一株農(nóng)業(yè)秸稈降解真菌草酸青霉njgz-2及其菌劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株能降解農(nóng)業(yè)廢棄物秸稈的常溫真菌NJGZ-2，屬于農(nóng)業(yè)廢棄物資源利用技術(shù)。該菌株NJGZ-2分類命名為：草酸青霉，菌種保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC?NO.7527。試驗表明，水稻秸稈接種孢子(1％的107孢子/mL)懸液后，30℃條件下170r/min液體發(fā)酵培養(yǎng)7d，水稻秸稈的失重率分別為59.7％。發(fā)酵粗酶提取液，其內(nèi)切酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶活及總纖維素酶活性分別為113.3U/gds、11.6U/gds、1439.7U/gds、2.0U/gds和13.8U/gds。粗酶液能水解低濃度堿處理的玉米芯產(chǎn)生高濃度的還原糖(962.2mg還原糖/g底物)，本發(fā)明是利用微生物發(fā)酵技術(shù)降解農(nóng)業(yè)廢棄秸稈使其轉(zhuǎn)化為有機肥料，可以變廢為寶、保護環(huán)境，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】一株農(nóng)業(yè)秸稈降解真菌草酸青霉NJGZ-2及其菌劑
一、【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株農(nóng)業(yè)秸桿降解真菌及其菌劑，屬于農(nóng)業(yè)集約化生產(chǎn)技術(shù)，專用于降解廢棄秸桿生產(chǎn)有機肥料，實現(xiàn)有機廢棄物資源化。
二、【背景技術(shù)】
[0002]我國是一個農(nóng)業(yè)大國，如何處理農(nóng)作物秸桿是大多數(shù)農(nóng)區(qū)面臨的一個難題，大量的廢棄秸桿若不及時處理，不僅影響正常耕作，而且也成了病蟲害繁殖的場所；如把其付之一炬，不僅嚴(yán)重污染環(huán)境，同時也浪費了秸桿中所含的有用資源和能源。利用秸桿降解菌處理廢棄秸桿，具有環(huán)保、節(jié)能、高效等特點，符合可持續(xù)發(fā)展的要求。農(nóng)業(yè)廢棄秸桿是一種十分寶貴的農(nóng)業(yè)資源，含有豐富的有機碳和大量的氮、磷、鉀、硅等礦質(zhì)營養(yǎng)元素以及微量元素，合理利用這種資源是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一項重要任務(wù)。然而，秸桿中含有大量的木質(zhì)素和纖維素，不易腐爛，因此不宜就地進行還田處理，也不適用于作飼料。于是，絕大部分秸桿都作為廢棄物被丟棄或被焚燒，不同程度地污染了當(dāng)?shù)氐纳钌a(chǎn)環(huán)境，也造成了寶貴資源的浪費。
[0003]大量的研究表明，秸桿還田能夠有效增加土壤有機質(zhì)含量，改良土壤，培肥地力，對于緩解中國土壤氮、磷、鉀肥比例失調(diào)的矛盾具有十分重要的意義。但由于中國人口多耕地少，耕地復(fù)種指數(shù)高，倒茬時間短，加之秸桿碳氮比值高，給秸桿還田帶來困難，且效果較差。因此通過秸桿處理將其制成有機肥，是一項能源環(huán)保雙贏的技術(shù)。秸桿的資源化處理包括有物理法、化學(xué)法和生物法，而前兩類方法處理成本高，且易造成二次污染，因此目前大多采用微生物處理法。微生物處理法就是把秸桿通過添加特定的秸桿分解菌劑，在田間常溫的條件下，加速秸桿的腐解和轉(zhuǎn)化。秸桿資源通過微生物分泌的細(xì)胞壁降解相關(guān)酶的分解成葡萄糖、木糖、纖維二糖、可溶性的寡糖，是大多數(shù)生物優(yōu)先利用的碳源營養(yǎng)物質(zhì)而被直接高效地轉(zhuǎn)化利用。 因此，利用纖維素分解菌劑建立新型的生物秸桿還田技術(shù)將成為解決大量秸桿資源的一條重要途徑。
