一種發(fā)酵谷物的乳酸菌及其用途
【專利摘要】本發(fā)明一種發(fā)酵谷物的乳酸菌及其用途，涉及食品生物【技術(shù)領(lǐng)域】。乳酸菌Dy-1，建議的分類名稱為植物乳桿菌，即Lactobacillusplantarum；該菌株于2012年4月18日送交位于中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)的中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCCNo.6016。利用上述乳酸菌凍干粉發(fā)酵麥胚或大麥，其發(fā)酵液經(jīng)離心所得上清液再經(jīng)冷凍干燥所獲得的發(fā)酵提取物，對(duì)HT-29結(jié)腸癌、SGC-7901胃癌細(xì)胞具有顯著的促進(jìn)凋亡和抑制增殖作用；對(duì)HT-29結(jié)腸癌誘發(fā)的荷瘤裸鼠模型具有顯著的抑制腫瘤生長和提高其免疫力的功能。
【專利說明】一種發(fā)酵谷物的乳酸菌及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及食品生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特指用于發(fā)酵小麥胚芽、大麥等谷物的乳酸菌，通過乳酸菌發(fā)酵實(shí)現(xiàn)谷物中營養(yǎng)物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化，制備具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤生長的發(fā)酵提取物。
【背景技術(shù)】 [0002]目前，中國因惡性腫瘤導(dǎo)致死亡的人數(shù)占全球的1/4，且數(shù)量仍在不斷攀升。而對(duì)于癌癥的治療主要有手術(shù)、化療、放療及祀向療法(免疫療法、基因療法、血管生成抑制劑及定向療法)等方式，其中藥物治療是目前的主要形式。但目前大量使用的抗腫瘤藥物具有較高的毒性和副作用，開發(fā)天然安全、無毒副作用的抗腫瘤活性物質(zhì)及其功能制品是癌癥患者的渴求。
[0003]天然谷物中的活性成分已經(jīng)被證實(shí)具有較好的抗腫瘤活性。日本專利(200510069392.8)公開了一種抗腫瘤制劑的制備方法。該方法是將麥胚芽、大豆胚芽、米胚芽等以一定的比例混合，將混合物用110°C熱蒸汽加熱，并將蒸汽加熱產(chǎn)物在30°C下用曲類(小麥曲霉)等發(fā)酵48h，所得的發(fā)酵提取物具有抗腫瘤效果，其抑制率在5%~15%，該專利未對(duì)發(fā)酵提取物中的抗腫瘤成分進(jìn)行分析。日本崇城大學(xué)Kouta Funamoto, et al.在2008年研究得出大麥燒酒蒸餾后的殘留物具有抗腫瘤和免疫活性，在體外能顯著抑制人肺癌細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，在體內(nèi)誘導(dǎo)能正常老鼠血清干擾素(IFN) - Y的產(chǎn)生，增加自然殺傷細(xì)胞(NK)的數(shù)量，通過尾靜脈注射，無急性毒性。
[0004]以谷物為原料結(jié)合微生物發(fā)酵技術(shù)提取抗腫瘤活性也日益引起人們的關(guān)注。美國專利(2010/135580A2)采用面包酵母對(duì)新鮮麥胚進(jìn)行發(fā)酵，將其上清液冷凍干燥成粉，干燥粉用乙醇提取并通過分子篩和電泳等方法獲得多肽，相對(duì)分子質(zhì)量在5~100KD之間。采用該范圍的多肽進(jìn)行腫瘤細(xì)胞和荷瘤動(dòng)物試驗(yàn)，具有減少腫瘤細(xì)胞或抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用。但總體來看，目前上述專利和文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于發(fā)酵產(chǎn)物的抗腫瘤研究，主要是采用酵母菌發(fā)酵，且其對(duì)腫瘤的抑制效果尚未達(dá)到令人滿意的效果。
[0005]利用乳酸菌發(fā)酵麥胚的產(chǎn)物主要可以抑制真菌的生長而采用乳酸菌發(fā)酵谷物獲得抗腫瘤提取物尚未見專利或其他文獻(xiàn)報(bào)道。乳酸菌(lactic acid bacterium,LAB)安全無毒，無致病性，無致癌性，已在世界范圍內(nèi)被公認(rèn)為“GRAS”等級(jí)的食品微生物，與機(jī)體的健康息息相關(guān)。目前的報(bào)道已證實(shí)乳酸菌具有預(yù)防與治療腫瘤的功能，但其功效尚有待進(jìn)一步提高。篩選能發(fā)酵谷物并獲得具有高抑制腫瘤活力產(chǎn)物的乳酸菌，并驗(yàn)證其抗腫瘤活性，是一個(gè)全新的研究領(lǐng)域，具有廣闊的發(fā)展前景。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明提供的是一種以自然發(fā)酵泡菜為原料，通過篩選、分離、富集以及常規(guī)的理化分析，從中獲得一株發(fā)酵谷物取物具有抗腫瘤作用的乳酸菌。
