專利名稱：一種鞣制動物標本皮張dna的提取方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物DNA技術領域，具體涉及一種鞣制動物標本皮張DNA的提取方法。
背景技術：
隨著科技的發(fā)展，DNA分子標記技術已廣泛應用于生物基因組研究，生物的遺傳育種、起源進化、分類、醫(yī)學及法醫(yī)破案等諸多方面，并成為現(xiàn)代分子遺傳學和分子生物學研究與應用的主流之一。這些都是針對DNA的研究，所以提取到高純度，高濃度的DNA是所有研究的基礎。對于動物DNA的提取，最常見的是從肌肉、血液以及各種內臟中獲得，因為這些組織的DNA含量多，組織處理較容易，提出的DNA片段較完整，適用于各種分子生物學研究。但是野生動物的分子遺傳學研究經常受到個體數(shù)量、樣品來源地的空間分布、樣品采集時間跨度等的限制。要獲得一些動物的肌肉、血液，或者內臟等實驗材料都是非常困難的，對于一些己經滅絕的動物來說，這根本就是不可能的。因此在進行分子生物學研究時，需要館藏鞣制動物標本來補充野外標本收集的不足。目前鞣制動物標本皮張DNA的提取采用的是常規(guī)的動物DNA的提取方法，但是實踐證明從標本中提取DNA往往是不可行的。因為這些標本大多都經過各種處理，含有大量水溶性重金屬離子、鞣劑等酶抑制劑等，對DNA提取會有一定程度的干擾，導致從這些樣品中提取的DNA量一般都比較少，在進行PCR擴增檢查DNA提取時，僅有不到10%能夠擴增出條帶，顯示提取到DNA。因此現(xiàn)有技術存在的問題是:DNA提取量小且有重金屬離子，PCR擴增結果低，不適用于進行分子生物學研究。發(fā)明內容:
本發(fā)明的目的是要提供一種高效的鞣制動物標本皮張DNA的提取方法，以克服現(xiàn)有技術存在的DNA提取量小且有重金屬離子，PCR擴增結果低，不適用于進行分子生物學研究的問題?！け景l(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的，一種鞣制動物標本皮張DNA的提取方法，依次包括下述步驟:
O原料的處理:
①將經過鞣制處理的動物標本皮張在常溫下用酒精浸泡，再用蒸餾水沖洗至無雜物備
用；
②剪取皮張，用Na2HPO4溶液在不斷振蕩條件下處理2(Γ28小時，用蒸餾水沖洗2 3遍；
2)消化:
將標本用浸泡液浸泡1.5^2.5小時，棄浸泡液，用剪刀盡量剪碎，置于離心管內，向離心管內加入500μ1消化液，24ul 0.5mol/L EDTA，6ul 20mg/ml蛋白酶K，在55°C下存放3-5小時；離心分離，取200 μ I上清液于另一離心管中；
所述浸泡液為 10mmol/L Tris - HC1、100mmol/L EDTAUOOmmoI/L NaCl, pH8.0 ；
3)分離、沉淀:
向離心管中加入200 μ ITris-飽和酚(ρΗ8.0)，輕輕地搖動混合8 12分鐘，離心分離，重復此步驟一次；將上清移至一個新的離心管中，再加入200 μ I氯仿，輕輕地搖動混合8^12分鐘，離心分離，取上清并重復此步驟一次；取上清移入一個新的離心管中，加入2.5倍體積的冷無水乙醇，輕輕地搖動片刻，置于冰箱中于-20 °C條件下冷凍25 35分鐘；離心分離，小心棄去上清；吸取200 μ L70%乙醇洗滌片刻，離心分離，小心棄去上清，室溫下打開離心管蓋,使乙醇蒸發(fā)10-20分鐘；用30 μ I TE (10 mmol/L Tris - HCl> 10 mmol/LEDTA, pH8.0)緩沖液室溫下溶解DNA沉淀；