[0004]通過接種秸桿降解菌劑，加快底物中木質(zhì)纖維類物質(zhì)的分解，真菌產(chǎn)生的胞外纖維素分解酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素分解酶活性。若能篩選到相應(yīng)的高效功能菌株，將其用于廢棄秸桿的降解和肥料生產(chǎn)，將會有很好的應(yīng)用前景。
三、
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]1.技術(shù)問題
[0006]本發(fā)明的目的在于篩選一株能夠高效分解農(nóng)業(yè)廢棄秸桿的常溫真菌草酸青霉，其能高效分解農(nóng)業(yè)廢棄秸桿，使得農(nóng)田中的廢棄秸桿資源化，確?？沙掷m(xù)農(nóng)業(yè)的順利發(fā)展。
[0007]2.技術(shù)方案
[0008]—株能降解稻桿的常溫真菌，該真菌NJGZ-2屬于草酸青霉(Penici 11 iumoxalicum)，2013年4月27日寄存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址是:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院，中國科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏號為CGMCC N0.7527 ;其生物學(xué)特性為，在PDA平板上，初期菌落中間呈淺白色、輪廓規(guī)則，外觀呈絨毛狀。菌絲細(xì)胞絲狀交織，具橫隔；分生孢子梗不具足細(xì)胞，帚狀枝為對稱雙輪型，瓶梗細(xì)長漸變尖銳；分生孢子橢圓形，呈藍(lán)綠色。采用真菌通用引物ITSl和ITS4進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物連接pMD_19T載體后測序,所得序列經(jīng)NCBI比對,與Penicillium oxalicumstrain als2_d38有99%的相似度。選取和它相近的一些菌株繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹，以及結(jié)合菌落和菌絲形態(tài)學(xué)特征，鑒定該菌株為草酸青霉。
[0009]NJGZ-2能在CMC-剛果紅培養(yǎng)基上生長并產(chǎn)生透明的水解圈。CMC-剛果紅培養(yǎng)基配方為:羧甲基纖維素鈉(CMC-Na) 10g, (NH4) 2S042g, KH2PO4Ig, MgSO4.7Η200.5g，剛果紅
0.2g，瓊脂 20g，水 1000mL，12rC高壓滅菌 20min。 [0010]秸桿降解菌NJGZ-2孢子懸液(菌劑)的制備方法為:
[0011]液體培養(yǎng)基的配制:烘干粉碎后的水稻秸桿粉末20g，(NH4)2SO4L 4g，KH2P042g,MgSO4.7Η200.3g, CaCl20.4g,胰蛋白胨 lg, FeSO4.7Η200.0075g ；MnSO4.H2O0.0025g ；ZnSO40.002g, CoCl20.003g，水 1000mL, 121 °C 高壓滅菌 20min ；
[0012]水稻秸桿粉培養(yǎng)基配方為:烘干粉碎后的水稻秸桿粉末10g，KH2P43.0g ；NaN0s3.0g ；CaCl20.5g ；MgS04.7H200.5g, FeSO4.7H200.0075g, MnSO4.H2O0.0025g,ZnSO40.002g, CoCl20.003g，瓊脂 20g，水 1000mL, 121 °C 高壓滅菌 20min ；
[0013]液體培養(yǎng)基的配制:烘干粉碎后的水稻秸桿粉末20g，(NH4)2SO4L 4g，KH2P042g,MgSO4.7Η200.3g, CaCl20.4g,胰蛋白胨 lg, FeSO4.7Η200.0075g, MnSO4.H2O0.0025g,ZnSO40.002g, CoCl20.003g，水 1000mL, 121 °C 高壓滅菌 20min ；