[0007]采用該乳酸菌發(fā)酵麥胚和大麥，控制發(fā)酵條件，獲取發(fā)酵提取物，采用MTT、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期法研究其組分的體外抗腫瘤功能；采用荷瘤裸鼠模型(人源腫瘤細(xì)胞)研究該提取物體內(nèi)抗腫瘤功能。
[0008]本發(fā)明通過以下步驟實(shí)現(xiàn):
[0009]將采集到的泡菜樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶荻认♂?，涂布于MRS雙層平板上，恒溫箱中于30°C培養(yǎng)36h，待菌落長出來后進(jìn)行觀察，觀察平板的生長情況，選擇平板中菌落合適(30~300個(gè))和溶鈣圈明顯的便于挑取菌落的平板，記錄菌落特征，選擇菌落，挑取菌落。[0010]本發(fā)明乳酸菌Dy-1,其建議的分類名稱為植物乳桿菌，Lactobacillusplantarum ;該菌株于2012年4月18日送交位于中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)的中國科學(xué)院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為 CGMCC N0.6016。
[0011]乳酸菌利用MRS液體培養(yǎng)基活化、擴(kuò)大培養(yǎng)后，添加保護(hù)劑(20%脫脂乳、10%海藻糖、14%谷氨酸鈉、6%山梨醇和6%Vc)后利用真空冷凍干燥制備凍干粉，分裝于無菌真空包裝袋中密封保藏。
[0012]分別稱取篩分除雜后的新鮮麥胚和大麥，粉碎過30~140目篩，置于錐形瓶中，按照重量比1:6~1:15的比例加入蒸餾水，再加入乳酸菌到麥胚和水中，其中乳酸菌凍干粉占新鮮麥胚粉的質(zhì)量為2~8%，混合均勻；將錐形瓶用紗布封口，置于恒溫培養(yǎng)箱中，在20~40°C下發(fā)酵12~72h，其中優(yōu)選發(fā)酵溫度30~35°C，發(fā)酵24~48h后，發(fā)酵物在室溫下8000~15000rpm/min離心10~40min ;收集上清液,并將其進(jìn)行熱風(fēng)干燥、噴霧干燥或冷凍干燥，優(yōu)選冷凍干燥，從而獲得到發(fā)酵麥胚提取物和發(fā)酵大麥提取物。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
[0014](I)本發(fā)明利用自主分離的乳酸菌，制備具有抗腫瘤功能的發(fā)酵提取物，具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)。
[0015](2)本發(fā)明生產(chǎn)成本低，采用直投式發(fā)酵，方便快捷，安全穩(wěn)定，便于質(zhì)控。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1PCR產(chǎn)物電泳圖，
[0017]圖2LFWGE對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的生長抑制率，
[0018]圖3細(xì)胞凋亡圖譜，
[0019]圖4LFWGE濃度對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞周期的影響，
[0020]圖5LFWGE對(duì)荷瘤裸鼠瘤體積的影響，
[0021]圖6LFWGE對(duì)荷瘤裸鼠腫瘤的抑制率，
[0022]圖7FBE對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的生長抑制率，
[0023]圖8FBE對(duì)荷瘤裸鼠瘤體積的影響，
[0024]圖9FBE對(duì)荷瘤裸鼠腫瘤的抑制率。
【具體實(shí)施方式】
[0025]1.乳酸菌的篩選過程
[0026]( I)初篩
[0027]將采集到的泡菜樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶荻认♂?，涂布于MRS雙層平板法，恒溫箱中于30°C培養(yǎng)36h，待菌落長出來后進(jìn)行觀察，觀察平板的生長情況，選擇平板中菌落合適(30~300個(gè))和溶鈣圈明顯的便于挑取菌落的平板，記錄菌落特征，選擇菌落，挑取菌落。
[0028](2)菌株初篩
