一種黑曲霉孢子懸浮液的制備方法及黑曲霉孢子的儲(chǔ)存方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種黑曲霉孢子懸浮液的制備方法，其中，該方法包括將黑曲霉孢子制備成黑曲霉孢子懸浮液，所述黑曲霉孢子懸浮液的pH值為1-2.5。本發(fā)明還公開了一種黑曲霉孢子的儲(chǔ)存方法，其中，該方法包括將黑曲霉孢子制備成黑曲霉孢子懸浮液，所述黑曲霉孢子懸浮液的制備方法為本發(fā)明提供的方法。采用本發(fā)明的方法，能夠有效地降低黑曲霉孢子在儲(chǔ)存期間的染菌率，從而能夠提高黑曲霉種子液的質(zhì)量，并提高檸檬酸的發(fā)酵水平。
【專利說明】一種黑曲霉孢子懸淳液的制備方法及黑曲霉孢子的儲(chǔ)存方 法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種黑曲霉孢子懸浮液的制備方法，以及一種黑曲霉孢子的儲(chǔ)存方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 檸檬酸安全無毒，是目前世界上產(chǎn)量最大的發(fā)酵有機(jī)酸。大量應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、 環(huán)保、食品等領(lǐng)域，如作為酸味劑、調(diào)味劑及防腐劑、保鮮劑、緩沖劑、螯合劑。在化工行業(yè)、 化妝品行業(yè)及洗滌行業(yè)中可作抗氧化劑、增塑劑、洗滌劑。在醫(yī)藥行業(yè)中可作抗凝劑。
[0003] 發(fā)酵制備檸檬酸的工藝通常為：制備黑曲霉麩曲，再將黑曲霉麩曲接種到種子罐 的種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到黑曲霉種子液，再將該黑曲霉種子液接種到發(fā)酵罐的發(fā)酵 培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，得到檸檬酸發(fā)酵液。
[0004] 由于受工藝的限制，通常無法使用新鮮的黑曲霉麩曲制備黑曲霉種子液，而是 先將制備好的黑曲霉麩曲置于一定的環(huán)境中進(jìn)行儲(chǔ)存(使用的黑曲霉麩曲一般需要儲(chǔ)存 24-48小時(shí))，待使用時(shí)再將其取出進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)制備黑曲霉種子液，并進(jìn)行后續(xù)的檸檬酸 發(fā)酵。
[0005] 但現(xiàn)有工藝的缺點(diǎn)是：現(xiàn)有方法制備的黑曲霉麩曲在儲(chǔ)存的過程中極易染菌，尤 其是在春夏季節(jié)其染菌率更高。而采用染菌的黑曲霉麩曲進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到的種子液質(zhì) 量較低，從而影響最終的檸檬酸發(fā)酵水平。雜菌過多時(shí)，甚至?xí)霈F(xiàn)倒罐的現(xiàn)象，將給生產(chǎn) 造成嚴(yán)重的損失。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有方法制備的黑曲霉麩曲在儲(chǔ)存過程中易染菌的缺 陷，提供一種在儲(chǔ)存過程中染菌率低的黑曲霉孢子懸浮液的制備方法，以及一種黑曲霉孢 子的儲(chǔ)存方法。
[0007] 本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在檸檬酸發(fā)酵過程中，發(fā)酵水平較低的原因在于：傳統(tǒng)的黑 曲霉麩曲在儲(chǔ)存期間易滋生雜菌，將帶有雜菌的黑曲霉麩曲接入種子罐中進(jìn)行種子液的制 備時(shí)，雜菌會(huì)迅速生長(zhǎng)，從而會(huì)消耗種子罐內(nèi)的大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在這種帶有雜菌生長(zhǎng)的環(huán) 境下生長(zhǎng)的黑曲霉孢子，生長(zhǎng)會(huì)受到極大的抑制，菌球形態(tài)松散，種子液的質(zhì)量較低。當(dāng)將 這樣的種子液接入發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，一方面，帶入的雜菌同樣也會(huì)消耗發(fā)酵罐中的大 部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使得檸檬酸的發(fā)酵轉(zhuǎn)化率降低；另一方面，將帶有雜菌的種子液接入發(fā)酵罐 后，發(fā)酵培養(yǎng)基的粘度會(huì)升高，使得發(fā)酵產(chǎn)酸變慢，從而會(huì)延長(zhǎng)發(fā)酵周期；再一方面，生長(zhǎng)狀 態(tài)較差的黑曲霉種子無法進(jìn)行高效的產(chǎn)酸，使得發(fā)酵的酸度降低。
