋白質的序列并將其連接到IPTG-誘導的pMAL-p載體中。將得到的重組質粒在大腸桿菌XLl-Blue菌株中進行表達。如在圖4A中所顯示,誘導具有malE-spl融合基因的大腸桿菌重組體導致約150kDa的MBP-SPl融合蛋白的表達(泳道2)，其在非誘導的大腸桿菌細胞中不存在(泳道I)。所述融合蛋白大部分見于大腸桿菌細胞的細胞質(泳道3)。令人感興趣的是，完全將其中缺失特征是不存在芳香族殘基替換的重復區(qū)域的截短的MBP-SPl融合蛋白轉移到周質空間(數(shù)據(jù)未顯示)，說明該區(qū)域在某種程度上干擾MBP定位。
[0181]通過使用親和性基質直鏈淀粉柱并用麥芽糖洗脫來純化融合蛋白，并在SDS-PAGE上顯示約150kDa的單一蛋白質條帶(泳道4)。將純化的融合蛋白用因子Xa進行蛋白水解裂解，產生表觀分子量IlOkDa的成熟SPl和預期45kDa的MBP標記物(泳道5)。通過隨后用離子交換層析法純化，來獲得無MBP的成熟SPl，其純度通過SDS-PAGE估計為>95% (泳道6)。MBP-SPl融合蛋白和純化的重組SPl都在蛋白質印跡中顯示與用于起始篩選基因組文庫的恢復期豬血清的特異性反應性(圖4B)。通過N端蛋白質測序證實了純化的SPl的身份。用Bradford蛋白質測定法測量蛋白質濃度并將其調整為lmg/ml。
[0182]在豬鏈球菌中SPl的細胞表面表達。為了證實SPl在豬鏈球菌細胞表面上的定位，通過使用單特異性多克隆抗-SPl抗體，R44進行免疫電鏡術。發(fā)現(xiàn)免疫金顆粒均勻分布在豬鏈球菌S735菌株的表面上。這說明SPl蛋白在細胞表面上均質表達。將兔抗-MBP血清用作對照并且沒有顯示任何標記(圖5)。
[0183]在豬鏈球菌中的SPl的分布
[0184]為了評價SPl在豬鏈球菌不同血清型的參比菌株和2型血清型野生菌株中的保守性，將細菌的全細胞制備物進行蛋白質印跡，并通過SP-特異性抗體R44檢測。如在表1中所顯示，除了血清型13，16，20，22和24的菌株，R44與其它28種豬鏈球菌血清型反應，而來自不同地理起源的26個測試的2型分離株的25個與R44抗體反應。將來自其它鏈球菌物種的5個菌株用于證實SPl的 特異性并且沒有檢測到SPl蛋白。
[0185]SPl的免疫原性和針對用豬鏈球菌的攻擊對豬的保護。將每組8只小豬用以佐劑乳化的100 μ g的純化的重組SPl或僅有佐劑通過肌內免疫2次。用SPl免疫豬引發(fā)抗原特異性反應(圖6A)。從對照動物和免疫前的動物獲得的相應血清的分析清楚地顯示沒有SPl特異性抗體，因為僅記錄了背景ELISA值。僅在第一次注射后2周，SPl激發(fā)了明顯的IgG反應，其明顯地由強化免疫強化。評估IgG同種型證實了來自免疫的豬的血清包含IgGl和IgG2抗體(圖6B)。然而，IgGl反應比IgG2占優(yōu)勢，說明用SPl進行的接種主要誘導Th2-樣的免疫應答。用豬鏈球菌166菌株進行的豬的氣霧劑攻擊導致從攻擊后的第2天開始的臨床評分的穩(wěn)定增加并且接種疫苗沒有明顯的效果。如在表2中所總結，盡管與對照組相比，在接種疫苗組中更少的豬遭受關節(jié)炎，兩個組都顯示在攻擊后相似的癥狀。來自每組的三只豬死亡或在實驗結束前，由于高臨床評分被安樂死。在所有死亡的豬中發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌菌血癥并且在存活的豬中沒有檢測到。
[0186]討論