[0029]將分離得到的菌株進(jìn)行多次劃線或涂布分離，以獲得純菌株。從穿刺保存中挑取少量菌，進(jìn)行革蘭氏染色，通過顯微觀察，對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行記錄，檢查分得菌株是否是純菌株，同時(shí)通過對(duì)菌株的形狀進(jìn)行觀察，測(cè)定細(xì)菌大小，進(jìn)行初步鑒定。對(duì)不純的菌再次富集和分離，方法同上。
[0030](3)菌株復(fù)篩
[0031]通過產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗(yàn)對(duì)分得的菌株的產(chǎn)酸能力進(jìn)行比較，以獲得產(chǎn)酸量高的菌株；同時(shí)通過觀察同時(shí)產(chǎn)酸和產(chǎn)氣的菌株，以獲得潛在的兼性厭氧乳酸菌。
[0032]從記錄的菌落的情況，選擇純的桿狀或鏈狀的革蘭氏陽性菌，在糖發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗(yàn)，接種后恒溫箱內(nèi)25°C恒溫培養(yǎng)48h，然后用pH計(jì)測(cè)定pH值。
[0033]2.菌種鑒定
[0034]( I)形態(tài)學(xué)觀察
[0035]從泡菜中分離出三株產(chǎn)酸量最大的菌株在固體培養(yǎng)基上菌落凸起、圓形、邊緣整齊、表面光滑呈白色。在液體培養(yǎng)基中生長后混濁，兼性厭氧。革蘭氏染色觀察(見表1)，均為革蘭氏陽性，細(xì)菌為桿狀，單個(gè)或成對(duì)排列為多，少數(shù)成短鏈；菌體圓端直桿狀，寬0.8~
1.2 μ m，長I~2μπι單個(gè)或成對(duì)排列，不形成內(nèi)生芽孢。下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述。
[0036](2)生理生化試 驗(yàn)結(jié)果
[0037]從自然發(fā)酵甘藍(lán)中分離出產(chǎn)酸最高三株菌株，對(duì)其進(jìn)行生理生化鑒定(見表2)，結(jié)果表明，它們的精氨酸產(chǎn)氨試驗(yàn)、產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)均為陰性。乳酸定性試驗(yàn)顯示，均產(chǎn)生乳酸。在糖發(fā)酵試驗(yàn)中(見表3)，不發(fā)酵鼠李糖，部分弱發(fā)酵阿拉伯糖和松三糖，其余的糖醇均能發(fā)酵，均不產(chǎn)氣，經(jīng)鑒定該三株菌都是植物乳桿菌(Lactobacillus Plantarum)。選擇發(fā)酵性能較好的Dy-1進(jìn)行16srDNA擴(kuò)增。
[0038](3) 16s rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖
[0039]挑取Dy-1菌適量，加入MRS培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜，取ImL均液，5000X g離心5min，棄去上清液后加入300 μ L細(xì)胞裂解液和50 μ L蛋白酶K，90°C水浴裂解IOmin后，12000Xg離心IOmin取上清液，以v3通用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物電泳圖如圖1所示。
[0040]PCR產(chǎn)物純化后交由上海生工測(cè)序，序列如下:
[0041 ] CTTGCAGTTCGAACGAACTTCTTGGTATCTGATCTGGTGCTTTGCATCATGATTTACATCC TGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATA ACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGTTTGA AAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGT AACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGG ACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGA CGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTC TGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAG AAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTC CGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTT CGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAG TGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAG GCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATT AGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAaCGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGa AACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAA GCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCG
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[0042]通過在Genbank中Blast分析結(jié)果可知，Dy-1的16S rRNA基因序列與Lactobacillus plantarum strain L3的16S rRNA基因序列只有3個(gè)喊基的差異且相似性為 99% 以上，應(yīng)屬于同一種即:Lactobacillus plantarum。
[0043]3.用途
[0044](I)發(fā)酵谷物提取物的體外抗腫瘤作用:將本發(fā)明的乳酸菌發(fā)酵小麥胚芽或大麥，其提取物以0.125~4mg/mL的濃度加入到人的HT-29結(jié)腸癌、SGC-7901胃癌細(xì)胞中，培養(yǎng)一段時(shí)間(如48h)，觀察評(píng)價(jià)其抗腫瘤效果。其方法如下:
[0045]①細(xì)胞增殖試驗(yàn):采用MTT法。
[0046]②細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期試驗(yàn):采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。
[0047]與未加本發(fā)明發(fā)酵麥胚提取物的情況相比較，腫瘤活細(xì)胞數(shù)可降至50%或以下，最優(yōu)的可使活細(xì)胞數(shù)降至10%或以下；其腫瘤凋亡率可達(dá)50%或以上，最高可達(dá)90%或以上。
[0048](2)發(fā)酵谷物提取物的體內(nèi)抗腫瘤作用:將4~6周齡的BALB/c裸鼠的腹部皮下接種人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞(接種量:I X IO6~2 X IO7細(xì)胞/裸鼠)，2~15天后肉眼可見裸鼠接種部位有腫瘤長出后開始灌胃乳酸菌發(fā)酵麥胚或大麥的提取物；將荷瘤裸鼠隨機(jī)分成
5組，即陰性對(duì)照組、5-FU陽性對(duì)照組、高劑量組、低劑量組和高劑量組+5-FU組，每組10~12只裸鼠，連續(xù)灌胃14~50天；每日測(cè)定瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，根據(jù)腫瘤重量計(jì)算抑瘤率。
[0049]與陰性對(duì)照組相比較，灌胃組的抑瘤率可達(dá)30%~60%。
[0050]實(shí)施例1
[0051]稱取粉碎的新鮮麥胚粉20.0g于500mL錐形瓶中，向其中加入IOOml的蒸懼水,再加入0.4g的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum Dy-1),混合均勻；將錐形瓶用紗布封口，置于恒溫培養(yǎng)箱中在30°C下發(fā)酵24h后，將其在12000rpm/min下離心20min收集上清液進(jìn)行冷凍干燥，得到發(fā)酵麥胚提取物(LFWGE)
[0052]稱取0.5g的LFWGE溶于50ml的去離子水中，過0.22um的濾膜，將濾液按照0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、l.0mg/mL、2.0mg/ml>4.0mg/ml 分別加入到 HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞中，培養(yǎng)細(xì)胞24h、48h、72h，并分別通過MTT法測(cè)定LFWGE對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的抑制率(圖2)。結(jié)果表明，提取物濃度與腫瘤細(xì)胞增殖抑制率呈正相關(guān)，最大抑制率達(dá)到94.2%ο