4) 二次抽提:
向提取好的DNA溶液中加入7uL完全懸浮的DNA IQ 系統(tǒng)中的DNA IQ 樹脂，高速渦旋振蕩數(shù)秒鐘，并進行磁分離，分離結束后，將DNA溶液小心地轉移到容器中。上述步驟2)中消化液為Promega公司生產的Nuclei Lysis Sol’ η試劑。上述步驟4)中的磁分離步驟包括下述步驟:
①將管子放在磁分離架上，磁分離立刻進行。小心去除所有溶液，不要觸碰管壁上的樹月旨，加入100 μ L裂解緩沖液，從磁分離架上取下管子，并高速渦旋振蕩數(shù)秒，將管子放回到磁分離架上，并去除所有的裂解液；
②加入100μ L配制的I X洗滌液，從磁分離架上取下管子，并高速渦旋振蕩數(shù)秒，將管子放回到磁分離架上，去掉所有洗滌液；打開蓋子，將管子放在磁分離架上，空氣中干燥，加入25-100 μ L洗脫液，蓋上管蓋并高速渦旋振蕩數(shù)秒；
③65°C溫育51分鐘，取出溫育的管子，高速渦旋振蕩數(shù)秒，立即放到磁分離架上，分尚結束。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點是:
1、本發(fā)明可有效去除重金屬離子，產品濃度大，純度高，可以用來做PCR擴增等分子實驗，在進行PCR擴增檢測DNA時，有85%以上的樣品能夠擴增出條帶，顯示提取到DNA。2、本發(fā)明適用于所有經過鞣制處理的標本皮張，也可用于皮革制品的真假鑒定、非法貿易野生動物制品物種鑒定等也可用于皮革制品的真假鑒定、非法貿易野生動物制品物種鑒定等工作。
具體實施方式
:
下面將結合實施例對本發(fā)明進行詳細地說明。實施例1:
一種鞣制動物標本皮張DNA的提取方法，依次包括下述步驟 O原料的處理:
①將經過鞣制處理的林麝標本皮張在常溫下用酒精浸泡半小時，再用蒸餾水沖洗至無雜物備用；
②剪取約0.5 Cm2的皮張，用Iml 0.03M Na2HPO4溶液在不斷振蕩條件下處理24小時，用蒸餾水沖洗3遍；
2)消化:
將標本用浸泡液(10mmol/L Tris - HC1、100mmol/L EDTAUOOmmoI/L NaCl, pH8.0)浸泡2小時，棄浸泡液，用剪刀盡量剪碎，置于1.5ml離心管內，向離心管內加入500 μ I消化液(Promega 公司生產的 Nuclei Lysis Sol’η 試劑),24ul 0.5mol/L EDTA, 6ul 20mg/ml蛋白酶K，在55°C下存 放3小時；12000r/min離心5分鐘，取200 μ I上清液于另一離心管中；
3)分離、沉淀:
向離心管中加入200 μ ITris-飽和酚(ρΗ8.0)，輕輕地搖動混10分鐘，12000 r/min離心10分鐘，重復此步驟一次；將上清移至一個新的1.5ml離心管中，再加入200 μ I氯仿，輕輕地搖動混合10分鐘，12000 r/min離心10分鐘，取上清并重復此步驟一次；取上清移入一個新的1.5ml離心管中，加入2.5倍體積的冷無水乙醇，輕輕地搖動片刻，置于冰箱中于-20 °C條件下冷凍30分鐘；13000 r/min離心15 min,小心棄去上清；吸取200 μ L70%乙醇洗滌片刻，13000 r/min離心15分鐘，小心棄去上清，室溫下打開離心管蓋，使乙醇蒸發(fā)20分鐘；用 30μ1 TE (10 mmol/L Tris - HClUO mmol/L EDTA, ρΗ8.0)緩沖液室溫下溶解DNA沉淀；
4)二次抽提:
向提取好的DNA溶液中加入7uL完全懸浮的DNA IQ 系統(tǒng)中的DNA IQ 樹脂，高速渦旋振蕩3秒鐘，并進行磁分離，所述磁分離步驟包括下述步驟:
①將管子放在MagneSphere 磁分離架上，磁分離立刻進行，小心去除所有溶液，不要觸碰管壁上的樹脂，加入100 μ L裂解緩沖液，從磁分離架上取下管子，并高速渦旋振蕩2秒鐘，將管子放回到磁分離架上，并去除所有的裂解液；
②加入100μ L配制的I X洗滌液，從磁分離架上取下管子，并高速渦旋振蕩2秒鐘，將管子放回到磁分離架上，去掉所有洗滌液，打開蓋子，將管子放在磁分離架上，空氣中干燥5分鐘，加入25 μ L洗脫液，蓋上管蓋并高速渦旋振蕩2秒鐘。③65°C溫育5分鐘。取出溫育的管子，高速渦旋振蕩2秒鐘，立即放到磁分離架上。
分離結束后，將DNA溶液小心地轉移到選定的容器中。進行PCR擴增檢測DNA，顯示提取到DNA。實施例2:
一種鞣制動物標本皮張DNA的提取方法，依次包括下述步驟 O原料的處理:
①將經過鞣制處理的斑羚標本皮張在常溫下，用酒精浸泡40分鐘、再用蒸餾水沖洗至無雜物備用；
②剪取約Icm2的皮張，用5ml 0.03M Na2HPO4溶液在不斷振蕩條件下處理28小時，用蒸餾水沖洗3遍；
2)消化:
將標本用浸泡液(10mmol/L Tris - HC1、100mmol/L EDTAUOOmmoI/L NaCl, ρΗ8.0)浸泡2.5小時，棄浸泡液，用剪刀盡量剪碎，置于1.5ml離心管內，向離心管內加入500 μ I消化液(Promega 公司生產的 Nuclei Lysis Sol’η 試劑),24ul 0.5mol/L EDTA, 6ul 20mg/ml蛋白酶K，在55°C下存放5小時；12000r/min離心6分鐘，取200 μ I上清液于另一離心管中；
3)分離、沉淀:
向離心管中加入200 μ ITris-飽和酚(ρΗ8.0)，輕輕地搖動混10分鐘，12000 r/min離心8分鐘，重復此步驟一次；將上清移至一個新的1.5ml離心管中，再加入200 μ I氯仿，輕輕地搖動混合8分鐘，12000 r/min離心12分鐘，取上清并重復此步驟一次；取上清移入一個新的1.5ml離心管中，加入2.5倍體積的冷無水乙醇，輕輕地搖動片刻，置于冰箱中于-20 °C條件下冷凍35分鐘；13000 r/min離心12min，小心棄去上清；吸取200 μ L70%乙醇洗滌片刻，13000 r/min離心12分鐘，小心棄去上清，室溫下打開離心管蓋，使乙醇蒸發(fā)15分鐘；用 30μ I TE (10 mmol/L Tris - HClUO mmol/L EDTA，ρΗ8.0)緩沖液室溫下溶解 DNA沉淀；
4)二次抽提:
向提取好的DNA溶液中加入7uL完全懸浮的DNA IQ 系統(tǒng)中的DNA IQ 樹脂，高速渦旋振蕩2秒鐘，并進行磁分離，所述磁分離步驟包括下述步驟:
①將管子放在MagneSphere 磁分離架上，磁分離立刻進行，小心去除所有溶液，不要觸碰管壁上的樹脂。加入100 μ L裂解緩沖液，從磁分離架上取下管子，并高速渦旋振蕩3秒鐘，將管子放回到磁分離架上，并去除所有的裂解液；
②加入100μ L配制的I X洗滌液，從磁分離架上取下管子，并高速渦旋振蕩3秒鐘，將管子放回到磁分離架上，去掉所有洗滌液，打開蓋子，將管子放在磁分離架上，空氣中干燥8分鐘，加入IOOy L洗脫液，蓋上管蓋并高速渦旋振蕩3秒鐘；