[0187]豬的第一次免疫激發(fā)快速的SPl特異性體液抗體反應，其可以明顯地用隨后的注射強化。然而，針對SPl的抗體沒有賦予針對使用豬鏈球菌菌株166的異型攻擊的免疫性。在抗體反應和保護之間的這種差異已經(jīng)在革蘭氏陽性細菌中的一些其它的表面抗原中報道，如鏈球菌纖連蛋白結合蛋白(Sfbl) (26)，肺炎球菌表面蛋白A(PspA) (27)，B組多糖(25)和馬鏈球菌(Streptocococcus equi)的M樣蛋白(SeM) (34)。為什么針對SPl的抗體沒有針對豬鏈球菌166攻擊的保護性的原因尚不清楚。在噬菌細胞殺死研究中，來自SPl免疫的豬的合并的血清的存在沒有促進豬嗜中性粒細胞殺死豬鏈球菌，說明抗體缺乏調理吞曬細胞(opsonophagocytic)的功能。主要由卩遼菌作用介導宿主針對由豬鏈球菌,一種高度被有莢膜的微生物導致的感染的保護(32)。因此，在 申請人:的常規(guī)接種疫苗模型中產生的總的IgG水平可能不足以反映能夠引發(fā)白細胞效應子功能的保護性抗體的存在。為了進一步舉例說明由SPl引發(fā)的免疫應答類型，評估在免疫的血清中的IgG同種型。IgGl水平一直高于IgG2水平，說明誘導了 Th2-樣反應。盡管"Thl/Th2"平衡的概念尚沒有像在一些其它物種中一樣，在豬中有充分文獻記載，最近的證據(jù)顯示豬IgG2比IgGl具有更大的補體激活能力(6)。
[0188]在該研究中，將Emulsigen-Plus用作佐劑，因為據(jù)信其能夠在接種位點產生抗原長效制劑，從所述抗原長效制劑抗原緩慢釋放并且因此提供延長的對免疫系統(tǒng)的刺激(23，37)。然而,最近的證據(jù)顯示與單獨的Emulsigen —起配制的疫苗主要引發(fā)IgGl反應’而Thl類型的免疫應答非常弱(19，28)。來自使用其它革蘭氏陽性細菌的表面抗原進行的接種疫苗的證據(jù)已經(jīng)證實調理吞噬細胞的效率可以通過使用Thl定向的佐劑，如CpG和白介素-12(IL-12)而大大增強(4，22，24)。這些佐劑促進Thl-型免疫應答，其特征在于調理抗體，特別是IgG2同種型的增加的產生。此外，增加的抗體介導的調理作用明顯地反映在保護中(2,40)。
[0189]總而言之，SPl是一種豬鏈球菌新的C端錨定表面蛋白質，如通過分析分子特征和電鏡所證實的。在小豬中，用重組SPl接種疫苗激發(fā)顯著的體液抗體應答，以及恢復期豬血清存在高滴度的針對該蛋白的抗體的事實，說明SPl是豬鏈球菌的暴露的抗原。與其在不同豬鏈球菌的血清型中的廣泛分布綜合考慮，這些發(fā)現(xiàn)使SPl成為在開發(fā)亞單位疫苗中考慮的候選物。SPl作為疫苗候選物的可能性將在下面的實施例中得到證實。
[0190]實施例2`
[0191]重組SPl保護小鼠免于豬鏈球菌攻擊的感染
[0192]該研究評估SPl重組蛋白作為亞單位疫苗候選物在具有修飾的免疫途徑和佐劑的小鼠模型中是否具有保護性。
[0193]實驗方法:
[0194]將小鼠(CDl)隨機分成兩組，每組10只，并且用20 μ g的與作為佐劑的20 μ g QuilA混合的純化的SPl或僅作為對照的20 μ g Quil A,以2周間隔皮下免疫兩次(表1)。第二次接種后的10天，將動物用IxlO8CFU豬鏈球菌致病力強的菌株(31533)進行1.p.攻擊。每天監(jiān)測小鼠2次，監(jiān)測其臨床體征和死亡率直到感染后的第14天。在每次接種疫苗和攻擊前收集血液樣品來測定抗體反應。
[0195]結果:在初始免疫后，用SPl接種疫苗激發(fā)小鼠中的顯著的體液IgG反應(平均滴度3xl04)，并且強化注射明顯增加抗體滴度(1.SxlO6)。與此相反，在對照組的血清中的SPl-特異性的IgG在不可檢測的水平(圖1)。此外，所有的四個IgG亞類在SPl -免疫的小鼠中得到誘導，其中IgG2a滴度是最高的(1.75xl06)，其次是IgGl (1.2xl06)，IgG2b(7.25x10s)和IgG3(3.7xl04)(圖2)。SPl誘導的抗體的特異性通過蛋白質印跡得到證實，其中從SPl-免疫的小鼠收集的合并的血清可以識別豬鏈球菌S735和31533細胞制備物中純化的SPl和SPl蛋白。
