十字花科黑腐病菌致病相關(guān)的基因的用途【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種與十字花科黑腐病病菌致病相關(guān)的基因在防治植物十字花科黑腐病病害中的用途，該基因是編碼序列表中序列2所示蛋白質(zhì)的DNA序列；具體地，是序列表中序列1所示的DNA序列。本發(fā)明鑒定了十字花科黑腐病菌致病相關(guān)的基因XC2038，能夠?yàn)榉乐问只浦参锖诟〔『μ峁┧幬锇袠?biāo)?！緦?zhuān)利說(shuō)明】十字花科黑腐病菌致病相關(guān)的基因的用途【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及植物病原細(xì)菌的致病相關(guān)基因及其用途，尤其涉及十字花科黑腐病病菌致病相關(guān)的基因及其用途。【
背景技術(shù)：
】[0002]植物病害一直是農(nóng)作物減產(chǎn)、品質(zhì)降低的主要因素之一。隨著病原菌對(duì)藥物抗性的增強(qiáng)，農(nóng)藥用量在不斷增加，這不僅加劇了環(huán)境污染、藥物殘留，也大大增加了農(nóng)業(yè)成本，因此，亟待研發(fā)新的防病治病策略和新型的無(wú)公害藥物。弄清植物病原菌侵染寄主的遺傳機(jī)制是開(kāi)發(fā)新型藥物和防病策略的關(guān)鍵。[0003]十字花科黑腐病菌(Xcc,Xanthomonascampestrispv.campestris)是一種能在全球范圍內(nèi)引起所有十字花科植物黑腐病的革蘭氏陰性細(xì)菌。該菌能在寄主的任何生長(zhǎng)期通過(guò)水孔、氣孔或傷口侵入植物體內(nèi)，引起十字花科黑腐病病害，寄主包括甘藍(lán)、花椰菜、大白菜、蘿卜以及油菜等。典型的黑腐病癥狀是在葉緣上形成V字形病斑。隨著病斑的擴(kuò)大，葉脈變黑，因而被稱(chēng)為黑腐病。黑腐病被認(rèn)為是對(duì)十字花科植物危害最為嚴(yán)重的病害，尤其在熱帶和亞熱帶地區(qū)，溫度和濕度都適宜于該菌的生長(zhǎng)繁殖，因此發(fā)病更加嚴(yán)重。由于遺傳穩(wěn)定性和遺傳可操作性，十字花科黑腐病菌一直被用作研究微生物與植物相互作用分子機(jī)理的模式細(xì)菌。因此，鑒定與十字花科黑腐病菌致病相關(guān)的基因，對(duì)防治植物病害具有顯著的意義。[0004]目前，，在十字花科黑腐病菌致病變種Xcc8004的基因組中，發(fā)現(xiàn)編號(hào)為XC2038的基因的開(kāi)放閱讀框(ORF,OpenReadingFrame)所編碼的蛋白注釋為假定蛋白(HypotheticalProtein)。假定蛋白是指因功能未知而未被鑒定的新基因編碼的蛋白。在Xcc8004的基因組中發(fā)現(xiàn)注釋為假定蛋白的ORF較多。目前，已鑒定到被注釋為假定蛋白且與十字花科黑腐病菌致病相關(guān)的新基因，如XC0241基因，即被鑒定為致病相關(guān)的III型效應(yīng)物基因。對(duì)于XC2038基因的功能目前卻鮮有報(bào)道。[0005]參考文獻(xiàn)[0006]KBeringer,J.，Beynon，J.,Buchanan-Wollaston,A.，Johnston，A.Transferofthedrug-resistancetransposonTn5toRhizobium.Nature.1978.276:633-634.[0007]2、Jiang,B.L，He，Y.Q.，Cen，W.J.，Wei，H.Y.，Jiang,G.F.，Jiang,W.，Hang，X.H.，F(xiàn)eng,J.X.，Lu，G.T.，Tang,D.J.ThetypeIIIsecretioneffectorXopXceNofXanthomonascampestrispv.campestrisisrequiredforfullvirulence.ResearchinMicrobiology.2008.159(3):216-220.[0008]3、Jiang,G.F.，Jiang,B.L，Chen,LG.，Liu,S.，Wei，H.Y.，Cen,W.J.，Hang，X.H:，Wen,Z.Z.，Tang,D.J.，Lu，G.T.，He，Y.Q.，Yu,D.Q.，Tang,J.LTheT3SeffectorXopXccNofXanthomonascampestrispv.campestrisisinvolvedinplantdefensethroughinterferencewithphotosystems,reactiveoxygenspeeies(ROS)generation，andcallosedeposition.AfficanJournalofMicrobiologyResearch.2012.6(15):3673-3683.