專利名稱：斜帶石斑魚(yú)干擾素IFNγ1及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及干擾素領(lǐng)域，更具體地，涉及斜帶石斑魚(yú)干擾素IFNY I及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干擾素(IFN)是一組具有多種功能的活性蛋白質(zhì)(主要是糖蛋白)，在細(xì)胞和機(jī)體受病毒感染或其他誘導(dǎo)劑作用后由單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。根據(jù)同源性及受體特異性的不同，迄今為止，發(fā)現(xiàn)3類(lèi)干擾素:I型、II型和III型。其中II型IFN (IFNy )也被稱為免疫干擾素，是主要的巨噬細(xì)胞刺激因子和調(diào)控免疫反應(yīng)的關(guān)鍵信號(hào)分子，能激活效應(yīng)細(xì)胞，提高自然殺傷細(xì)胞(NK)和巨噬細(xì)胞活性，促進(jìn)免疫球蛋白的轉(zhuǎn)換，具有抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等作用。干擾素IFN Y I和IFN Y 2基因是魚(yú)類(lèi)IFN Y基因的兩個(gè)亞型，其氨基酸序列的特征是含有[IV]-Q-X-[KQ]-A-X2-E- [LF]_X2_[IV]這個(gè)保守結(jié)構(gòu),這與已研究過(guò)的其他種類(lèi)中的IFNy結(jié)構(gòu)類(lèi)似。IFNy具有廣泛的生物學(xué)活性。IFNy主要通過(guò)與其受體結(jié)合，活化JAK-STAT信號(hào)通路，激活下游基因的 轉(zhuǎn)錄，包括相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和免疫分子，如STATU IRFU TLR3和MHC II等，調(diào)節(jié)T細(xì)胞的增殖和分化以及增強(qiáng)抗原提呈作用，達(dá)到保護(hù)宿主的目的。IFNy是體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)因子，其免疫調(diào)節(jié)作用是通過(guò)以下幾方面實(shí)現(xiàn)的。IFNy促進(jìn)MHC I類(lèi)及II類(lèi)抗原的加工提呈，能夠從多方面上調(diào)細(xì)胞表面MHC I類(lèi)分子的表達(dá)，IFNy通過(guò)上調(diào)MHC II類(lèi)抗原提呈提升⑶4 + T細(xì)胞的肽特異性活性通過(guò)上調(diào)MHC I類(lèi)抗原的提呈途徑增加細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)對(duì)病原體的敏感性，使CTL更有效地將病原體清除；IFNy是主要的巨噬細(xì)胞活化因子，其對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能包括:介導(dǎo)T細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞的激活，直接誘導(dǎo)參與呼吸爆發(fā)酶的合成，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞殺傷微生物的能力等；此外，IFNy也是Thl細(xì)胞的主要產(chǎn)物，而且能夠進(jìn)一步使免疫反應(yīng)向Thl表型轉(zhuǎn)化其能夠使靜止的⑶4+ T細(xì)胞分化為T(mén)hl細(xì)胞，同時(shí)抑制Th2細(xì)胞的增殖IFN將天然免疫反應(yīng)與獲得性免疫反應(yīng)橋連起來(lái)，其能夠協(xié)調(diào)天然免疫細(xì)胞識(shí)別病原體，并誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)的發(fā)生。IFNy的這種協(xié)調(diào)由固有免疫反應(yīng)向獲得性免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)化的能力是其他干擾素所不具備的。IFNy的廣譜抗病毒作用主要是通過(guò)與細(xì)胞表面受體的結(jié)合，誘導(dǎo)病毒感染細(xì)胞產(chǎn)生多種抗病毒蛋白，使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生抗病毒狀態(tài)從而發(fā)揮抗病毒作用，其抗病毒作用是非特異性的。IFNy主要的效應(yīng)分子有雙鏈RNA依賴的蛋白激酶R(PKR )、Mx 2' -5'寡腺苷酸合成酶(2' -5' OAS)、核糖核酸酶L (RNase L)系統(tǒng)等。