專利名稱：利用線粒體scar標(biāo)記鑒別溫室白粉虱和煙粉虱的引物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用線粒體SCAR標(biāo)記鑒別溫室白粉虱和煙粉虱的引物及方法，特別涉及一種基于線粒體基因mt COI技術(shù)鑒別溫室白粉虱和煙粉虱的引物及方法，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
溫室白粉風(fēng)Trialeurodes vaporariorum (Westwood)在農(nóng)業(yè)上是一種重要的世界性害蟲，原產(chǎn)于北美，現(xiàn)分布在世界各地。溫室白粉虱繁殖力較強(qiáng)，世代重疊嚴(yán)重，短時間就可形成較大種群。以各蟲態(tài)在我國北方溫室中越冬并繼續(xù)危害，一年可發(fā)生10余代。已報道的寄主植物超過900種，包括番茄、煙草、黃瓜、茄子等。危害方式主要有:1)成、若蟲排泄蜜露污染葉片，影響光合作用；2)在寄主植物葉背面刺吸汁液，使葉片變黃、萎蔫至枯死；3)傳播多種病毒病。自20世紀(jì)70年代中期在我國北方地區(qū)爆發(fā)危害以來，該蟲一直是我國北方農(nóng)區(qū)的主要害蟲之一。近幾十年來，溫室和塑料大棚蔬菜為溫室白粉虱提供了冬季繁衍的良好環(huán)境，使得原本在露地不能越冬的害蟲有了大發(fā)生的可能。溫室和露地蔬菜生產(chǎn)相連接，使該蟲種群得以繁衍和周年發(fā)生，危害加重，成為我國北方蔬菜生產(chǎn)的重要影響因素之一。煙粉風(fēng)Bemisia tabaci (Gennadius)具有暴發(fā)性強(qiáng)、寄主譜廣、危害性大的特點，是世界性的入侵害蟲之一。近年來，隨著煙粉虱抗藥性的產(chǎn)生和傳播的番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)的擴(kuò)散，煙粉虱的危害愈加嚴(yán)重，甚至導(dǎo)致我國局部地區(qū)部分農(nóng)作物的絕產(chǎn)。當(dāng)前在我國廣大地區(qū)由于溫室白粉虱和煙粉虱危害習(xí)性、生活史相似，兩者常?；旌习l(fā)生；又因體型微小、外形相似，所以對于非專業(yè)人士來說區(qū)分兩種粉虱比較困難。另夕卜，以前雖有學(xué)者利用形態(tài)特征對兩種粉虱進(jìn)行辨別，但區(qū)分用無水乙醇保存的溫室白粉虱和煙粉虱或者是兩者的死 蟲對于粉虱研究專業(yè)人士來說也比較困難，所以急需要一種快速簡單的方法對兩種粉虱進(jìn)行準(zhǔn)確辨別。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，利用分子標(biāo)記技術(shù)可以快速準(zhǔn)確地鑒定出昆蟲種類。以前雖有學(xué)者利用核基因?qū)厥野追凼蜔煼凼M(jìn)行過研究(王金娜等，2012.溫室白粉虱SCAR分子鑒定技術(shù)的建立及應(yīng)用.環(huán)境昆蟲學(xué)報，34(3):295-301.)，但線粒體基因與核基因相比具有很大優(yōu)勢:1)結(jié)構(gòu)簡單，常無內(nèi)含子和基因間隔，從而基因組復(fù)制的時間縮短；2)屬于母系遺傳，物種鑒定時可排除復(fù)雜遺傳背景的干擾；3)基因組結(jié)構(gòu)組成比較保守，具有較好的可比較性。因此，利用線粒體基因mt COI對溫室白粉虱的基因組DNA擴(kuò)增重復(fù)性和穩(wěn)定性更好，且具有操作更為簡便、靈敏度更高、更易擴(kuò)增的優(yōu)點。分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物、動物、微生物以及昆蟲的物種檢測與鑒定、遺傳分化鑒定等方面。但利用線粒體基因mt COI鑒定溫室白粉虱與煙粉虱的方法目前還未見報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用線粒體SCAR標(biāo)記鑒別溫室白粉虱和煙粉虱的引物及方法。一種鑒別溫室白粉虱和煙粉虱的引物，所述引物為一對，分別為SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。