[0009]4>Liu,Y.G.,Whittier,R.F.ThermalasymmetricinterlacedPCR!automatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromPlandYACclonesforchromosomewalking.Genomics.1995.25(3):674-681.[0010]5、Qian,ff.，Jia,Y.，Ren,S.X.,He,Y.Q.，F(xiàn)eng,J.X.，Lu,L.F.，Sun,Q.，Ying,G.，Tang,D.J.,Tang,H.,ffu,ff.,Hao,P.,Wang,L.,Jiang,B.L.,Zeng,S.,Gu,ff.Y.,Lu,G.,Rong,L.,Tian,Y.,Yao,Z.,Fu,G.,Chen,B.,Fang,R.,Qiang,B.,Chen,Z.,Zhao,G.P.,Tang,J.L.,He,C.ComparativeandfunctionalgenomicanalysesofthepathogenicityofphytopathogenXanthomonascampestrispv.campestris.GenomeResearch.2005.15(6):757-767.[0011]6>Sharma,S.,Signer,E.TemporalandspatialregulationofthesymbioticgenesofRhizobiummelilotiinplantarevealedbytransposonTn5-gusA.Genes&Development.1990.4(3):344-356.[0012]7、Staskawicz,B.,Dahlbeck,D.,Keen,N.,Napoli,C.MolecularcharacterizationofclonedavirulencegenesfromraceOandracelofPseudomnonassyringaepv.glycinea.JournalofBacteriology.1987.169(12):5789-5794.【
發(fā)明內(nèi)容】[0013]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種十字花科黑腐病菌致病相關(guān)的基因的用途，通過(guò)鑒定該基因?yàn)榉乐问只浦参锖诟〔『μ峁┧幬锇袠?biāo)。[0014]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種與十字花科黑腐病病菌致病相關(guān)的基因在防治植物十字花科黑腐病病害中的用途，該基因是編碼序列表中序列2所示蛋白質(zhì)的DNA序列。[0015]優(yōu)選地，該基因是序列表中序列I所不的DNA序列。[0016]本發(fā)明鑒定了十字花科黑腐病菌致病相關(guān)的基因XC2038，能夠?yàn)榉乐问只浦参锖诟〔『μ峁┧幬锇袠?biāo)。【專(zhuān)利附圖】【附圖說(shuō)明】[0017]圖1為本發(fā)明鑒定的XC2038基因克隆的酶切電泳圖譜；[0018]圖2為在本發(fā)明鑒定的XC2038基因插入突變體164H09的PCR驗(yàn)證凝膠圖；[0019]圖3為在本發(fā)明鑒定的XC2038基因插入突變體164H09的胞外多糖、泳動(dòng)性及生物聚膜表型檢測(cè)；[0020]圖4為本發(fā)明鑒定的XC2038基因插入突變體164H09的致病性試驗(yàn)?！揪唧w實(shí)施方式】[0021]以下結(jié)合附圖和優(yōu)選實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)地闡述。應(yīng)該理解，以下列舉的實(shí)施例僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，而不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的限制。[0022]本發(fā)明旨在提供與十字花科黑腐病菌致病相關(guān)的基因XC2038。首先確定XC2038基因與十字花科黑腐病致病性的關(guān)系，并由此得到該基因在防治植物十字花科黑腐病方面的用途。[0023]本發(fā)明所提供的與十字花科黑腐病菌致病相關(guān)的基因XC2038，是編碼序列表中序列2所不蛋白質(zhì)的DNA序列。[0024]并且，該基因是序列表中序列I所不的DNA序列。