[0053]將1.0mg/mL的LFWGE加入到結(jié)腸癌細(xì)胞中，培養(yǎng)細(xì)胞48h后，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡(圖3)。結(jié)果表明，早期凋亡是66.5% (圖2，右下角)，晚期凋亡是27.6%(圖2，右上角)。將0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.8mg/mL的LFWGE加入到結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中，培養(yǎng)細(xì)胞48h后，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期(圖4)。結(jié)果表明，隨著濃度的增加，G1期也隨之延長，而S期則隨之縮短，說明LFWGE能有效阻滯細(xì)胞的G1期。
[0054]實(shí)施例2 [0055]將上述制備的LFWGE溶解于生理鹽水中，制備成濃度為0.2g/ml和0.lg/ml水溶液，并且通過無菌膜處理備用。人HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞接種到4-6周齡的BALB/c裸鼠腹部皮下，2 天后采用 2g/kg/d、lg/kg/d、2g/kg/d+5-FU (25mg/kg/d, 1.p, 7 天)劑量的 LFWGE 給荷瘤裸鼠灌胃，連續(xù)灌胃30天，同時(shí)與灌胃相同劑量的生理鹽水組和腹腔注射(25mg/kg/d, 1.p，7天)的5-FU組進(jìn)行比較，通過測(cè)定瘤體積的變化和最后的抑瘤率來確定LFWGE的抗腫瘤效果(圖5，6)。結(jié)果表明，2g/kg/d、lg/kg/d、2g/kg/d+5-FU LFWGE劑量組的抑瘤率分別達(dá)到 49.37%、40.7%, 47.8%。
[0056]實(shí)施例3
[0057]稱取粉碎過60目篩的大麥粉20.0g于500mL錐形瓶中，向其中加入1:6比例的水混合均勻，先用0.015%的β -葡聚糖酶40°C水解30min，再用4%的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum Dy-1)在30 °C下發(fā)酵48h,發(fā)酵完成后將FBE在室溫下6000rpm/min離心20min，收集上清液，并將其進(jìn)行冷凍干燥24h，從而獲得到發(fā)酵大麥提取物(FBE)。
[0058]稱取0.5g的FBE溶于50ml的去離子水中，過0.22um的濾膜,將濾液按照0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、l.0mg/mL、2.0mg/ml>4.0mg/ml 分別加入到 HT-29 腫瘤細(xì)胞中，培養(yǎng)細(xì)胞24h、48h、72h，并分別通過MTT法測(cè)定FBE對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的抑制率。結(jié)果表明，提取物濃度與腫瘤細(xì)胞增殖抑制率呈正相關(guān)，最大抑制率達(dá)到95.6%(圖7)。
[0059]實(shí)施例4
[0060]將上述制備的FBE溶解于生理鹽水中，制備成濃度為0.2g/ml和0.lg/ml，并且通過無菌膜處理備用。將人的HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞接種到4-6周齡的BALB/c裸鼠腹部皮下，2天后采用 2g/kg/d、lg/kg/d、2g/kg/d+5-FU (25mg/kg/d, 1.p,7 天)劑量的 FBE 給荷瘤裸鼠灌胃，連續(xù)灌胃30天，同時(shí)與灌胃相同劑量的生理鹽水組和腹腔注射(25mg/kg/d，7天)的5-FU組做比較，通過用游標(biāo)卡尺測(cè)量的移植瘤體積和最后的抑瘤率來確證FBE的抗腫瘤作用(圖8，9)。結(jié)果表明，2g/kg/d+5-FU混合劑量組的抑瘤率可達(dá)到53.36%。
[0061]表1分離得到產(chǎn)酸量最高的菌株的形態(tài)學(xué)特征
[0062]
【權(quán)利要求】
1.乳酸菌Dy-1,其建議的分類名稱為植物乳桿菌，;保藏編號(hào)為 CGMCC N0.6016。
2.乳酸菌的應(yīng)用，用于發(fā)酵小麥胚芽或大麥谷物。
【文檔編號(hào)】C12R1/25GK103468600SQ201310261606
【公開日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2013年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月26日
【發(fā)明者】董英, 程新, 崔恒林, 肖香, 伍靜 申請(qǐng)人:江蘇大學(xué)