[0196]施用攻擊感染后16小時，在對照組中的所有小鼠開始顯示臨床體征(敗血癥)，如皺褶的毛皮(顯示發(fā)燒)，和對刺激反應緩慢。從攻擊后第4天開始，在該組中的10只小鼠中的8只連續(xù)出現(xiàn)嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀(腦膜炎)如轉圈跑和角弓反張。所有的8只生病小鼠死亡，或由于嚴重的病癥不得不安樂死。與此相反，在SPl接種的組中的10只小鼠中除了 6只具有短暫的臨床體征如在攻擊后16-40小時輕微毛躁的毛和勉強活動，在該組中的所有小鼠在觀察階段仍保持健康(圖3和4)。
[0197]討論和結論:在小鼠和豬模型中觀察到的保護的差異通過在小鼠接種疫苗模型中激發(fā)的充分平衡的IgG亞類水平，尤其是非常高的IgG2a滴度進行解釋。在鼠抗體同種型中，IgG2a顯示在激活白細胞的調理吞噬細胞功能中是最有效的(2，42，43))。此外，豬鏈球菌，這種被有莢膜的細菌通過調理吞噬細胞作用被最有效地清除。因此，可能占優(yōu)勢的IgG2產生對觀察到的保護貢獻最大。但是，這些數(shù)據(jù)說明通過使用Thl誘導性佐劑如QuilA，用SPl免疫小鼠可以誘導有效的抗原特異性反應，并且保護小鼠免于致死劑量的致病力強的豬鏈球菌菌株的攻擊感染，并導致完全的保護來免于豬鏈球菌引起的死亡(圖4)。
[0198]實施例3
[0199]鑒定編碼具有IgG-結合活性和保護能力的豬鏈球菌蛋白的新基因
[0200]在 申請人:持續(xù)的了解豬鏈球菌的病理機制和探索其可能用于開發(fā)可靠的診斷試劑或疫苗的可能性努力中，從豬鏈球菌2型血清型的致病力強的菌株中鑒定了一種顯示IgG結合活性的新蛋白。這種被命名為SP2的表觀分子量58-kDa的蛋白包含23個氨基酸的可裂解N端信號序列和靠近N端的賴氨酸M基序，以及在C端部分的每個13個氨基酸的6個相同的重復序列。SP2在不同的豬鏈球菌血清型中是高度保守的，如通過SP2基因的PCR擴增所證實的。重組SP2與從被2型豬鏈球菌臨床感染的豬中收集的恢復期豬血清強烈反應。用純化的重組SP2免疫小鼠激發(fā)顯著的抗體反應，其賦予針對用致病力強的豬鏈球菌菌株引起的攻擊感染的部分保護。
[0201]這些結果顯示SP2是一種對于豬鏈球菌感染的可能的診斷劑和疫苗候選物。
[0202]實驗方法和結果
[0203]鑒定SP2基因.通過篩選構建的2型血清型豬鏈球菌基因組文庫鑒定陽性噬菌體，其通過非免疫機制與不同種類和類別的Ig (豬IgG，人IgG和IgA)反應。DNA插入物的序列揭示這樣的6.3kb的插入物，其包含分別編碼脫氫酶，SP2和葡聚糖糖苷酶(44)的三個ORFs(圖12)。這種基因簇見于具有相同結構的豬鏈球菌加拿大菌株89/1591 (NZ_AAFA00000000)和歐洲菌株Pl/7 (NC_004549)的部分測序的基因組中。與一些鏈球菌蛋白質具有相似性的所述SP2氨基酸序列通常顯示Ig結合活性。觀察到與肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)的保守假定的蛋白(AAL00677)在395個氨基酸的序列中的45%的同一性。與釀胺鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的推定的42kDa蛋白(AAK33481)(在388個氨基酸序列中的45%的同一性)和與B組鏈球菌表面免疫原蛋白(AAG18474)(434個氨基酸序列中的40%的同一性)發(fā)現(xiàn)具有其它的同源性(60)。
[0204]SP2蛋白的表征