③65°C溫育8分鐘。取出溫 育的管子，高速渦旋振蕩3秒鐘，立即放到磁分離架上。分離結束后，將DNA溶液小心地轉移到選定的容器中。進行PCR擴增檢測DNA，顯示提取到DNA。實施例3:
一種鞣制動物標本皮張DNA的提取方法，依次包括下述步驟 O原料的處理:
①將經過鞣制處理的金絲猴標本皮張在常溫下，用酒精浸泡25分鐘、再用蒸餾水沖洗至無雜物備用；
②剪取約0.8 cm2的皮張，用3ml 0.03M Na2HPO4溶液在不斷振蕩條件下處理24小時，用蒸餾水沖洗2遍；
2)消化:
將標本用浸泡液(10mmol/L Tris - HC1、100mmol/L EDTA、IOOmmoI/L NaCl, pH8.0)浸泡1.5小時，棄浸泡液，用剪刀盡量剪碎，置于1.5ml離心管內，向離心管內加入500 μ I消化液(Promega 公司生產的 Nuclei Lysis Sol’η 試劑),24ul 0.5mol/L EDTA, 6ul 20mg/ml蛋白酶K，在55°C下存放3小時；12000r/min離心5分鐘，取200 μ I上清液于另一離心管中；
3)分離、沉淀:
向離心管中加入200 μ ITris-飽和酚(ρΗ8.0)，輕輕地搖動混8分鐘，12000 r/min離心8分鐘，重復此步驟一次；將上清移至一個新的1.5ml離心管中，再加入200 μ I氯仿，輕輕地搖動混合8分鐘，12000 r/min離心12分鐘，取上清并重復此步驟一次；取上清移入一個新的1.5ml離心管中，加入2.5倍體積的冷無水乙醇，輕輕地搖動片刻，置于冰箱中于-20 °C條件下冷凍25分鐘；13000 r/min離心12min，小心棄去上清；吸取200 μ L70%乙醇洗滌片刻，13000 r/min離心12分鐘，小心棄去上清，室溫下打開離心管蓋，使乙醇蒸發(fā)15分鐘；用 30μ I TE (10 mmol/L Tris - HClUO mmol/L EDTA，ρΗ8.0)緩沖液室溫下溶解 DNA沉淀；
4)二次抽提:
向提取好的DNA溶液中加入7uL完全懸浮的DNA IQ 系統(tǒng)中的DNA IQ 樹脂，高速渦旋振蕩2秒鐘，并進行磁分離，所述磁分離步驟包括下述步驟:
①將管子放在MagneSphere 磁分離架上，磁分離立刻進行，小心去除所有溶液，不要觸碰管壁上的樹脂。加入100 μ L裂解緩沖液，從磁分離架上取下管子，并高速渦旋振蕩3秒鐘，將管子放回到磁分離架上，并去除所有的裂解液；
②加入100μ L配制的I X洗滌液，從磁分離架上取下管子，并高速渦旋振蕩3秒鐘，將管子放回到磁分離架上，去掉所有洗滌液，打開蓋子，將管子放在磁分離架上，空氣中干燥8分鐘，加入100 μ L洗脫液，蓋上管蓋并高速渦旋振蕩3秒鐘；
③65°C溫育8分鐘。取出溫育的管子，高速渦旋振蕩3秒鐘，立即放到磁分離架上。分離結束后，將DNA溶液小心地轉移到選定的容器中。進行PCR擴增檢 測DNA，顯示提取到DNA。
權利要求
1.一種鞣制動物標本皮張DNA的提取方法，其特征在于:依次包括下述步驟: O原料的處理: ①將經過鞣制處理的動物標本皮張在常溫下用酒精浸泡，再用蒸餾水沖洗至無雜物備用； ②剪取皮張，用Na2HPO4溶液在不斷振蕩條件下處理2(Γ28小時，用蒸餾水沖洗2 3遍； 2)消化:將標本用浸泡液浸泡1.5^2.5小時，棄浸泡液，用剪刀盡量剪碎，置于離心管內，向離心管內加入500μ1消化液，24ul 0.5mol/L EDTA，6ul 20mg/ml蛋白酶K，在55°C下存放3-5小時；離心分離，取200 μ I上清液于另一離心管中； 所述浸泡液為 