PKR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在與dsRNA結(jié)合后被激活，活化的PKR可使蛋白合成起始因子eIF-2及核因子抑制因子IkB磷酸化，從而抑制病毒和細(xì)胞蛋白的合成，起到抗病毒的作用；Mx能夠通過(guò)干擾某些負(fù)鏈病毒核酸片段向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)及某些病毒蛋白的功能而抑制病毒的增殖'2' -5'寡腺苷酸合成酶能夠使ATP聚合為2' -5'寡腺苷酸，激活核糖核酸酶L降解ssRNA，從而干擾病毒復(fù)制。在誘導(dǎo)效應(yīng)因子表達(dá)的同時(shí)，由于IFNy能夠提高細(xì)胞表面MHC分子的表達(dá)，增強(qiáng)免疫活性細(xì)胞對(duì)病原體的殺傷作用，從而協(xié)同促進(jìn)了機(jī)體對(duì)病毒感染細(xì)胞的殺滅，而使機(jī)體處于抗病毒狀態(tài)雖然各種類(lèi)型的干擾素均能介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)病毒感染的反應(yīng)，但I(xiàn)FN Y的免疫調(diào)節(jié)活性在協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)和確定機(jī)體長(zhǎng)期的抗病毒狀態(tài)中發(fā)揮更為重要的作用。與哺乳動(dòng)物相似，魚(yú)類(lèi)IFN Y重組蛋白能夠影響刺激免疫細(xì)胞的增殖，增加IFN Y自身的基因表達(dá)，以及誘導(dǎo)下游免疫基因，如MHC II和Mx基因的表達(dá)。Mx是IFN系統(tǒng)中熟為人知的抗病毒蛋白，作為一種GTP酶，它主要通過(guò)干擾病毒的聚合酶來(lái)抑制RNA的復(fù)制，從而發(fā)揮抗病毒的作用。它主要受I型IFN誘導(dǎo)大量表達(dá)發(fā)揮其作用，II型IFN對(duì)其有一定的誘導(dǎo)作用。重組的IFNy可影響魚(yú)類(lèi)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。初步研究的結(jié)果表明，一定濃度的重組虹鱒IFNy在RTS-11 cells中會(huì)促進(jìn)下游免疫基因IPlO和MHC II β的表達(dá)。近年來(lái)魚(yú)類(lèi)病害發(fā)生頻繁，其中某些疾病給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成災(zāi)難性的危害，這就使得免疫防治技術(shù)在魚(yú)病防治中呈現(xiàn)出日趨廣闊的應(yīng)用前景。IFNy由于其抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等作用在哺乳動(dòng)物中的應(yīng)用已非常廣泛，對(duì)人的臨床應(yīng)用治療疾病方面也已很普遍。而其在魚(yú)類(lèi)的研究與應(yīng)用才開(kāi)始起步，可以預(yù)測(cè)其具有廣闊的應(yīng)用前景。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有魚(yú)類(lèi)免疫防治方法中沒(méi)有干擾素蛋白IFNy的缺陷，提供一種新的魚(yú)類(lèi)干擾素IFNy I基因及其編碼蛋白。首先提供斜帶石斑魚(yú)干擾素IFNY I的基因序列，所述的基因的核苷酸序列如SEQID NO:2 所示。進(jìn)一步的提供斜帶石斑魚(yú)干擾素IFNy I重組蛋白，所述的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1 所示。根據(jù)需求再提供一種斜帶石斑魚(yú)干擾素IFNY I重組表達(dá)載體，所述的重組表達(dá)載體的核苷酸序列中，含有如SEQ ID Ν0:2所示的核苷酸序列。根據(jù)需求再提供一種根斜帶石斑魚(yú)干擾素IFNY I的基因序列的獲取方法，以斜帶石斑魚(yú)頭腎總mRNA為模板，以RNA Oligo dT為引物，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA ;再以此cDNA為模板，設(shè)計(jì)上游引物及下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即得。所述的RNA Oligo dT的序列如SEQ ID N0:3所示。所述的上游引物的序列如SEQ ID N0:4所示。所述的下游引物的序列如SEQ ID NO: 5所示。根據(jù)所述的重組蛋白，再提供一種斜帶石斑魚(yú)干擾素IFNy I重組蛋白的生產(chǎn)方法，包括以下步驟:
51.構(gòu)建含干擾素IFNY I的基因序列的重組表達(dá)載體；
52.將步驟SI得到的重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化入工程菌中；
53.培養(yǎng)工程菌，使得工程菌中的重組表達(dá)載體表達(dá)干擾素IFNyI重組蛋白；