正義引物CO1-F:5’ -GCCTGGTTTTGGCATTA-3，；SEQ ID N0.1反義引物CO1-R:5，-GCTTATTTAGCACCCACTCTA-3，；SEQ ID N0.2一種鑒別溫室白粉虱和煙粉虱的方法，步驟如下:(I)提取待鑒定樣品的基因組DNA，得基因組DNA溶液；(2)以步驟(I)制得的基因組DNA為模板，利用上述引物對基因組DNA中的線粒體mt COI基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；(3)對步驟(2)制得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，當(dāng)PCR產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測樣品有752bp的一條條帶時，則該被檢測樣品為溫室白粉虱；當(dāng)PCR產(chǎn)物電泳圖譜顯示無752bp的條帶時，則該被檢測樣品是煙粉虱。所述步驟(2)中PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增體系為:基因組DNA 溶液 2.5μ 1，20μΜ 引物 0.5μ l，5U/y I Taq 酶 0.25 μ 1，IOXTaqBuffer (緩沖液)2.5 μ 1，IOmM dNTP0.5 μ 1，ddH20 補(bǔ)至 25 μ I ；所述步驟(2)中PCR擴(kuò)增的擴(kuò)`增條件如下:94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸30秒，進(jìn)行35個循環(huán)；72°C延伸7分鐘。上述步驟(I)中提取溫室白粉虱和煙粉虱基因組DNA和步驟(3)中瓊脂糖凝膠電泳分析均按本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)操作。上述實驗步驟如無特別說明均可參見《分子克隆實驗指南》第三版(北京:科學(xué)出版社,2002)。有益效果1、本發(fā)明所述鑒別溫室白粉虱和煙粉虱的引物能夠擴(kuò)增溫室白粉虱基因組DNA中的線粒體基因mt COI，卻不能擴(kuò)增煙粉虱基因組DNA中的線粒體基因mt COI，為鑒定溫室白粉虱和煙粉虱提供了簡便穩(wěn)定的分子標(biāo)記，解決了區(qū)分溫室白粉虱和煙粉虱的難題。2、本發(fā)明從分子水平探索了溫室白粉虱和煙粉虱線粒體基因mt COI的不同，探索建立了區(qū)分溫室白粉虱和煙粉虱的鑒別技術(shù)，為今后溫室白粉虱和煙粉虱的種群動態(tài)鑒定、生物學(xué)以及入侵機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。
圖1是實施例1中PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中TV:溫室白粉虱；BT:煙粉虱；NX:寧夏；SD:山東；M:DL2000DNA Marker。圖2是實施例2中PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中TV:溫室白粉虱；BT:煙粉虱；GS:甘肅；LN:遼寧；M:DL2000DNA Marker。圖3是實施例3中PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中TV:溫室白粉虱；BT:煙粉虱；YN:云南JL:吉林；M:DL2000DNA Marker。
圖4是實施例4中PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中TV:溫室白粉虱；BT:煙粉虱；BJ:北京；QH:青海；M:DL2000DNA Marker。 圖5是實施例5中PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中TV:溫室白粉虱；BT:煙粉虱；HN:河南；HN1:湖南；M:DL2000DNA Marker。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例及說明書附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。實施例1中所述粉虱于2012年分別采集于山東、寧夏；按照(褚棟等，2008.一種快速鑒別煙粉虱與溫室白粉虱成蟲的方法一復(fù)眼鏡檢法，45 (I):154-155.)中記載的方法對上述粉虱進(jìn)行檢測，采集于山東、寧夏的粉虱分別為溫室白粉虱和煙粉虱。實施例2中所述粉虱于2012年分別采集于甘肅、遼寧；按照(褚棟等，2008.一種快速鑒別煙粉虱與溫室白粉虱成蟲的方法一復(fù)眼鏡檢法，45 (I):154-155.)中記載的方法對上述粉虱進(jìn)行檢測，采集于甘肅、遼寧的粉虱分別為溫室白粉虱和煙粉虱。實施例3中所述粉虱于2012年分別采集于云南、吉林；按照(褚棟等，2008.一種快速鑒別煙粉虱與溫室白粉虱成蟲的方法一復(fù)眼鏡檢法，45 (I):154-155.)