[0205]1158bp SP2基因編碼386-aa SP2蛋白，其理論pi為4.40，分子量為42.5kDa。這種蛋白富含纈氨酸(15%)，谷氨酸(10%)和丙氨酸(9%)。 SP2的電荷分布分析揭示在N端存在一個帶正電荷的簇(K2 - K26)，和在蛋白質中部存在一個帶負電荷的簇(D168-E242)(圖13)。帶正電荷的簇隨后是23個氨基酸的推定的信號序列。SP2的氨基酸序列在位置71-109包含LysM(賴氨酸)基序。這種LysM結構域見于涉及細菌細胞壁降解的許多酶中，并且具有通常的肽聚糖結合功能，說明SP2是豬鏈球菌的表面蛋白。因此，SP2的N端構造提出這樣的可能性，即帶正電荷的簇在細胞質中保留作為暫時的終止子(stop)的功能并且通過裂解信號序列輔助形成成熟SP2和通過結合LysM結構域到肽聚糖上輔助將SP2定位到細菌表面。此外，在SP2的中部鑒定13個氨基酸的6個相同的重復序列(圖13)。
[0206]SP2基因在不同豬鏈球菌血清型中的分布
[0207]為了評價SP2的保守水平，使用覆蓋全長SP2基因的引物進行PCR。如下進行PCR，其中在94°C起始變性5分鐘，隨后在94°C I分鐘，在52°C I分鐘，在72°C 2分鐘，進行30個循環(huán)，最后在72°C延伸10分鐘。
[0208]用于分布在不同血清型中SP2的正向和反向引物分別是:
[0209](5，-TTTAAAAGAACGGTTGAAGGC-3’ ;SEQ ID NO:15)
[0210]和5’-GCATAAGCTGCCACTTGATCT-3’ ;SEQ ID NO:16)。
[0211]從33個血清型參比菌株的31個中擴增了具有一些大小變化的SP2基因(圖14)。選擇的變體片段的序列分析顯示SP2基因的重復序列的數(shù)量是大小變化的原因。
[0212]生產和純化重組SP2
[0213]從豬鏈球菌S735染色體進行PCR來產生編碼成熟SP2的基因，并將其亞克隆到pET32+載體(新英格蘭生物實 驗室(New England BioLabs))中。按照生產商的推薦,通過用Genepulse II儀器(Bio-Rad)進行電穿孔將所述構建體用于轉化大腸桿菌DE3菌株。為了過度表達，培養(yǎng)物從其起始0D_被調整為0.1的過夜培養(yǎng)物進行接種。將培養(yǎng)物進行溫育，伴隨攪拌直到OD6tltl為約0.8，并接著加入IPTG (0.5mM)以誘導生產Trx-His-SP2融合蛋白。2小時的誘導后，制備細菌細胞質并將其用于純化SP2蛋白。
[0214]通過使用Ni+柱(阿莫仙藥物生物科技(Amersham Pharmacia Biotech), Baied’Urfee,加拿大)的親和層析法從細胞質中純化Trx_His_SP2融合蛋白。用0.45 μ m膜過濾細胞質并經(jīng)過柱。用在結合緩沖液中的500mM咪唑洗脫融合蛋白并且通過SDS-PAGE確定包含蛋白質的級分。通過0.001%(w/w)的腸激酶(新英格蘭生物實驗室(New EnglandBioLabs))裂解純化的融合蛋白，產生表觀分子量58kDa SP2和預期20kDa Trx-His標記物(圖15),接著將其應用到mono-Q柱上(阿莫仙藥物生物科技(Amersham PharmaciaBiotech) ,Baie d' Urfee,加拿大)。通過使用線性NaCl梯度,從柱上洗脫獲得無Trx-His標記物的重組SP2，估計其的純度大于95%，如通過SDS-PAGE所觀察到的(圖15)。根據(jù)生產商的說明書，用Bio-Rad蛋白測試試劑盒(Bio-Rad)確定蛋白質濃度。通過N端蛋白質測序證實純化的SP2的身份。
[0215]SP2是豬鏈球菌的免疫原性蛋白質并且顯示IgG結合活性