54.提取干擾素IFNY I重組蛋白，純化；
步驟SI所述的構(gòu)建含干擾素IFN Y I的基因序列的重組表達(dá)載體，包括以下步驟:
Sll.以含斜帶石斑魚(yú)干擾 素IFNy I編碼基因的質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)分別帶有酶切位點(diǎn)的上下游引物，PCR擴(kuò)增，所述的帶有酶切位點(diǎn)的上游引物的序列如SEQ ID N0:6所示，所述的酶切位點(diǎn)的下游引物的序如SEQ ID N0:7所示；
S12.將步驟Sll所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到原核表達(dá)載體pET22b上，即得含干擾素IFNyl的基因序列的重組表達(dá)載體。步驟S3所述培養(yǎng)工程菌的條件為:將單菌落接種至5ml含100 μ g/mL氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基，37°C，250rpm振蕩過(guò)夜培養(yǎng)，取過(guò)夜培養(yǎng)物以1: 100比例接種于含氨芐青霉素抗性的新鮮LB培養(yǎng)基中，370C，250rpm培養(yǎng)至0D600達(dá)到約0.6，加入誘導(dǎo)終濃度為
0.6mmol/L的IPTG，25°C、250rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)7小時(shí)后離心收集菌體。步驟S4所述的提取和純化為將總菌體用Native Binding Buffer洗漆后，再用Native Binding Buffer重懸，經(jīng)超聲處理，高速離心獲得裂解上清液，固定化金屬配體親和層析純化，收集蛋白洗脫峰，經(jīng)ro-1o脫鹽柱脫鹽處理，獲純化蛋白。步驟S2和S3所述的工程菌為大腸桿菌，優(yōu)選為BL21菌株。根據(jù)提供的重組蛋白，再提供一種含所述的斜帶石斑魚(yú)干擾素IFNY I重組蛋白天然魚(yú)類(lèi)免疫增強(qiáng)劑或免疫佐劑。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下效益:
本發(fā)明利用斜帶石斑魚(yú)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合分子生物學(xué)方法設(shè)計(jì)了特異引物，PCR擴(kuò)增克隆得到IFNy I基因的ORF序列，并構(gòu)建原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中培養(yǎng)，可大量表達(dá)斜帶石斑魚(yú)干擾素IFN Y I基因所編碼的蛋白。本發(fā)明中斜帶石斑魚(yú)重組IFN Y I蛋白能夠上調(diào)頭腎細(xì)胞中的MHC II和TLR3基因的表達(dá)，豐富了魚(yú)類(lèi)干擾素的系統(tǒng)信號(hào)通路理論，能為相關(guān)魚(yú)類(lèi)免疫增強(qiáng)劑的研發(fā)提供一定的理論依據(jù)，IFNy I蛋白還可作為增強(qiáng)魚(yú)類(lèi)免疫的餌料添加劑適用 于水產(chǎn)養(yǎng)殖。
圖1為斜帶石斑魚(yú)干擾素IFN Y I氨基酸序列與部分脊椎動(dòng)物IFN Y氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果圖。圖2為斜帶石斑魚(yú)干擾素IFN Y I成熟肽編碼序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果。圖3為基因IFN Y I的重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。圖4.斜帶石斑魚(yú)干擾素IFN Y I重組蛋白表達(dá)和純化的SDS-PAGE (A)及Western雜交⑶分析圖。圖5.斜帶石斑魚(yú)IFN Y I對(duì)頭腎免疫細(xì)胞中MHC II和TLR3基因表達(dá)的影響。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明采用的試劑、設(shè)備和方法為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)市購(gòu)的試劑、設(shè)備和常規(guī)使用的方法。實(shí)施例1.斜帶石斑魚(yú)干擾素IFNy I的克隆
1.斜帶石斑魚(yú)頭腎總RNA的提取
取健康斜帶石斑魚(yú)全魚(yú)，以冰浴麻醉約2 min后，殺魚(yú)取樣，分離頭腎組織，采用Trizol試劑法抽提獲得斜帶石斑魚(yú)頭腎總RNA，其0D260/280 = 1.91。2.cDNA第一鏈的合成取I μ g斜帶石斑魚(yú)頭腎總RNA樣品進(jìn)行DNA酶處理以去除基因組DNA的污染，與RNAOligo dT (序列如SEQ ID NO:3所示)混合，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所得產(chǎn)物置于-20°C保存?zhèn)溆谩?.斜帶石斑魚(yú)IFNy I基因cDNA全序列的克隆