[0008] 因此，降低黑曲霉麩曲在儲(chǔ)存過程中的染菌率是提高檸檬酸發(fā)酵水平的關(guān)鍵。本 發(fā)明的發(fā)明人首先想到的是，一方面，在允許的范圍內(nèi)增加用于制備黑曲霉孢子的原料的 滅菌時(shí)間和滅菌溫度，以將原料中的雜菌充分致死；另一方面，對(duì)用于儲(chǔ)存黑曲霉孢子的容 器采用多種方法或多種方法相結(jié)合進(jìn)行滅菌，如，高溫蒸汽滅菌、酒精消毒、干熱滅菌；再一 方面，保證儲(chǔ)存環(huán)境的無菌性。但結(jié)果卻都收效甚微。
[0009] 本發(fā)明的發(fā)明人意外的發(fā)現(xiàn)，將黑曲霉孢子在無菌水中制備成黑曲霉孢子懸浮 液，并以黑曲霉孢子懸浮液的形式進(jìn)行儲(chǔ)存能夠在一定程度上降低染菌率，但結(jié)果仍不理 想。由于黑曲霉孢子在種子培養(yǎng)基中吸水膨脹萌發(fā)的最適PH值為5-7. 5,而無菌水本身的 pH值也在此范圍內(nèi)，因此，為了不對(duì)黑曲霉孢子造成損傷，并使得儲(chǔ)存的黑曲霉孢子能夠較 快的適應(yīng)種子培養(yǎng)基的環(huán)境以及節(jié)省操作步驟，故一般不對(duì)黑曲霉孢子懸浮液的PH值進(jìn) 行調(diào)節(jié)。然而，本發(fā)明的發(fā)明人卻意外的發(fā)現(xiàn)，將黑曲霉孢子懸浮液的PH值調(diào)節(jié)至1-2.5， 在儲(chǔ)存過程中不但能夠進(jìn)一步有效地降低染菌率，而且也不會(huì)影響黑曲霉孢子的存活率， 低PH值下儲(chǔ)存的黑曲霉孢子對(duì)黑曲霉種子的培養(yǎng)周期也不會(huì)造成影響。因此，將黑曲霉麩 曲制備成黑曲霉孢子懸浮液，并將黑曲霉孢子懸浮液的PH值調(diào)節(jié)至1-2. 5,能夠有效地降 低黑曲霉孢子在儲(chǔ)存期間的染菌率，從而能夠提高黑曲霉種子液的質(zhì)量，并提高檸檬酸的 發(fā)酵水平。
[0010] 基于以上發(fā)現(xiàn)，一方面，本發(fā)明提供了一種黑曲霉孢子懸浮液的制備方法，其中， 該方法包括將黑曲霉孢子制備成黑曲霉孢子懸浮液，所述黑曲霉孢子懸浮液的PH值為 1-2. 5。
[0011] 優(yōu)選地，所述黑曲霉孢子懸浮液的pH值為2-2. 5。
[0012] 另一方面，本發(fā)明還提供了一種黑曲霉孢子的儲(chǔ)存方法，其中，該方法包括將黑曲 霉孢子制備成黑曲霉孢子懸浮液，所述黑曲霉孢子懸浮液的制備方法為本發(fā)明提供的方 法。
[0013] 采用本發(fā)明的方法，將黑曲霉孢子制備成黑曲霉孢子懸浮液，將黑曲霉孢子懸浮 液的PH值調(diào)節(jié)至1-2. 5,優(yōu)選調(diào)節(jié)至2-2. 5,并將該黑曲霉孢子以懸浮液的形式進(jìn)行儲(chǔ)存， 不但抑制了多數(shù)中性及堿性細(xì)菌的生長(zhǎng)，而且還能有效抑制酸性細(xì)菌的生長(zhǎng)，因此，能夠有 效地降低黑曲霉孢子在儲(chǔ)存期間的染菌率，從而能夠提高黑曲霉種子液的質(zhì)量，并提高檸 檬酸的發(fā)酵水平。
[0014] 本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說明。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 以下對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體 實(shí)施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0016] 一方面，本發(fā)明提供了一種黑曲霉孢子懸浮液的制備方法，其中，該方法包括將黑 曲霉孢子制備成黑曲霉孢子懸浮液，所述黑曲霉孢子懸浮液的PH值為1-2. 5。