[0216]通過用100 μ g的以0.5ml弗氏不完全佐劑乳化的重組SP2蛋白肌內免疫新西蘭白兔產生SP2-特異性抗體。所述兔用相同劑量的SP2以2周間隔受到兩次強化注射，并且接著在最后一次強化免疫后10天采血。在蛋白質印跡中，所述SP2特異性抗體相反地識別豬鏈球菌細胞制備物中的SP2 (圖16a)。此外，重組SP2與恢復期豬血清反應(圖16b)，證實抗-SP2抗體存在于被豬鏈球菌臨床感染的豬血清中。[0217]重組SP2與人和豬IgG的結合活性在圖16c和16d中得到證實。
[0218]重組SP2部分保護小鼠免于豬鏈球菌攻擊感染。
[0219]將小鼠(CDl)隨機分成兩組，I組11只(接種組)，I組10只(對照組)，并且用50 μ g的與作為Thl誘導佐劑的20 μ g Quil A混合的純化的SP2或僅作為對照的20 μ gQuil A，以2周間隔皮下免疫兩次。第二次接種后的10天，將動物用IxlO8CFU豬鏈球菌致病力強的菌株(31533)進行1.p.攻擊。每天監(jiān)測小鼠2次，監(jiān)測其臨床體征和死亡率直到感染后的第14天。在每次接種疫苗和攻擊前收集血液樣品來測定抗體反應。
[0220]用SP2接種疫苗在小鼠中激發(fā)明顯的體液IgG反應。與此相反，在對照組的血清中SP2-特異性IgG在不可檢測的水平(圖17)。兩個組都顯示敗血癥和腦膜炎的臨床體征，然而，與對照組相比，SP2接種組的臨床評分更高(圖18)。在SP2接種組中，11只小鼠中的4只死亡或由于嚴重的疾病不得不被安樂死(存活率=64%)。與此相反，在對照組中的10只小鼠中有8只死亡(存活率=20%)(圖19)。這些結果顯示SP2保護小鼠免于豬鏈球菌攻擊感染。
[0221]結論
[0222]SP2是一種新的描述的豬鏈球菌免疫原性蛋白，其與其它已知的序列相同性極少?；謴推谪i血清顯示針對該蛋白的抗體，證實SP2是在豬鏈球菌感染過程中表達的有效的抗原。這些發(fā)現(xiàn)，和其在不同豬鏈球菌血清型中的廣泛分布使SP2成為開發(fā)診斷試劑時考慮的候選物。由于用重組SP2接種小鼠得到保護，因此清楚的是SP2是針對豬鏈球菌感染的有潛力的疫苗候選物。
[0223]實施例4`[0224]用實驗性豬鏈球菌疫苗對小豬免疫的效果
[0225]該研究評估了重組Sao蛋白對小豬中豬鏈球菌2型血清型攻擊感染的保護效果。
[0226]材料和方法
[0227]動物，指定治療和排除標準:
[0228]使用來自無豬鏈球菌疾病畜群(H&M Fast Farms Inc.)而且以前沒有針對豬鏈球菌接種過疫苗的總共24只的雜交小豬。將所述豬從出生就成群(at the herd of origin)飼養(yǎng)在商業(yè)條件下，直到它們在23.5天齡，平均重量為7.79kg時斷奶。將豬以控制的溫度(27-30°C )和通風條件下圈養(yǎng)在乙烯基覆蓋的金屬地板上，并通過乳頭狀飲水器給其提供水，使其自由取食商業(yè)制備的，營養(yǎng)均衡的，無抗生素的食物。在研究開始前，由獸醫(yī)檢查豬。所有的豬是健康的。斷奶時，將小豬隨機分成兩組，體重均衡。
[0229]組1:在 ImL 鹽水中的 200 μ g Sao 和 400 μ g Quil A
[0230]組2:在ImL鹽水中的400 μ g Qui I A (對照)
[0231]將接受了不希望的治療或患了不相關疾病的任何動物排除在分析之外。
[0232]接種疫苗和攻擊:
[0233]所有的豬以2周間隔以ImlIM接種疫苗2次。在每次注射和攻擊如收集血液樣品。這些處理的結果沒有導致任何不利事件。
[0234]第二次接種疫苗后的2周，用氟烷麻醉豬，并用Iml豬鏈球菌166的混懸液的氣霧劑攻擊豬。將來自對數(shù)期培養(yǎng)物的細菌培養(yǎng)在過濾滅菌的Todd-Hewitt酵母肉湯鏈球菌培養(yǎng)基中到OD62tl為0.8并在鹽水(0.85%NaCl)中稀釋1:100。隨后測量施用給豬的細菌濃度是 6.8xl06CFU/mlo
[0235]臨床觀察
