一種小分子rna及其在害蟲防治中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小分子RNA及其在害蟲防治中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種小分子RNASli-miR-2771，通過體內(nèi)、體外試驗(yàn)證實(shí)Sli-miR-2771可通過結(jié)合解毒酶谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶slgste1的3’非編碼區(qū)，抑制slgste1的表達(dá)，使斜紋夜蛾減少對有毒的植物次生物質(zhì)的解毒能力，進(jìn)而影響斜紋夜蛾進(jìn)食植物與生長狀況，達(dá)到害蟲防治的目的。該發(fā)明為害蟲防治提供了新思路和新途徑，在害蟲防治領(lǐng)域中將具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】—種小分子RNA及其在害蟲防治中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種小分子RNA及其在害蟲防治中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]小分子RNA (miRNA)是一類長度約21~24核苷酸非編碼的小分子RNA，廣泛存在于動、植物體中。一系列實(shí)驗(yàn)表明miRNA可能是一類在進(jìn)化上保守的、在生物體中具有重要調(diào)控作用的分子。
[0003]miRNA源自細(xì)胞核內(nèi)編碼miRNA的基因轉(zhuǎn)錄成pr1-microRNA,接著被Drosha酶剪切為長度約70 bp呈發(fā)夾狀的pre-miRNA,隨后被核質(zhì)/細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)中，之后被Dicer酶剪切成長為18-26bp的miRNA雙螺旋復(fù)合體。其中一條解螺旋，并結(jié)合到RNA誘導(dǎo)的基因沉默的復(fù)合物內(nèi)，形成非對稱的RISC復(fù)合物。這個(gè)復(fù)合物通過其中的miRNA與靶mRNA的3’ UTR互補(bǔ)配對結(jié)合，從而降解靶目標(biāo)mRNA或阻斷其翻譯，實(shí)現(xiàn)對靶標(biāo)基因的負(fù)調(diào)控。近年來盡管有大量的miRNA被鑒定，但僅少數(shù)miRNA的功能被闡明。有文獻(xiàn)報(bào)道，miRNA在基因表達(dá)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物發(fā)育、抵抗脅迫、預(yù)防疾病等方面起著至關(guān)重要的作用。因此，研究對昆蟲抗藥性相關(guān)基因具有沉默功能的miRNA，并將其應(yīng)用于農(nóng)業(yè)害蟲的綜合治理成為近年研究的熱點(diǎn)。
[0004]谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶是一種多功能的二相解毒酶，它廣泛存在于動物與植物中，它通過催化還原谷胱甘肽與親電性有毒物質(zhì)的結(jié)合作用而轉(zhuǎn)化為親水性的無毒物質(zhì)；同時(shí)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶還具有過氧化物酶活性，通`過催化還原谷胱甘肽與脂質(zhì)過氧化中間或終端產(chǎn)物作用，而參與細(xì)胞內(nèi)因農(nóng)藥和重金屬等引起的氧脅迫，而增加生物體的耐性。但是，生物體中的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶是一大家族基因，不同的同工酶可能有不同的作用底物與酶活性，而且雖然動物與植物體內(nèi)都有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，但對不同種類有毒物質(zhì)的降解作用會不一樣。
[0005]斜紋夜蛾為雜食性昆蟲，可危害多達(dá)290多種植物，特別是十字花科的經(jīng)濟(jì)作物，對經(jīng)濟(jì)收入有很大的影響。目前害蟲的防治仍以化學(xué)殺蟲劑為主，但大量而長期的使用不僅造成了各地害蟲的抗藥性，使殺蟲劑的劑量使用越來越多，進(jìn)而造成環(huán)境的污染和影響食品的安全。 申請人:從農(nóng)業(yè)害蟲斜紋夜蛾中篩選出高活性的編碼谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的解毒基因，以其為靶標(biāo)，研制出防治害蟲的抑制劑，為斜紋夜蛾的防治提供新思路。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種小分子RNA。
[0007]本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供該小分子RNA在害蟲防治中的應(yīng)用。
[0008] 申請人:從斜紋夜蛾中獲得了一小分子RNA，命名為Sl1-miR-2771，其序列為:UAACAUUAUGAGGAUGGGUUGAACUG (SED ID N0.1)。通過生物信息學(xué)分析，預(yù)測 SliiiR-2771可能調(diào)控并通過熒光素酶報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)、蟲體注射實(shí)驗(yàn)以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR等多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，證實(shí)了 Sl1-miR-2771可通過結(jié)合的3’非編碼區(qū)，抑制ie7的表達(dá)。蟲體體內(nèi)實(shí)驗(yàn)更證實(shí)了 Sl1-miR-2771可以通過抑制的表達(dá)，使斜紋夜蛾減少了對有毒的植物次生物質(zhì)的解毒能力，進(jìn)而影響斜紋夜蛾進(jìn)食植物與生長狀況，達(dá)到害蟲防治的目的。該發(fā)明方法為害蟲防治提供了新思路和新途徑，在害蟲防治領(lǐng)域中將具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009]圖1為注射miRNAs后斜紋夜蛾的體重統(tǒng)計(jì)結(jié)果；