[0017] 通常在發(fā)酵生產(chǎn)上，當(dāng)發(fā)酵受到雜菌污染時(shí)，一般會(huì)對(duì)用于發(fā)酵的原料(例如，種 子液、發(fā)酵培養(yǎng)基等）及設(shè)備(例如，發(fā)酵罐等)，甚至發(fā)酵的環(huán)境等進(jìn)行逐一并逐級(jí)的檢查， 直至尋找到雜菌的污染源頭。
[0018] 通過采用上述方法發(fā)現(xiàn)，在檸檬酸發(fā)酵過程中的雜菌污染主要源于黑曲霉麩曲。 主要原因?yàn)椋河捎谑墁F(xiàn)有工藝的限制，在發(fā)酵過程中無法使用新鮮的黑曲霉麩曲制備黑曲 霉種子液，而在黑曲霉麩曲儲(chǔ)存的過程中，極易污染雜菌。
[0019] 但本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)污染源后，采用通常的處理方法，即對(duì)用于制備黑曲 霉麩曲的原料，儲(chǔ)存黑曲霉麩曲的容器，以及黑曲霉的儲(chǔ)存環(huán)境等的滅菌狀況進(jìn)行了嚴(yán)格 的控制，但仍不能有效地抑制雜菌的污染。
[0020] 本發(fā)明的發(fā)明人意外的發(fā)現(xiàn)，將黑曲霉麩曲中的黑曲霉孢子制備成黑曲霉孢子懸 浮液，并以黑曲霉孢子懸浮液的形式進(jìn)行儲(chǔ)存，能夠在一定程度上降低儲(chǔ)存過程中黑曲霉 孢子的染菌率。本發(fā)明的發(fā)明人又意外的發(fā)現(xiàn)，將黑曲霉孢子懸浮液的PH值調(diào)節(jié)至1-2. 5， 不但能夠進(jìn)一步有效地降低儲(chǔ)存過程中黑曲霉孢子的染菌率，而且不會(huì)影響黑曲霉孢子的 存活率，低PH值下儲(chǔ)存的黑曲霉孢子對(duì)黑曲霉種子的培養(yǎng)周期也不會(huì)造成影響。
[0021] 更優(yōu)選地，所述黑曲霉孢子懸浮液的pH值為2-2. 5。當(dāng)將黑曲霉孢子懸浮液的pH 值調(diào)節(jié)至2-2. 5時(shí)，儲(chǔ)存過程中黑曲霉孢子能夠更好的存活，且在制備種子液時(shí)，黑曲霉孢 子能更好的適應(yīng)黑曲霉種子培養(yǎng)基的環(huán)境。從而能夠進(jìn)一步提高發(fā)酵效率。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的黑曲霉孢子懸浮液的制備方法，調(diào)節(jié)pH值的方法可以為本領(lǐng)域常 用的方法，例如用酸性試劑調(diào)節(jié)；所述酸性試劑可以是本領(lǐng)域常用的各種酸性試劑，只要不 影響黑曲霉孢子的存活就可以，優(yōu)選地，所述酸性試劑選自檸檬酸、鹽酸和硫酸中的一種或 多種。由于該孢子懸浮液之后用于生產(chǎn)檸檬酸，因此，更優(yōu)選地，所述酸性試劑為檸檬酸。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的黑曲霉孢子懸浮液的制備方法，將黑曲霉麩曲中的黑曲霉孢子制成 孢子懸浮液的方法可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的各種方法，例如，可以直接將黑曲霉麩 曲與無菌水混合、攪拌，使黑曲霉懸孢子懸浮于無菌水中制得孢子懸浮液。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的黑曲霉孢子懸浮液的制備方法，為了使黑曲霉孢子充分從麩曲中 游離出來，并且能夠得到均勻分散的孢子懸浮液。優(yōu)選地，將黑曲霉在無菌水中進(jìn)行分散 得到孢子懸浮液的方法還包括：將黑曲霉分散到無菌水中，在300-1000rpm條件下，攪拌 30-60min ;然后在20000-40000頻率下，超聲處理20-40min。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明，對(duì)調(diào)節(jié)所述黑曲霉孢子懸浮液的pH值的時(shí)機(jī)沒有特別的限制。例 如，可以先調(diào)節(jié)所述無菌水的PH值，然后再將黑曲霉麩曲與無菌水進(jìn)行混合制得黑曲霉孢 子懸浮液；或者可以先將黑曲霉麩曲與無菌水進(jìn)行混合制得黑曲霉孢子懸浮液，再調(diào)節(jié)所 述黑曲霉孢子懸浮液的PH值。