[0236]由獸醫(yī)或經(jīng)過訓練的動物管理技術員每天一次地臨床評估豬，并在攻擊后10天的每天早晨指定臨床評分的過程中測量其體溫。每天的臨床評分(0-4)作為對每只動物的姿勢和運動性評分的總合，其基于神經(jīng)、肌骨骼或呼吸系統(tǒng)疾病的體征進行如下:
[0237]姿勢:
[0238]0=正常的姿勢和對刺激反應
[0239]1=不活躍并且反應緩慢；眼鼻有分泌物
[0240]2=僅對重復的刺激有反應，情感淡漠
[0241]3=不活動，無反應，對環(huán)境沒有意識
[0242]4=死亡
[0243]運動件:
[0244]0=正常步態(tài)和體位
[0245]1=輕微共濟失調(slight in coordination),跋，和/或關節(jié)腫脹但是沒有輔助可以站起
[0246]2=明顯不協(xié)調或跛但 是沒有輔助可以站起
[0247]3=嚴重的跛，嚴重的共濟失調，不能保持站立
[0248]4=死亡
[0249]通過致死注射來安樂死其臨床評分超過2的任一等級的豬。將直腸溫度等于或大于40.6°C并且臨床評分大于O的豬，以及死亡的那些豬記錄為在當天有病態(tài)。將在第9天在實驗結束前死亡或被安樂死的豬記錄為死亡以評價治療對死亡率的影響。關于動物進行判斷，評估疾病的臨床體征或進行實驗室測定的所有個體對治療的本身情況是不知情的。
[0250]血液(Haemotologic)情況:
[0251]通過靜脈穿刺獲得肝素處理的血液樣品來進行豬鏈球菌菌血癥的檢測(通過在攻擊后O和3天以及尸體解剖時培養(yǎng))。
[0252]抗體滴度:
[0253]通過ELISA測定血清中的Sao-特異性總IgG和IgG亞類(IgGl和IgG2)的滴度。將背景扣除后導致0D450讀數(shù)為0.1的血清稀釋度認為是該血清的滴度。
[0254]尸體檢查
[0255]將所有的豬進行尸體檢查并且培養(yǎng)下列組織的細菌:小腦拭子，氣管支氣管淋巴結，關節(jié)拭子(如果病灶存在，受影響的關節(jié)；或后膝關節(jié))，和血液。將復蘇的豬鏈球菌細菌的數(shù)量以從0-4的順序等級(大約是1gltl菌落數(shù)量)記錄。此外，通過視覺檢查評估肺涉及的程度(百分比)。
[0256]統(tǒng)計分析
[0257]使用列聯(lián)表分析和似然比Fisher精確概率測試(Likelihood-Ratio FisherExact Test)確定兩個組在指定數(shù)據(jù)(死亡率，在組織中豬鏈球菌的存在或不存在，生病的天數(shù)或健康的天數(shù))之間的差異的顯著性。在順序數(shù)據(jù)(臨床評分)上兩組之間的差異的顯著性通過等級評定轉化并通過t-檢驗確定。通過使用對數(shù)等級(1grank)測試(等價于Mantel-Haenszel測試)進行存活分析來確定存活曲線中兩組之間的差異的顯著性。使用t-檢驗(如果需要，在適當?shù)霓D化為標準值之后)確定在連續(xù)的數(shù)據(jù)(在攻擊后存活的時間長短，體溫，1g2CFUAil血液)上在組之間差異的顯著性。
[0258]結果
[0259]排除的動物:
[0260]因為持續(xù)惡化的直腸脫垂，將一只豬在攻擊后第5天人道處死。將該豬排除在分析之外。
[0261]臨床觀察:
[0262]1.對免疫的反應:沒有可歸因于接種的不尋常的反應。
[0263]2.體溫:通過t_檢驗分析體溫數(shù)據(jù)，顯示在兩組之間沒有顯著的差異(p>0.05)。通常，接種的豬傾向于具有更低的溫度(圖20)。
[0264]3.臨床疾病:“臨床評分”是對疾病的量的測量并結合死亡率和發(fā)病率。使用Mann-Whitney分析來比較兩組的疫苗對臨床評分的作用，并且在接種組中的臨床疾病顯著少于對照組的臨床疾病(P=0.024)(圖21)。