[0014]將菌株NJGZ-2接種至裝有50mL秸桿粉培養(yǎng)基的三角瓶中，30°C條件下靜止培養(yǎng)7d，加30mL無菌水去三角瓶中，放在搖床上震蕩30min，用紗布過濾培養(yǎng)物后即為孢子懸液菌劑。按I %的接種量接種于液體培養(yǎng)基中，30°C條件下，以170r/min培養(yǎng)6d，離心過濾除去菌體和雜質(zhì)，得到粗酶液。
[0015]酶解秸桿反應(yīng)體系:0.5g秸桿粉末，20mL粗酶液(pH5.0)，于50mL的帶螺口帽的離心管中，50°C，200r/min，水解72小時。
[0016]所用的秸桿粉末指的是粉碎后過40目篩，含水量10%以下。
[0017]上述孢子懸液菌劑可用于降解農(nóng)業(yè)廢棄秸桿。
[0018]3.有益效果
[0019]該菌株在CMC-剛果紅培養(yǎng)基上可產(chǎn)生水解圈(圖1)，可以在農(nóng)業(yè)廢棄物秸桿(水稻、小麥、玉米等秸桿)為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長。該菌塊接種于水稻秸桿粉培養(yǎng)基后，30°C條件下靜止培養(yǎng)7d，加無菌水過濾菌絲后可獲得孢子懸液。試驗表明，水稻秸桿接種孢子(1%的IO7孢子/mL)懸液后，30°C條件下170r/min液體發(fā)酵培養(yǎng)7d和靜止條件下固體發(fā)酵14d，水稻秸桿的失重率分別為59.7%和32.5%。液體發(fā)酵完成后，過濾菌絲和固體雜質(zhì)得到粗酶提取液，其內(nèi)切酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶活及總纖維素酶活性分別為 113.3U/gds、ll.6U/gds、1439.7U/gds、2.0U/gds 和 13.8U/gds。粗酶液能水解低濃度堿處理的玉米芯產(chǎn)生高濃度的還原糖(962.2mg還原糖/g底物)，本發(fā)明是利用微生物發(fā)酵的方法降解農(nóng)業(yè)廢棄秸桿使其轉(zhuǎn)化為有機肥料，可以變廢為寶、保護環(huán)境，具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0020]秸桿降解真菌NJGZ-2可將廢棄農(nóng)業(yè)秸桿發(fā)酵分解后制成有機物料，加速秸桿還田腐熟，不僅可以變廢為寶、保護環(huán)境，還可以促進可持續(xù)發(fā)展，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1鑒定NJGZ-2的系統(tǒng)發(fā)育樹
[0022]圖2NJGZ-2在CMC-剛果紅平板上產(chǎn)生的水解圈
[0023]圖3NJGZ-2ITS rRNA 核酸序列
[0024]圖4水稻秸桿降解前后對比效果和電鏡圖
[0025]圖5粗酶水解秸桿產(chǎn)生還原糖
四、【具體實施方式】
[0026]I)高效秸桿降解菌株分離:該降解菌是從南京紫金山腐爛樹葉土壤中篩選得至|J。利用梯度稀釋涂布法將逐級稀釋的土壤樣品的懸液涂布到CMC-剛果紅平板，30°C培養(yǎng)篩選纖維素降解菌。上述CMC-剛果紅培養(yǎng)基配方為:羧甲基纖維素鈉(CMC-Na) 10g，(NH4) 2S042g, KH2PO4Ig, MgSO4.7Η200.5g，剛果紅 0.2g，瓊脂 20g，水 1000mL, 121 °C 高壓滅菌20mino
[0027]挑選在CMC-剛果紅平板上產(chǎn)生透明圈較大并生長較快的菌株純化分離，然后，將它們接種至以水稻秸桿為唯一碳源的水稻秸桿粉培養(yǎng)基上培養(yǎng)，比較各菌株生長速度和生長情況，最終得到能高效降解煙草秸桿的高溫真菌NJGZ-2。在PDA平板上，初期菌落中間呈淺白色、輪廓規(guī)則，外觀呈絨毛狀。菌絲細(xì)胞絲狀交織，具橫隔；分生孢子梗不具足細(xì)胞，帚狀枝為對稱雙輪型，瓶梗細(xì)長漸變尖銳；分生孢子橢圓形，呈藍(lán)綠色。采用真菌通用引物ITSl和ITS4進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物連接pMD_19T載體后測序，所得序列經(jīng)NCBI比對，與Penicillium oxalicum strain als2_d38有99%的相似度。選取和它相近的一些菌株繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹，以及結(jié)合菌落和菌絲形態(tài)學(xué)特征，鑒定該菌株為草酸青霉(Penicilliumoxalicum)。