優(yōu)選的情況下，采用第一種方法制備黑曲霉孢子懸浮液。當(dāng) 采用第一種方法調(diào)節(jié)黑曲霉孢子懸浮液的PH值時(shí)，為了避免在無菌水中加入黑曲霉麩曲 后會(huì)影響最終懸浮液的PH值，可以將所述無菌水的pH值調(diào)節(jié)至比上述范圍稍低的范圍，以 保證加入黑曲霉麩曲后所得的黑曲霉孢子懸浮液的PH值在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以通過在加入黑曲霉麩曲的過程中間隔性的檢測(cè)懸浮液的PH值，以保證最終所得 黑曲霉孢子懸浮液的PH值在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0026] 另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在進(jìn)行高溫蒸汽滅菌時(shí)，所滅菌的物質(zhì)的pH值一般 會(huì)下降0. 3-0. 5,因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)實(shí)際情況對(duì)滅菌前無菌水的pH值進(jìn)行調(diào) 節(jié)，以保證滅菌并加入黑曲霉麩曲后能夠使黑曲霉孢子懸浮液的PH值在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的黑曲霉孢子懸浮液的制備方法，對(duì)于所述孢子懸浮液中的黑曲霉的 孢子的含量沒有特別的限制，但是為了使黑曲霉孢子更好地分散并為了后續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)接 種量的需要，優(yōu)選地，所述孢子懸浮液中黑曲霉孢子的含量為IX 1〇8_7 X IO8個(gè)孢子/ml，更 優(yōu)選I X 108-2 X IO8個(gè)孢子/ml。由于在制備黑曲霉孢子懸浮液的過程中，黑曲霉孢子已經(jīng) 充分從麩曲中游離出，并且游離出黑曲霉孢子后的麩曲由于密度較大會(huì)沉于容器的底部， 因此，可以直接取容器上部的黑曲霉孢子懸浮液進(jìn)行黑曲霉孢子的計(jì)數(shù)。
[0028] 需要注意的是，盡管將黑曲霉孢子懸浮液的pH值調(diào)節(jié)至本發(fā)明的范圍內(nèi)，既能夠 有效地降低在儲(chǔ)存過程中孢子懸浮液的染菌率。但為了進(jìn)一步降低染菌的可能性，優(yōu)選，制 備孢子懸浮液的整個(gè)過程在無菌條件下進(jìn)行。
[0029] 第二方面，本發(fā)明提供了一種黑曲霉孢子的儲(chǔ)存方法，其中，該方法包括將黑曲霉 孢子制備成黑曲霉孢子懸浮液，所述黑曲霉孢子懸浮液的制備方法為本發(fā)明提供的方法。
[0030] 由于本發(fā)明的發(fā)明點(diǎn)在于所述黑曲霉孢子懸浮液的制備，因此，對(duì)所述黑曲霉孢 子懸浮液進(jìn)行儲(chǔ)存的條件可以為常規(guī)的用于儲(chǔ)存黑曲霉孢子的條件。例如，儲(chǔ)存的溫度可 以為 4-25 °C。
[0031] 由于采用了本發(fā)明的黑曲霉孢子懸浮液的制備方法，并將黑曲霉孢子以黑曲霉孢 子懸浮液的形式進(jìn)行儲(chǔ)存，能夠有效地降低在儲(chǔ)存過程中的染菌率，因此，所述黑曲霉孢子 懸浮液的儲(chǔ)存時(shí)間要遠(yuǎn)長(zhǎng)于采用現(xiàn)有技術(shù)制備的黑曲霉麩曲的儲(chǔ)存時(shí)間。例如，采用本發(fā) 明的方法制備的黑曲霉孢子在儲(chǔ)存72小時(shí)時(shí)仍沒有觀察到明顯的染菌，而現(xiàn)有技術(shù)制備 的黑曲霉麩曲在儲(chǔ)存24小時(shí)時(shí)就已經(jīng)出現(xiàn)了嚴(yán)重的染菌。