中記載的方法對上述粉虱進(jìn)行檢測，采集于云南、吉林的粉虱分別為溫室白粉虱和煙粉虱。實施例4中所述粉虱于2012年分別采集于北京、青海；按照(褚棟等，2008.一種快速鑒別煙粉虱與溫室白粉虱成蟲的方法一復(fù)眼鏡檢法，45 (I):154-155.)中記載的方法對上述粉虱進(jìn)行檢測，采集于北京、青海的粉虱分別為溫室白粉虱和煙粉虱。實施例5中 所述粉虱于2012年分別采集于河南、湖南；按照(褚棟等，2008.一種快速鑒別煙粉虱與溫室白粉虱成蟲的方法一復(fù)眼鏡檢法，45 (I):154-155.)中記載的方法對上述粉虱進(jìn)行檢測，采集于河南、湖南的粉虱分別為溫室白粉虱和煙粉虱。實施例所述TriS-HCl、乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸鈉均購自上海生物工程公司，其它試劑均為普通市售產(chǎn)品。實施例1 (I)粉虱基因組DNA的提取將單頭待鑒定樣品置于含60 μ I堿裂解液的0.2ml的離心管中，堿裂解液為:50mmol.L^1Tris-HCl (ρΗ8.0)、20mmol.L-1NaCUlmmol.L-1EDTA (乙二胺四乙酸)、1%SDS(十二烷基硫酸鈉)，用封口槍頭充分研磨勻漿后，置于水浴鍋65°C水浴15min，然后在95°C水浴IOmin后，制得基因組DNA溶液。(2 )粉虱線粒體基因mt COI的PCR擴(kuò)增以步驟(I)制得的基因組DNA溶液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；PCR擴(kuò)增體系為:基因組DNA 溶液:3μ I ;20μΜ 引物:0.5μ I ;5υ/μ I Taq 酶:0.5μ I ;10XTaqBuffer:5 μ I ；10mM dNTP:1 μ I ；ddH20 補(bǔ)至 50 μ I ;引物序列如下:正義引物CO1-F:5’ -GCCTGGTTTTGGCATTA-3，；SEQ ID N0.1反義引物CO1-R:5，-GCTTATTTAGCACCCACTCTA-3，；SEQ ID N0.2
PCR擴(kuò)增條件如下:94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸30秒，進(jìn)行35個循環(huán)；72°C延伸7分鐘。(3)用2wt%瓊脂糖凝膠電泳對步驟(2)制得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。經(jīng)多個待鑒定樣品檢測，只有溫室白粉虱檢測出一長度在752bp的條帶(如圖1所示)，煙粉虱中均未檢測出長度在752bp條帶，經(jīng)檢測，序列如SEQ ID N0.3所示。實施例2一種鑒別溫室白粉虱和煙粉虱的方法，步驟如下:(I)將分別采集于甘肅、遼寧的單頭粉虱個體置于含60 μ I堿裂解液的0.2ml的離心管中，喊裂解液為:50mmol.L 1Tris-HCl (pH8.0)、20mmol.L 1NaCl、lmmol.L 1EDTA'1%SDS，用封口槍頭充分研磨勻漿后，置于水浴鍋65°C水浴15min，然后在95°C水浴IOmin后，得基因組DNA溶液；(2)以步驟(I)制得的基因組DNA為模板，對基因組DNA中的線粒體基因mt COI序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；PCR擴(kuò)增體系為:基因組DNA 溶液 2μ 1，20μΜ 弓 I 物 0.5 μ l,5U/y ITaq 酶 0.25 μ 1，IOXTaqBuffer2.5 μ 1，IOmM dNTP0.5 μ 1，ddH20 補(bǔ)至 25 μ I ；引物序列如下:正義引物CO1-F:5’ -GCCTGGTTTTGGCATTA-3，；SEQ ID N0.1反義引物CO1-R:5，-GCTTATTTAGCACCCACTCTA-3，；SEQ ID N0.2PCR擴(kuò)增條件如下:94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸30秒，進(jìn)行35個循環(huán)；72°C延伸7分鐘。(3)用2被％瓊脂糖凝膠電泳對步驟(2)制得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，成像膠片上有一條片段長度752bp的條帶，該粉虱為溫室白粉虱；其他粉虱在成像膠片上均無752bp的條帶，結(jié)果如圖2所示。與按照(褚棟等，2008.—種快速鑒別煙粉虱與溫室白粉虱成蟲的方法一復(fù)眼鏡檢法，45(1): 154-155.)中記載的方法進(jìn)行檢測的結(jié)果一致。