根據(jù)斜帶石斑魚(yú)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息，在IFNy開(kāi)放讀碼框拼接序列兩端設(shè)計(jì)特異引物，上游引物序列如SEQ ID N0:4，下游引物序列如SEQ ID NO: 5，以步驟2合成的第一鏈cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小為567 bp。電泳分離DNA片段，切膠回收目的產(chǎn)物。將純化后的目的產(chǎn)物連接至PTZ57R/T載體，轉(zhuǎn)化DH5 α大腸桿菌，挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序。經(jīng)BLAST同源性分析表明，目的產(chǎn)物確為IFN Y I基因的cDNA序列片段。 實(shí)施例2.斜帶石斑魚(yú)干擾素IFN Y I重組蛋白的表達(dá)
1.重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
以含有IFN Y I編碼基因的pTZ57R/T質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)含有NdeI酶切位點(diǎn)的上游引物SEQ ID N0:6和含有XhoI酶切位點(diǎn)的下游引物SEQ ID NO: 7，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到產(chǎn)物大小在550 bp左右的單一條帶，電泳結(jié)果如圖2所示，其中，M為DNA Marker, I為帶有酶切位點(diǎn)的IFN Y I核苷酸目的片段。將斜帶石斑魚(yú)干擾素IFN Y I的成熟肽編碼序列克隆至原核表達(dá)載體pET-22b上，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET22b-1FN Y 1，(其構(gòu)建過(guò)程如圖3所示)。表達(dá)載體中的外源基因序列經(jīng)測(cè)序鑒定無(wú)誤。2.斜帶石斑魚(yú)干擾素IFNy I基因的原核表達(dá)
將步驟I中構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)?；蚬こ叹?jīng)誘導(dǎo)后超聲裂解得到上清液，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析表明，菌株在受IPTG誘導(dǎo)后有明顯特異表達(dá)產(chǎn)物帶，與軟件估算的含有His標(biāo)簽的IFNy I重組蛋白分子量大小相近，結(jié)果如圖5所示，其中A為IFNy I對(duì)MHC II基因表達(dá)的影響，B為IFN Y I對(duì)TLR3基因表達(dá)的影響，*表示與對(duì)照組有顯·著差異(P〈0.05)。對(duì)誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑量等條件的優(yōu)化得出基因工程菌的最佳培養(yǎng)條件為:接單菌落至5ml的含氨芐青霉素LB的液體培養(yǎng)基中，37°C，250 rpm，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；按1: 100體積比接種到150ml 37°C預(yù)熱的含氨芐青霉素TB液體培養(yǎng)基中，37°C，250 rpm，培養(yǎng)至0D600達(dá)到約0.6 ;加入IPTG至終濃度0.6mM,在25°C條件下，對(duì)IFN Y I蛋白表達(dá)工程菌誘導(dǎo)7h，可獲得最大的可溶性重組蛋白表達(dá)量。3.斜帶石斑魚(yú)干擾素IFN Y I重組蛋白的提取和純化
將IFN Y I蛋白表達(dá)工程菌總菌體用Native Binding Buffer洗漆，再用NativeBinding Buffer重懸，超聲處理后，裂解上清液進(jìn)行固定化金屬配體親和層析純化，收集蛋白洗脫峰，SDS-PAGE分析重組蛋白的表達(dá)和純化結(jié)果。斜帶石斑魚(yú)干擾素IFN Y I重組蛋白能被鎳金屬親和層析柱所吸附，用含不同濃度咪唑洗脫緩沖液洗鎳層析柱時(shí)，能把目的蛋白洗下，經(jīng)脫鹽后獲得斜帶石斑魚(yú)干擾素IFN Y I重組蛋白，結(jié)果如圖4所示其中，M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，1:未誘導(dǎo)總菌；2:誘導(dǎo)后總菌；3:上清裂解液；4:漂洗液；5 — 7 ;分別為150/200/250mM咪唑洗脫液；8:脫鹽后蛋白(A) ；ffestern分析結(jié)果(B)。實(shí)施例3.實(shí)施例2所得的斜帶石斑魚(yú)干擾素IFN Y I重組蛋白對(duì)免疫相關(guān)基因表達(dá)影響的活性分析