[0032] 優(yōu)選地，存儲(chǔ)的環(huán)境為無菌環(huán)境。所述無菌環(huán)境的形成可以按照本領(lǐng)域常規(guī)的方 法形成，例如，可以采用紫外燈照射儲(chǔ)存環(huán)境后，再將所述黑曲霉孢子懸浮液置于此環(huán)境中 進(jìn)行儲(chǔ)存。嚴(yán)格的無菌環(huán)境是指儲(chǔ)存環(huán)境經(jīng)過嚴(yán)格的滅菌處理，處理的方法為本領(lǐng)域技術(shù) 人員所公知，例如，可以通過紫外線照射和噴灑消毒液相結(jié)合的方法。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的黑曲霉孢子的儲(chǔ)存方法，在對(duì)所述黑曲霉孢子懸浮液進(jìn)行儲(chǔ)存的過 程中，需要每隔一段時(shí)間對(duì)所述黑曲霉孢子懸浮液進(jìn)行取樣，以檢測(cè)其染菌狀況。所述檢測(cè) 的方法可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的用于檢測(cè)是否染有雜菌的方法，例如，采用鏡檢的方法。所述 鏡檢的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，在此不再贅述。對(duì)于取樣的時(shí)間間隔可以根據(jù)實(shí)際 需要進(jìn)行調(diào)整，例如，可以為10-20小時(shí)。
[0034] 以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中 的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡(jiǎn)單變型，這 些簡(jiǎn)單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0035] 另外需要說明的是，在上述【具體實(shí)施方式】中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛 盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合。為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對(duì)各種可 能的組合方式不再另行說明。
[0036] 此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本 發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。
[0037] 以下將通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。以下實(shí)施例中用于鏡檢所述黑曲霉孢 子懸浮液的顯微鏡型號(hào)X-18-202雙目。
[0038] 發(fā)酵轉(zhuǎn)化率：轉(zhuǎn)化率（％) =發(fā)酵液的濃度(簡(jiǎn)稱酸度）X發(fā)酵液的體積/總糖的重 量X 100%，其中，總糖的重量包括種子罐用糖重量和發(fā)酵罐用糖重量，總糖的測(cè)定根據(jù)GB/ T5009. 7-2003標(biāo)準(zhǔn)中的酸法總糖檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。酸度根據(jù)GB1987-2007標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢 測(cè)。
[0039] 發(fā)酵糧耗指單位質(zhì)量的檸檬酸所消耗的玉米原料的質(zhì)量。
[0040] 還原糖的濃度采用菲林試劑法進(jìn)行測(cè)定。
[0041] 染菌率為單位體積內(nèi)的所述黑曲霉孢子懸浮液中雜菌的個(gè)數(shù)。
[0042] 實(shí)施例I
[0043] 本實(shí)施例用于說明本發(fā)明提供的黑曲霉孢子懸浮液的制備方法和黑曲霉孢子的 儲(chǔ)存方法。
[0044] (1)在IOOOmL三角瓶中裝入600mL去離子水，使用檸檬酸調(diào)節(jié)其pH值為2. 4,將 調(diào)節(jié)PH值后的去離子水、接種鋼瓶進(jìn)行高溫蒸汽滅菌，滅菌的壓力為0. 15Mpa，滅菌的溫度 為121°C，滅菌60min。制得pH值為2.0的無菌水，以及無菌接種鋼瓶。自然冷卻后備用。
[0045] (2)在無菌的條件下，將300ml步驟（1)中備用的無菌水倒入麩曲三角瓶中（含有 麩曲20g，用于制備麩曲的麩皮在0. 13Mpa，121°C條件下，滅菌60min)，并在800rpm條件下， 攪拌45min ;然后在30000頻率下，超聲處理30min，得到分散均勻的孢子懸浮液，所述孢子 懸浮液的PH值為2. 5。取上層孢子懸浮液進(jìn)行黑曲霉孢子計(jì)數(shù)，孢子濃度為2. OX IO8個(gè)孢 子/ml懸浮液。