圖2為注射miRNAs72h后斜紋夜蛾的外型觀察結(jié)果；
圖3為注射miRNAs后進(jìn)食芥菜的斜紋夜蛾中slgstel的表達(dá)量檢測結(jié)果；
圖4為熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證miRNAs與slgsten’ UTR結(jié)合的實(shí)驗(yàn)流程圖；
圖5為miRNAs與slgstelZ, UTR結(jié)合實(shí)驗(yàn)的熒光素酶活性測定結(jié)果；
圖6為細(xì)胞株添加miRNAs后吲哚-3-甲醇(I3C) % slgstel的誘導(dǎo)結(jié)果；
圖7為miR-2771與slgstel 3’ UTR結(jié)合的計(jì)算機(jī)模擬圖。
【具體實(shí)施方式】
[0010] 申請人:用植物源殺蟲劑、有機(jī)磷殺蟲劑和擬除蟲菊酯類殺蟲劑、以及有機(jī)氯類的DDT對農(nóng)業(yè)重要害蟲斜紋夜蛾進(jìn)行誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶對這些處理都有著高表達(dá)。經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)該酶為基因庫中號碼為A`Y506545的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，按分類原則，將其重新命名為把Wgsid基因進(jìn)行體外蛋白表達(dá)，并對它的酶催化作用進(jìn)行分析，結(jié)果表明，它對芥菜的兩種主要次生物質(zhì)吲哚-3-甲醇(非揮發(fā)的)和烯丙基異硫氰酸酯(氣味成分)具有解毒作用，對其他的次生物質(zhì)如花椒毒素也有作用。
[0011] 申請人:從斜紋夜蛾中獲得了一小分子RNA，命名為Sl1-miR-2771，其序列為:UAACAUUAUGAGGAUGGGUUGAACUG (SED ID N0.1)。通過生物信息學(xué)分析，預(yù)測 miR-2771 可能調(diào)控并通過熒光素酶報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)、蟲體注射實(shí)驗(yàn)以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR等多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，證實(shí)了 miR-2771可以通過結(jié)合的3’非編碼區(qū)，抑制slgstel的表達(dá)。蟲體體內(nèi)實(shí)驗(yàn)更證實(shí)了 miR-2771可以通過抑制的表達(dá),使斜紋夜蛾減少了對有毒的植物次生物質(zhì)的解毒能力，進(jìn)而影響斜紋夜蛾進(jìn)食植物與生長狀況。
[0012]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本
【發(fā)明內(nèi)容】
。
[0013]以下實(shí)施例中所用Sl1-miR-2771 mimics (后續(xù)簡寫為miR-2771 mimics)和NCmimics (陰性對照mimics)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成,稀釋濃度為2 μ g/μ I。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可選擇通過構(gòu)建載體，表達(dá)后純化獲得Sl1-miR-2771。
[0014]實(shí)施例1
選取大小一致、健康狀況一致的五齡第一天斜紋夜蛾幼蟲，稱量每頭蟲子的重量，隨機(jī)分為miR-2771 mimics處理組和NC mimics對照組,每組40頭，重復(fù)3次。順血液循環(huán)流動方向，用WPI微量注射器從斜紋夜蛾幼蟲的側(cè)腹部分別注射miR-2771 mimics和NCmimics，注射量為每頭蟲4 μ g，注射后飼喂芥菜。注射后第1、2、3天觀察蟲子的形態(tài)變化并拍照取證，每天統(tǒng)計(jì)蟲子體重的變化，并隨機(jī)取3條蟲子提取RNA，熒光定量PCR檢測slgstel mRNA 的表達(dá)。[0015]圖1顯示注射miRNAs后斜紋夜蛾幼蟲的體重統(tǒng)計(jì)結(jié)果、圖2顯示注射miRNAs 72h后斜紋夜蛾幼蟲的外型觀察結(jié)果，可見，注射miR-2771 mimics后喂食芥菜，斜紋夜蛾生長速度變慢，無論從體重還是外型上，注射miR-2771 mimics的斜紋夜蛾進(jìn)食及生長速度顯著低于NC對照組。
[0016]將蟲子樣品按Trizol法抽提總RNA，測定濃度后取2 μ g總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(參考TAKARA的M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit說明書進(jìn)行)，得到的cDNA產(chǎn)物稀釋后用于熒光定量PCR的模板。所用PCR引物對SIGSTel-realtime-F和SlGSTel-realtime-R的序列如下:
SIGSTel-realtime-F GCTGAACTCCGCCTATGAAA(SED ID N0.2)；
SlGSTel- realtime-R CCAGAAGGGATGCTGATGATAC (SED ID N0.3)。
[0017]突光定量PCR反應(yīng)體系如表1所示:
表1熒光定量PCR反應(yīng)體系__
【權(quán)利要求】
1.一種小分子 RNA，其序列為:UAACAUUAUGAGGAUGGGUUGAACUG (SED ID N0.1)。
2.權(quán)利要求1所述的小分子RNA在害蟲防治中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用 ，所述害蟲為斜紋夜蛾。
【文檔編號】C12N15/113GK103497950SQ201310288857
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月10日
【發(fā)明者】鄒曉鵬, 鄭思春, 馮啟理, 鄒海望, 徐智斌 申請人:華南師范大學(xué)