對(duì)迅速冷凍麻醉的實(shí)驗(yàn)魚(yú)取樣，剪取頭腎組織，浸泡于適量RPMI1640培養(yǎng)基中，并置于冰上；將頭腎組織置于超凈工作臺(tái)內(nèi)稍微剪碎，剔走結(jié)締組織后，用烘好的磨砂玻片磨砂面進(jìn)行研磨，磨至末狀；將磨好的細(xì)胞與培養(yǎng)基一起過(guò)Cell strainer (BD Falcon, 70 μ m,Nylon)并轉(zhuǎn)移至50ml離心管中:離心，棄上清液，加入RPMI 1640培養(yǎng)基2ml重懸細(xì)胞，洗滌，離心后用完全培養(yǎng)基(RPMI 1640 含 2 mM L-glutamine, 10% FBS 和 1% penicillin /streptomycin)2 ml重懸細(xì)胞,將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至I X IO7 /mL,分別向6孔培養(yǎng)板各孔中加入2 mL上述細(xì)胞懸浮液；分別向各分組孔中加入終濃度為I ng/mL, 10 ng/mL和100 ng/mLIFNy I蛋白的完全培養(yǎng)基2 mL，并設(shè)置陰性對(duì)照組(細(xì)胞懸浮液和完全培養(yǎng)基各2 mL)。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于27°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，孵育4 h后收集各孔細(xì)胞，Real Time-PCR檢測(cè)IFNy I蛋白對(duì)MHC II和TLR3基因表達(dá)的影響。其中MHC II基因表達(dá)所用引物上游引物序列如SEQ ID NO: 10，下游引物序列如SEQ ID NO: 11 ;TLR3基因表達(dá)所用引物上游引物序列如SEQ ID NO: 12，下游引物序列如SEQ ID N0:13o 18S rRNA作為內(nèi)參基因來(lái)校正各模板起始cDNA量，18S rRNA基因片段的上游引物序列如SEQ ID NO: 8，下游引物序列如SEQ IDN0:9。每組3個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù)用平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤表示，*表示與對(duì)照組有顯著差異(P〈0.05)，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果顯示，在斜帶石斑魚(yú)頭腎細(xì)胞中，10 ng/ml的IFNy I蛋白孵育4小時(shí)后能顯著上調(diào)MHC II和TLR3的mRNA水平，而高濃度的蛋白則對(duì)MHC II和TLR3的轉(zhuǎn)錄沒(méi)有顯著性影響。表明二者的轉(zhuǎn) 錄與蛋白濃度之間不呈現(xiàn)明顯的濃度依賴效應(yīng)，高濃度的蛋白并不能上升MHC II和TLR3的的表達(dá)水平。
權(quán)利要求
1.斜帶石斑魚(yú)干擾素IFNYI的基因序列，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2 所示。
2.斜帶石斑魚(yú)干擾素IFNyI重組蛋白，其特征在于，所述的蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:1 所示。
3.斜帶石斑魚(yú)干擾素IFNY I重組表達(dá)載體，其特征在于，所述的重組表達(dá)載體的核苷酸序列中，含有如SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的斜帶石斑魚(yú)干擾素IFNy I的基因序列的獲取方法，其特征在，以斜帶石斑魚(yú)頭腎總mRNA為模板，以RNA Oligo dT為引物，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA ;再以此cDNA為模板，設(shè)計(jì)上游引物及下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即得， 所述的RNA Oligo dT的序列如SEQ ID NO:3所示， 所述的上游引物的序列如SEQ ID N0:4所示， 所述的下游引物的序列如SEQ ID NO:5所示。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求2所述的斜帶石斑魚(yú)干擾素IFN Y I重組蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括以下步驟: 51.