10mmol/L Tris - HC1、100mmol/L EDTAUOOmmoI/L NaCl, pH8.0 ； 3)分離、沉淀: 向離心管中加入200 μ ITris-飽和酚(ρΗ8.0)，輕輕地搖動混合8 12分鐘，離心分離，重復此步驟一次；將上清移至一個新的離心管中，再加入200μ I氯仿，輕輕地搖動混合8 12分鐘，離心分離，取上清并重復此步驟一次；取上清移入一個新的離心管中，加入2.5倍體積的冷無水乙醇，輕輕地搖動片刻，置于冰箱中于-20 °C條件下冷凍25 35分鐘；離心分離，小心棄去上清；吸取200 μ L70%乙醇洗滌片刻，離心分離，小心棄去上清，室溫下打開離心管蓋,使乙醇蒸發(fā)10-20分鐘；用30 μ I TE (10 mmol/L Tris - HCl> 10 mmol/LEDTA, pH8.0)緩沖液室溫下溶解DNA沉淀； 4)二次抽 提: 向提取好的DNA溶液中加入7uL完全懸浮的DNA IQ 系統(tǒng)中的DNA IQ 樹脂，高速渦旋振蕩數(shù)秒鐘，并進行磁分離，分離結束后，將DNA溶液小心地轉移到容器中。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種鞣制動物標本皮張DNA的提取方法，其特征在于:所述步驟2)中消化液為Promega公司生產的Nuclei Lysis Sol’ η試劑。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的一種鞣制動物標本皮張DNA的提取方法，其特征在于:所述步驟4)中的磁分離步驟包括下述步驟: ①將管子放在磁分離架上，磁分離立刻進行，小心去除所有溶液，不要觸碰管壁上的樹脂，加入100 μ L裂解緩沖液，從磁分離架上取下管子，并高速渦旋振蕩數(shù)秒，將管子放回到磁分離架上，并去除所有的裂解液； ②加入100μ L配制的I X洗滌液，從磁分離架上取下管子，并高速渦旋振蕩數(shù)秒，將管子放回到磁分離架上，去掉所有洗滌液；打開蓋子，將管子放在磁分離架上，空氣中干燥，加入25-100 μ L洗脫液，蓋上管蓋并高速渦旋振蕩數(shù)秒； ③65°C溫育51分鐘，取出溫育的管子，高速渦旋振蕩數(shù)秒，立即放到磁分離架上，分尚結束。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鞣制動物標本皮張DNA的提取方法。DNA提取量小且有重金屬離子，PCR擴增結果低，不適用于進行分子生物學研究。本發(fā)明先將標本皮張在常溫下用酒精浸泡，再用蒸餾水沖洗至無雜物，用Na2HPO4溶液在不斷振蕩條件下處理20~28小時，用蒸餾水沖洗2~3遍；將標本用浸泡液浸泡1.5~2.5小時，置于離心管內，向離心管內加入500μl消化液，再進行離心分離、沉淀；二次抽提時加入7uL完全懸浮的DNAIQTM系統(tǒng)中的DNAIQTM樹脂，高速渦旋振蕩數(shù)秒鐘，并進行磁分離，分離結束后，將DNA溶液小心地轉移到容器中。本發(fā)明可有效去除重金屬離子，產品濃度大，純度高，適用于所有經過鞣制處理的標本皮張。
文檔編號C12N15/10GK103243089SQ20131019665
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月24日 優(yōu)先權日2013年5月24日
發(fā)明者馮成利, 馮慧, 任軼, 黨蕊葉, 蔣志武 申請人:陜西省動物研究所