[0028]2)秸桿降解菌NJGZ-2孢子懸液菌劑
[0029]將菌株NJGZ-2接種至裝有50mL秸桿粉培養(yǎng)基的三角瓶中，30°C條件下靜止培養(yǎng)7d，加30mL無菌水去三角瓶中，放在搖床上震蕩30min，用紗布過濾培養(yǎng)物后即為孢子懸液菌劑。
[0030]3)粗酶液的制備
[0031]按照I %的體積接種孢子懸液菌劑于水稻秸桿為碳源的液體培養(yǎng)基中，在30 0C 170r/min條件下培養(yǎng)6d，離心過濾除去菌體和雜質(zhì)，得到粗酶液。測定粗酶液中內(nèi)切
酶、葡萄糖苷酶、木聚糖酶、β -木糖苷酶活及總纖維素酶活性。
[0032]
【權(quán)利要求】
1.一株降解農(nóng)業(yè)稻桿的真菌NJGZ-2,該真菌屬于草酸青霉(Penicillium oxalicum),2013年4月27日寄存于中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC N0.7527 ;其生物學(xué)特性為，在PDA平板上，初期菌落中間呈淺白色、輪廓規(guī)則，外觀呈絨毛狀；菌絲細(xì)胞絲狀交織，具橫隔；分生孢子梗不具足細(xì)胞，帚狀枝為對稱雙輪型，瓶梗細(xì)長漸變尖銳；分生孢子橢圓形，呈藍(lán)綠色。
2.如權(quán)利要求1所述農(nóng)業(yè)秸桿降解真菌在秸桿降解方面的應(yīng)用。
3.一種采用權(quán)利要求1所述的真菌制備的降解秸桿的菌劑，其特征在于是由以下方法制備而成: 1)水稻秸桿粉培養(yǎng)基的配制:烘干粉碎后的水稻秸桿粉末10g，KH2P043.0g,NaN0s3.0g, CaCl20.5g, MgSO4.7Η200.5g, FeSO4.7Η200.0075g, MnSO4.H2O0.0025g,ZnSO40.002g, CoCl20.003g，瓊脂 20g，水 1000mL, 121 °C 高壓滅菌 20min ； 2)液體培養(yǎng)基的配制:烘干粉碎后的水稻秸桿粉末20g，(NH4)2SO4L4g, KH2P042g,MgSO4.7Η200.3g, CaCl20.4g,胰蛋白胨 lg, FeSO4.7Η200.0075g, MnSO4.H2O0.0025g,ZnSO40.002g, CoCl20.003g，水 1000mL, 121 °C 高壓滅菌 20min ； 3)將權(quán)利要求1所述菌株NJGZ-2接種至裝有50mL秸桿粉培養(yǎng)基的三角瓶中，30°C條件下靜止培養(yǎng)7d，加30mL無菌水把孢子放在搖床上震蕩30min，用紗布過濾培養(yǎng)物后即為孢子懸液，用血球計數(shù)板計數(shù)后可濃縮或用無菌水稀釋以達(dá)到使用濃度，一般為IO7孢子/mL，制成秸桿降解菌劑；按1%的接種量接種于秸桿粉液體培養(yǎng)基中，30°C條件下，以170r/min培養(yǎng)6d，離心過濾除去菌體和雜質(zhì)，得到粗酶液。
4.如權(quán)利要求3所述的菌劑，其特征在于秸桿粉為粉碎后過40目篩，含水量10%以下。
5.權(quán)利要求3或4所述菌劑在`降解秸桿方面的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/80GK103667069SQ201310289313
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年7月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月11日
【發(fā)明者】徐陽春, 廖漢鵬, 韋中, 沈其榮 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)