[0265]4.在豬鏈球菌攻擊后豬的存活:存活率分別在接種組中是82%，而在對照組中是42%。使用兩個數(shù)據(jù)組比較存活曲線，顯示接種的豬的存活時間比對照的存活時間明顯更長(ρ=0.048)(圖 22)。
[0266]細菌學
[0267]1.菌血癥:在攻擊`前，在小豬的血液中沒有檢測到細菌(ND)。在攻擊和尸體檢查后，在兩組之間菌血癥豬沒有明顯不同。然而，接種的豬具有更少的菌血癥(表3)。
[0268]2.感染尸體檢查:進行來自被攻擊的所有豬的腦，氣管支氣管淋巴結和關節(jié)的樣品的微生物培養(yǎng)以監(jiān)測感染的水平。將其中復蘇具有攻擊菌株的菌落典型形態(tài)特征的細菌的組織的數(shù)量顯示在表4中。關于接種組對中位值細菌學評分(對于每只豬的所有組織的評分的總和的中位值)影響的Wilcoxon秩和檢驗(Wilcoxon Rank Sum test),顯示該差異是顯者的(p=0.007) ο
[0269]病理學(尸體解剖)
[0270]僅在6只豬中(2只在接種組中并且4只在對照組中)檢測到關節(jié)炎或肺炎的病理損害。其它的死亡或安樂死的豬沒有顯著的病理體征。豬鏈球菌感染的一個特征是急性感染可以是致死的，而沒有可評估的顯著的病理學體征。氣管支氣管淋巴結增大。在腸系膜上存在痕量的血纖蛋白，顯示輕度的腹膜炎。在兩個后膝關節(jié)中存在關節(jié)炎的跡象，其中存在少量的膿性物質，在左肩有關節(jié)炎的跡象，其中存在痕量的膿性流出物。
[0271]抗體反應
[0272]在初始免疫后，用Sao組合Quil A免疫豬激發(fā)顯著的體液IgG反應，并且強化注射明顯增加抗體滴度(圖23)。此外，當誘導IgGl和IgG2亞類時，在第二次接種后2周，IgG2滴度比IgGl更占優(yōu)勢，如在血清中所測量的(圖24)。
[0273]總結和討論
[0274]顯示所述疫苗是安全的，因為接種2次的豬沒有顯示任何有害的反應。用Sao組合Quil A免疫豬激發(fā)顯著的IgG滴度，其中以IgG2產生占優(yōu)勢，說明其中主要是Thl-型免疫應答。豬的氣霧劑攻擊導致的疾病造成的總死亡率約是對照的58%。攻擊后接種的豬的存活明顯好于對照(p〈0.05)。攻擊后每組中有一些豬開始生病，在接種的豬中病情明顯更輕(更低的臨床評分)。接種對總的尸體解剖檢查的病理學的發(fā)生沒有明顯影響，然而急性鏈球菌敗血病在沒有可評估的總病理學體征的情況下也可以是致命的。在死后，與對照豬相比，從接種的豬中復蘇了更少的豬鏈球菌細菌(p〈0.01)。
[0275] 實施例5
[0276]用片段SPlA免疫小鼠和小豬
[0277]免疫小鼠
[0278]使用弗氏不完全佐劑，用40 μ g的純化的SPlA-麥芽糖-結合蛋白(MBP)融合蛋白，20 μ g的MBP或僅PBS將每組10只的三組小鼠通過腹膜內免疫2次(第I天和第17天)。在每次免疫前或第二次注射后10天獲得血清，并將其1:5000稀釋進行ELISA測定(見表5)。
[0279]免疫豬
[0280]使用Emulsigen作為佐劑，用200 μ g的純化SP1A-MBP融合蛋白，100 μ g的MBP或僅PBS將每組3只豬的三個組通過肌內免疫2次(第I天和第17天)。在每次免疫前或第二次注射后10天獲得血清，并將其1:5000稀釋以進行ELISA測定(見表6)。
[0281]表1.由SPl -特異性抗體R44檢測的SPl在豬鏈球菌參比菌株，2型血清型的分
離株和其它在蛋白質印跡中生物中的分布
[0282]
【權利要求】
1.一種能夠激發(fā)IgG免疫應答的分離的SPl多肽，其包含與SEQ ID NO: 17或SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。
2.權利要求1的分離的SPl多肽，其包含與SEQID NO: 17所示的氨基酸序列具有至少.95%同一'丨生的氨基酸序列。