實施例3如實施例2所述的鑒別溫室白粉虱和煙粉虱的方法，不同之處在于，所述粉虱于2012年分別采集于云南、吉林。結(jié)果顯示，成像膠片上有一條片段長度752bp的條帶，該粉虱為溫室白粉虱；其他粉虱在成像膠片上均無752bp的條帶，結(jié)果如圖3所示。與按照(褚棟等，2008.—種快速鑒別煙粉虱與溫室白粉虱成蟲的方法一復(fù)眼鏡檢法，45(1):154-155.)中記載的方法進(jìn)行檢測的結(jié)果一致。實施例4如實施例2所述的鑒別溫室白粉虱和煙粉虱的方法，不同之處在于，所述粉虱于2012年分別采集于北京、青海。結(jié)果顯示，成像膠片上有一條片段長度752bp的條帶，該粉虱為溫室白粉虱；其他粉虱在成像膠片上均無752bp的條帶，結(jié)果如圖4所示。與按照(褚棟等，2008.—種快速鑒別煙粉虱與溫室 白粉虱成蟲的方法一復(fù)眼鏡檢法，45(1):154-155.)中記載的方法進(jìn)行檢測的結(jié)果一致。
實施例5如實施例2所述的鑒別溫室白粉虱和煙粉虱的方法，不同之處在于，所述粉虱于2012年分別采集于河南、湖南。結(jié)果顯示，成像膠片上有一條片段長度752bp的條帶，該粉虱為溫室白粉虱；其他粉虱在成像膠片上均無752bp的條帶，結(jié)果如圖5所示。與按照(褚棟等，2008.—種快速鑒別煙粉虱與溫室白粉虱成蟲的方法一復(fù)眼鏡檢法，45(1):154-155.)中記載的方法進(jìn)行檢測的結(jié)果一致 。
權(quán)利要求
1.一種利用線粒體基因mt COI標(biāo)記鑒別溫室白粉虱和煙粉虱的引物，所述引物為一對，分別為SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
2.一種利用線粒體基因mt COI標(biāo)記鑒別溫室白粉虱和煙粉虱的方法，其特征在于，步驟如下: (1)提取待鑒定樣品的基因組DNA，得基因組DNA溶液； (2)以步驟(I)制得的基因組DNA為模板，利用上述引物對基因組DNA中的線粒體基因mt COI進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； (3)對步驟(2)制得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，當(dāng)PCR產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測樣品有752bp的一條條帶時，則該被檢測樣品為溫室白粉虱；iPCR產(chǎn)物電泳圖譜顯示無752bp的條帶時，則該被檢測樣品為煙粉虱。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增體系為: 基因組 DNA 溶液 2.5 μ 1，20 μ M 引物 0.5 μ l,5U/y I Taq 酶 0.25 μ 1，IOXTaq 緩沖液2.5 μ 1，IOmM dNTP0.5 μ 1，ddH20 補(bǔ)至 25 μ I ；
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增條件如下: 94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸30秒，進(jìn)行35個循環(huán)；72 °C延伸7分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用線粒體SCAR標(biāo)記鑒別溫室白粉虱和煙粉虱的引物及方法。所述引物分別為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。所述方法步驟如下(1)提取粉虱基因組DNA；(2)以粉虱基因組DNA為模板對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)對步驟(2)制得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。本發(fā)明為鑒別溫室白粉虱和煙粉虱提供了簡便穩(wěn)定的分子標(biāo)記，為今后粉虱的種群動態(tài)鑒定、生物學(xué)以及入侵機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/11GK103255222SQ20131019272
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月22日
發(fā)明者褚棟, 陶云荔, 國棟, 姜德鋒 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)