構(gòu)建含干擾素IFNY I的基因序列的重組表達(dá)載體； 52.將步驟SI得到的重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化入工程菌中； 53.培養(yǎng)工程菌，使得工程菌中的重組表達(dá)載體表達(dá)干擾素IFNyI重組蛋白； 54.提取干擾素IFNY I重組蛋白，純化。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的的斜帶石斑魚(yú)干擾素IFNY I重組蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟SI所述的構(gòu)建含干擾素IFN Y I的基因序列的重組表達(dá)載體，包括以下步驟: 511.以含斜帶石斑魚(yú)干擾素IFNyI編碼基因的質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)分別帶有酶切位點(diǎn)的上下游引物，PCR擴(kuò)增，所述的帶有酶切位點(diǎn)的上游引物的序列如SEQ ID N0:6所示，所述的酶切位點(diǎn)的下游引物的序如SEQ ID N0:7所示； 512.將步驟Sll所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到原核表達(dá)載體pET22b上，即得含干擾素IFNyl的基因序列的重組表達(dá)載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的的斜帶石斑魚(yú)干擾素IFNY I重組蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟S3所述培養(yǎng)工程菌的條件為:將單菌落接種至5ml含100 μ g /mL氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基，37°C，250rpm振蕩過(guò)夜培養(yǎng)，取過(guò)夜培養(yǎng)物以1: 100比例接種于含氨芐青霉素抗性的新鮮LB培養(yǎng)基中，37°C，250rpm培養(yǎng)至0D600達(dá)到0.6，加入誘導(dǎo)終濃度為0.6mmol/L的IPTG，25°C、250rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)7小時(shí)后離心收集菌體。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的的斜帶石斑魚(yú)干擾素IFNyI重組蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟S4所述的提取和純化為將總菌體用Native Binding Buffer洗漆后，再用Native Binding Buffer重懸，經(jīng)超聲處理，高速離心獲得裂解上清液，固定化金屬配體親和層析純化，收集蛋白洗脫峰，經(jīng)ro-1o脫鹽柱脫鹽處理，獲純化蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的的斜帶石斑魚(yú)干擾素IFNY I重組蛋白的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟S2和S3所述的工程菌為大腸桿菌。
10.一種天然魚(yú)類(lèi)免疫增強(qiáng)劑或免疫佐劑，其特征在于，包括根據(jù)權(quán)利要求2所述的斜帶石斑魚(yú)干擾 素IFN Y I重組蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及斜帶石斑魚(yú)干擾素IFNγ1基因及其編碼的蛋白，以及該蛋白在制備一種新的免疫增強(qiáng)劑的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)篩選以及設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增的方法，從斜帶石斑魚(yú)頭腎總RNA中克隆得到IFNγ1基因的開(kāi)放讀碼框，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，所編碼蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本發(fā)明的斜帶石斑魚(yú)干擾素IFNγ1蛋白經(jīng)初步驗(yàn)證能夠誘導(dǎo)相關(guān)免疫基因表達(dá)，可開(kāi)發(fā)為天然魚(yú)類(lèi)免疫增強(qiáng)劑或免疫佐劑。
文檔編號(hào)C12R1/19GK103243106SQ20131016628
公開(kāi)日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月8日
發(fā)明者盧丹琪, 孫艷, 李若竹, 彭彎, 張勇, 林浩然 申請(qǐng)人:中山大學(xué)