[0025]目前，該與十字花科黑腐病菌致病相關(guān)的基因XC2038(以下簡(jiǎn)稱(chēng)XC2038基因)的序列已在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI,NationalCenterofBiotechnologyInformation)公布，其基因組序列號(hào)為NC_007086，該基因編碼蛋白序列號(hào)YP_243119;攜帶該基因的質(zhì)粒PCXC2038已在廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。[0026]序列表中序列I的DNA是十字花科黑腐病菌8004菌株的基因，由960個(gè)堿基組成，含完整的XC2038基因，自5’端的第498至875位核苷酸為該基因的0RF，自5’端的第498至500位核苷酸為該基因的起始密碼子ATG，自5’端的第876至878位核苷酸為終止密碼子TGA。[0027]序列表中序列2的蛋白質(zhì)是XC2038基因編碼的產(chǎn)物，由126個(gè)氨基酸組成。該蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)分子量為13926.73道爾頓，等電點(diǎn)為6.41。[0028]本發(fā)明通過(guò)以下方法步驟鑒定XC2038基因與十字花科黑腐病致病相關(guān):[0029](一)十字花科黑腐病菌突變體庫(kù)的構(gòu)建[0030]以大腸桿菌和Xcc之間的穿梭質(zhì)粒pLAFRl為載體將Tn5gusA5引入Xcc野生型菌株8004，然后通過(guò)引入不相容質(zhì)粒pPHlJI驅(qū)趕pLAFRl，通過(guò)卡那霉素作為抗生素，抗性標(biāo)記篩選Xcc::Tn5gusA5插入突變體，結(jié)合Xcc全基因組序列和TAIL-PCR(ThermalAsymetrixInterlaced-PCR)技術(shù),確定Tn5gusA5在基因組上的插入位置，并對(duì)插入位置進(jìn)行PCR驗(yàn)證。[0031]通過(guò)考察突變體的致病性、胞外酶活性、胞外多糖合成等表型的變化，篩選致病相關(guān)基因，本發(fā)明涉及其中一個(gè)新的致病相關(guān)基因，即XC2038基因(編碼假定蛋白)，其插入突變體編號(hào)為164H09(該編號(hào)為自命名編號(hào)，即十字花科黑腐病菌突變體庫(kù)的XC2038基因的插入突變體的編號(hào))。[0032](二)XC2038基因的克隆及序列測(cè)定[0033]根據(jù)XC2038的基因序列，設(shè)計(jì)引物(XC2038F:GGGGAATTCGCGCCAAGCAACGGACAGACG和XC2038R:GGGGGATCCAACACGACGCCGACCAGCACG)，以十字花科黑腐病菌8004菌株總DNA為模板，用PCR法擴(kuò)增該基因全長(zhǎng)序列，并將其克隆至克隆載體pGEM3Zf(+)中，用雙脫氧核苷酸法在ABI377DNA自動(dòng)測(cè)序儀上測(cè)定DNA核苷酸序列。將測(cè)序驗(yàn)證正確的XC2038基因序列克隆至穿梭載體PLAFRJ中，獲得了含該基因的重組質(zhì)粒PCXC2038。[0034]將該質(zhì)粒用EcoR1、BamHI酶切，除了一個(gè)22kb的載體條帶外，還有一個(gè)960bp的外源片段，請(qǐng)參見(jiàn)圖1，其中，Ml:A/HindIII2標(biāo)準(zhǔn)DNA，片段大小從大到小依次為:23.1kb,9.4kb，6.6kb，4.4kb，2.4kb，2.0kb；M2:IOObp標(biāo)準(zhǔn)DNA，片段大小從大到小依次為:3kb,2kb,1.5kb,1.2kb,lkb，0.9kb，0.8kb，07kb等；I為XC2038基因片段(960bp)。[0035](三)在XC2038基因插入突變體164H09的驗(yàn)證[0036]對(duì)插入突變體164H09進(jìn)行TAIL-PCR測(cè)序定位，發(fā)現(xiàn)其插在XC2038基因內(nèi)。[0037]用轉(zhuǎn)座子Tn5上spI側(cè)的一條引物(CCGCCGAAGAGAACACAGAITTA)和下游基因XC2037的一條引物(AGTTCGGAGGAATCACGCGG)配對(duì)進(jìn)行PCR驗(yàn)證，產(chǎn)物預(yù)期大小837bp。請(qǐng)參見(jiàn)圖2，其中，I為IOObp標(biāo)準(zhǔn)DNA；2為XC2038基因插入突變體164H09(837bp)。[0038](四)XC2038基因插入突變體164H09的胞外多糖、泳動(dòng)性及生物聚膜表型檢測(cè)[0039]將野生型菌株8004，XC2038突變體菌株164H09和互補(bǔ)菌株C164H09培養(yǎng)于NYGB培養(yǎng)基(每升含蛋白胨5.0g，酵母粉3.0g，甘油20.0g，pH7.0)中，28°C搖床過(guò)夜培養(yǎng)。