[0046] (3)在無菌的條件下，將步驟（2)中得到的孢子懸浮液倒入步驟（1)中備用的無菌 鋼瓶中。于20°C下在無菌環(huán)境中儲(chǔ)存所述孢子懸浮液。以將孢子懸浮液倒入無菌鋼瓶中的 時(shí)刻記為0小時(shí)，并每隔12小時(shí)取樣鏡檢所述懸浮液的染菌狀況，計(jì)算染菌率。檢測(cè)至72 小時(shí)。結(jié)果見表1。
[0047] 實(shí)施例2
[0048] 本實(shí)施例用于說明本發(fā)明提供的黑曲霉孢子懸浮液的制備方法和黑曲霉孢子的 儲(chǔ)存方法。
[0049] (1)在IOOOmL三角瓶中裝入600mL去離子水，使用檸檬酸調(diào)節(jié)其pH值為2. 1。將 調(diào)節(jié)PH值后的去離子水、接種鋼瓶進(jìn)行高溫蒸汽滅菌，滅菌的壓力為0. 15Mpa，滅菌的溫度 為121°C，滅菌60min。制得pH值為1.8的無菌水，以及無菌接種鋼瓶。自然冷卻后備用。
[0050] (2)在無菌的條件下，將300ml步驟（1)中備用的無菌水倒入麩曲三角瓶中（含有 麩曲20g，用于制備麩曲的麩皮在0. 13Mpa，121°C條件下，滅菌60min)，并在300rpm條件下， 攪拌60min ;然后在40000頻率下，超聲處理20min，得到分散均勻的孢子懸浮液，所述孢子 懸浮液的PH值為2. 0。取上層孢子懸浮液進(jìn)行黑曲霉孢子計(jì)數(shù)，孢子濃度為I. 5 X IO8個(gè)孢 子/ml懸浮液。
[0051] (3)在無菌的條件下，將步驟（2)中得到的孢子懸浮液倒入步驟（1)中備用的無菌 鋼瓶中。于20°C下在無菌環(huán)境中儲(chǔ)存所述孢子懸浮液。以將孢子懸浮液倒入無菌鋼瓶中的 時(shí)刻記為0小時(shí)，并每隔12小時(shí)取樣鏡檢所述懸浮液的染菌狀況，計(jì)算染菌率。檢測(cè)至儲(chǔ) 存后的72小時(shí)。結(jié)果見表1。
[0052] 實(shí)施例3
[0053] 本實(shí)施例用于說明本發(fā)明提供的黑曲霉孢子懸浮液的制備方法和黑曲霉孢子的 儲(chǔ)存方法。
[0054] (1)在IOOOmL三角瓶中裝入600mL去離子水，使用檸檬酸調(diào)節(jié)其pH值為2. 3。將 調(diào)節(jié)PH值后的去離子水、接種鋼瓶進(jìn)行高溫蒸汽滅菌，滅菌的壓力為0. 15Mpa，滅菌的溫度 為121°C，滅菌60min。制得pH值為1.9的無菌水，以及無菌接種鋼瓶。自然冷卻后備用。
[0055] (2)在無菌的條件下，將300ml步驟（1)備用中的無菌水倒入麩曲三角瓶中（含有 麩曲20g，用于制備麩曲的麩皮在0. 13Mpa，121°C條件下，滅菌60min)，并在IOOOrpm條件 下，攪拌30min ;然后在20000頻率下，超聲處理40min，得到分散均勻的孢子懸浮液，所述孢 子懸浮液的pH值為2. 2。取上層孢子懸浮液進(jìn)行黑曲霉孢子計(jì)數(shù)，孢子濃度為I. O X IO8個(gè) 孢子/ml懸浮液。
[0056] (3)在無菌的條件下，將步驟（2)中得到的孢子懸浮液倒入步驟（1)中備用的無菌 鋼瓶中。于20°C下在無菌環(huán)境中儲(chǔ)存所述孢子懸浮液。以將孢子懸浮液倒入無菌鋼瓶中的 時(shí)刻記為〇小時(shí)，并每隔12小時(shí)取樣鏡檢所述懸浮液的染菌狀況，計(jì)算染菌率。檢測(cè)至儲(chǔ) 存后的72小時(shí)。結(jié)果見表1。
[0057] 實(shí)施例4
[0058] 本實(shí)施例用于說明本發(fā)明提供的黑曲霉孢子懸浮液的制備方法和黑曲霉孢子的 儲(chǔ)存方法。
[0059] 按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行黑曲霉孢子懸浮液的制備和儲(chǔ)存。不同的是，步驟（1) 中，將滅菌前將去離子水的PH值調(diào)節(jié)至1. 3,使得最終制備的黑曲霉孢子懸浮液的pH值為 1。與實(shí)施例1相同的儲(chǔ)存時(shí)間下鏡檢所述懸浮液的染菌狀況。計(jì)算染菌率。結(jié)果見表1。
[0060] 對(duì)比例1