3.權利要求1的分離的SPl多肽，其包含與SEQID NO:4所示的氨基酸序列具有至少.95%同一'丨生的氨基酸序列。
4.權利要求1的分離的SPl多肽，其包含與SEQID NO: 17所示的氨基酸序列具有100%同一性的氨基酸序列。
5.權利要求1的分離的SPl多肽，其包含與SEQID NO:4所示的氨基酸序列具有100%同一性的氨基酸序列。
6.一種能夠激發(fā)IgG免疫應答的分離的SPl多肽，其包含與SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有95%同一性的氨基酸序列。
7.權利要求6的分離的SPl多肽，其包含與SEQID NO: 2所示的氨基酸序列具有100%同一性的氨基酸序列。
8.—種能夠激發(fā)IgG免疫應答的分離的SPl多肽，其包含與SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有95%同一性的氨基酸序列。
9.權利要求8的分離的SPl多肽，其包含與SEQID NO: 3所示的氨基酸序列具有100%同一性的氨基酸序列。
10.權利要求1的分離的SPl多肽，其中當施用于動物時，其激發(fā)針對豬鏈球菌(Streptococcus suis)菌株攻擊的保護性反應。
11.一種分離的多核苷酸，其編碼如權利要求1-10任一項所定義的多肽。
12.權利要求11的分離的多核苷酸，其包含與SEQID NO: 18所示的序列具有95%同一性的核苷酸序列。
13.權利要求11的分離的多核苷酸，其包含與SEQID NO:8所示序列具有95%同一性的核苷酸序列。
14.一種抗體，其特異性結合如權利要求1-10任一項所定義的多肽。
15.—種載體,其包含如權利要求11所定義的多核苷酸。
16.—種載體,其包含如權利要求12所定義的多核苷酸。
17.—種載體,其包含如權利要求13所定義的多核苷酸。
18.一種用于預防或治療豬鏈球菌相關疾病或由豬鏈球菌導致的感染的組合物，其包含可接受的載體和下列的至少一種： 如權利要求ι-?ο任一項所定義的分離的多肽； 如權利要求11所定義的分離的多核苷酸； 如權利要求14所定義的抗體；或 如權利要求15、16或17所定義的載體。
19.權利要求18的組合物，其還包含佐劑。
20.下列至少一種用于制備藥物的應用，所述藥物用于在動物中治療和/或預防豬鏈球菌相關疾病或感染： 如權利要求1-10任一項所定義的分離的多肽；如權利要求11所定義的分離的多核苷酸； 如權利要求14所定義的抗體； 如權利要求15、16或17所定義的載體；或 權利要求18或19所定義的組合物。
21.一種用于檢測指示豬鏈球菌菌株的抗體的存在或不存在的診斷試劑盒，所述試劑盒包括： -如權利要求1-10任一項所定義的分離的多肽； -檢測多肽-抗體免疫復合物的試劑； -缺乏與所述肽免疫性結合的抗體的生物參比樣品；和 -包含可以特異性結合于所述肽的抗體的比較樣品； 其中所述分離的多肽、試劑、生物參比樣品和比較樣品以足以進行所述檢測的量存在。
22.一種用于檢測指示豬鏈球菌菌株的存在或不存在的診斷試劑盒，其包括： -如權利要求14所定義的抗體； -檢測多肽-抗體免疫復合物的試劑； -與所述抗體免疫結合的生物參比樣品多肽；和 -包含可以與所述肽特異性結合的多肽的比較樣品； 其中所述抗體、試劑、生物參比樣品和比較樣品以足以進行所述檢測的量存在。
【文檔編號】C12N15/31GK103483431SQ201310291430
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2006年9月1日 優(yōu)先權日:2005年9月2日
【發(fā)明者】喬斯·哈雷爾, 馬塞洛·戈特沙爾克, 李元義 申請人:蒙特利爾大學