[0040]對(duì)于胞外多糖的檢測(cè)用NYGB培養(yǎng)基將培養(yǎng)好的待測(cè)菌液的0D_值調(diào)為一致，用移液器精確取2iU的培養(yǎng)物，分別接種于含2%葡萄糖的NYGA(NYGB培養(yǎng)基加約3%的瓊脂粉)平板上，在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3天后再將該平板放置于培養(yǎng)箱外，見(jiàn)光培養(yǎng)2~5天，通過(guò)比較菌落的形態(tài)大小對(duì)EPS的產(chǎn)量進(jìn)行比較；[0041]對(duì)于泳動(dòng)性的檢測(cè)用NYGB培養(yǎng)基將培養(yǎng)好的待測(cè)菌液的0D_值調(diào)為一致，各菌體取5u1，點(diǎn)在0.3%瓊脂糖的NYGA平板上，28°C靜置培養(yǎng)48小時(shí)后觀察并照相記錄；對(duì)于生物聚膜的檢測(cè)用NYGB培養(yǎng)基將培養(yǎng)好的待測(cè)菌液的0D_值調(diào)為一致，按照10%的比例轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，28°C靜置培養(yǎng)5-7天后，觀察并記錄結(jié)果。[0042]結(jié)果表明，XC2038突變體菌株164H09影響胞外多糖的產(chǎn)量、菌株的泳動(dòng)性及生物聚膜的形成，而其互補(bǔ)株C164H09能很好的恢復(fù)至野生型的水平。由于胞外多糖的產(chǎn)量、菌株的泳動(dòng)性及生物聚膜的形成都是病原菌重要的致病生化因子，這說(shuō)明XC2038與致病相關(guān)；請(qǐng)參見(jiàn)圖3，其中，對(duì)象A為野生型；對(duì)象B為XC2038基因插入突變體164H09;對(duì)象C為XC2038基因插入突變體的互補(bǔ)株C164H09。[0043](五)XC2038基因插入突變體164H09后的致病性檢測(cè)[0044]試驗(yàn)所用寄主植物為蘿卜苗(種名為RaphanussativusL.var.radiculusPers.)，所用的接種方法為剪葉法。將野生型菌株8004、XC2038基因插入突變體164H09和互補(bǔ)菌株C164H09在28°C下進(jìn)行液體培養(yǎng)15-18小時(shí)。[0045]用NYGB稀釋至OD6tltl=0.001，用滅菌剪刀在菌液中浸泡5秒鐘后，在健康葉片距葉尖l-2cm垂直葉脈的方向剪到中軸處，停留5秒鐘，被接種的植物在25-30°C培養(yǎng)一周后觀察結(jié)果，正對(duì)照選用十字花科黑腐病菌8004菌株。[0046]上述致病試驗(yàn)表明，XC2038基因的插入突變體164H09的致病性為零，參見(jiàn)圖4，而突變體的互補(bǔ)株C164H09能將降低的致病性很好的恢復(fù)到野生型的水平。這說(shuō)明XC2038基因是一個(gè)重要的致病相關(guān)基因。在圖4中，對(duì)象A為野生型；對(duì)象B為XC2038基因插入突變體164H09;對(duì)象C為XC2038基因插入突變體164H09的互補(bǔ)株C164H09。[0047]在本發(fā)明的上述方法步驟中所用到的材料包括:[0048]大腸桿菌(Escherichiacoli)株系JM109；[0049]載體PCEM-3Zf(+)購(gòu)自Promega公司；[0050]pLAFRl、pPHlJ1、pLAFRJ為本研究室保存的(參見(jiàn)參考文獻(xiàn)7)柯斯質(zhì)粒；[0051]限制性內(nèi)切酶、修飾酶等試劑購(gòu)自Promega、Stratagene>QIAGEN公司、日本制藥株式會(huì)社?！緳?quán)利要求】1.一種與十字花科黑腐病病菌致病相關(guān)的基因在防治植物十字花科黑腐病病害中的用途，其特征在于，所述基因是編碼序列表中序列2所示蛋白質(zhì)的DNA序列。2.按照權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述基因是序列表中序列I所示的DNA序列?！疚臋n編號(hào)】C12R1/64GK103484535SQ201310265130【公開(kāi)日】2014年1月1日申請(qǐng)日期:2013年6月28日優(yōu)先權(quán)日:2013年6月28日【發(fā)明者】蔣國(guó)鳳,姜伯樂(lè),唐紀(jì)良,何勇強(qiáng),梁曉夏,杭小紅,韓路芬申請(qǐng)人:廣西大學(xué)