[0061] 本對(duì)比例用于說明參比的黑曲霉孢子懸浮液的制備方法和黑曲霉孢子的儲(chǔ)存方 法。
[0062] 按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行黑曲霉孢子懸浮液的制備和儲(chǔ)存。不同的是，步驟（1) 中，將滅菌前將去離子水的PH值調(diào)節(jié)至3. 5,使得最終制備的黑曲霉孢子懸浮液的pH值為 3。與實(shí)施例1相同的儲(chǔ)存時(shí)間下鏡檢所述懸浮液的染菌狀況。計(jì)算染菌率。結(jié)果見表1。
[0063] 對(duì)比例2
[0064] 本對(duì)比例用于說明參比方法提供的黑曲霉孢子懸浮液的制備方法和黑曲霉孢子 的儲(chǔ)存方法。
[0065] 按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行黑曲霉孢子懸浮液的制備和儲(chǔ)存。不同的是，步驟（1) 中，不調(diào)節(jié)所述去離子水的PH值（pH值為7. 0左右)。與實(shí)施例1相同的儲(chǔ)存時(shí)間下鏡檢 所述懸浮液的染菌狀況。計(jì)算染菌率。結(jié)果見表1。
[0066] 對(duì)比例3
[0067] 本對(duì)比例用于說明現(xiàn)有技術(shù)提供的黑曲霉麩曲的儲(chǔ)存方法。
[0068] 按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行黑曲霉孢子的儲(chǔ)存。不同的是，黑曲霉孢子以黑曲霉麩 曲的形式進(jìn)行儲(chǔ)存，而不制備成黑曲霉孢子懸浮液。其中，用于制備麩曲的麩皮以及接種鋼 瓶在0. 15Mpa，123°C條件下，滅菌90min，并將置于接種鋼瓶中的麩曲在嚴(yán)格的無菌環(huán)境中 進(jìn)行儲(chǔ)存。與實(shí)施例1相同的儲(chǔ)存時(shí)間下取黑曲霉麩曲，并使用無菌水制備成孢子懸浮液 鏡檢所述麩曲的染菌狀況。計(jì)算染菌率。結(jié)果見表1。
[0069] 表 1
[0070]
【權(quán)利要求】
1. 一種黑曲霉孢子懸浮液的制備方法，其特征在于，該方法包括將黑曲霉孢子制備成 黑曲霉孢子懸浮液，所述黑曲霉孢子懸浮液的pH值為1-2. 5。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述黑曲霉孢子懸浮液的pH值為2-2. 5。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述黑曲霉孢子以黑曲霉麩曲的形式存在， 將黑曲霉孢子制備成黑曲霉孢子懸浮液的方法包括：將黑曲霉麩曲中的黑曲霉孢子分散于 無菌水中，得到黑曲霉孢子懸浮液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，將黑曲霉孢子分散于無菌水中的方法包括，將黑 曲霉麩曲與無菌水混合，并在300-1000rpm的條件下，攪拌30-60min ;然后在20000-40000 的頻率下，超聲處理20-40min。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述黑曲霉孢子懸浮液中黑曲霉孢子的含量為 1 X 108-7X 108 個(gè)孢子 /ml。
6. -種黑曲霉孢子的儲(chǔ)存方法，該方法包括將黑曲霉孢子制備成黑曲霉孢子懸浮液， 其特征在于，所述黑曲霉孢子懸浮液的制備方法為權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的方法。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述儲(chǔ)存的條件包括：儲(chǔ)存的溫度為4-25°C。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK104277977SQ201310273323
【公開日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2013年7月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月1日
【發(fā)明者】熊結(jié)青, 盧宗梅, 鐘華, 劉夢(mèng)涵 申請(qǐng)人:中糧生物化學(xué)（安徽）股份有限公司