專利名稱：一種恢復(fù)SAMe合成酶活力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腺苷甲硫氨酸合成酶酶活恢復(fù)的方法，具體涉及一種經(jīng)多次使用的腺苷甲硫氨酸合成酶經(jīng)處理后使其活力恢復(fù)的方法，屬于生物制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
中國是人口大國，同時也是“肝炎大國”。據(jù)1992年全國病毒性肝炎流行病學調(diào)查，全國約有1.2億人攜帶乙型肝炎病毒，丙型肝炎在一般人群中感染率為3.1%。我國現(xiàn)有2000萬例慢性乙型肝炎患者，其中部分有可能轉(zhuǎn)化為肝硬化，甚至肝癌。腺苷甲硫氨酸(SAMe)是人體內(nèi)一種極為重要的中間代謝產(chǎn)物。它可以通過轉(zhuǎn)硫途徑生成體內(nèi)關(guān)鍵的抗氧化及解毒物質(zhì)——半胱氨酸，再生成另一種關(guān)鍵的抗氧化和解毒物質(zhì)一谷胱甘肽，解除肝內(nèi)的氧化物應(yīng)激狀態(tài)，從而達到防治肝病的目的。另外SAMe還可以促進依賴性脂磷脂的合成，降低膽固醇和磷脂的比例，恢復(fù)細胞膜的流動性，促進膽汁的主動轉(zhuǎn)運和甘油酸三脂的分泌。因此SAM對肝內(nèi)膽汁郁積、各種急、慢性肝炎以及脂肪肝、肝硬化等肝臟疾病有很好的療效。SAMe于20世紀80年代出現(xiàn)在歐洲醫(yī)藥市場上，1999年美國FDA正式批準SAMe上市，使其迅速成為暢銷的營養(yǎng)保健品之一，年銷售額超過10億美元。由于其療機理清楚、效顯著、起效快、副作用小，近年來在國內(nèi)的需求量也越來越大，有廣闊的市場前景。目前，SAMe的生產(chǎn)方法主要有化學合成法、發(fā)酵法和酶促轉(zhuǎn)化法3種?；瘜W合成法采用S —腺苷同型半胱氨酸(S — adenosythomocysteine)和甲基供體(CH3I)合成，腺苷甲硫氨酸有(R, S)和(S, S)兩種構(gòu)型，只有(S, S)構(gòu)型才有生物活性，但合成產(chǎn)物中含有大量(R，S)腺昔甲硫氨酸，且難以分離，合成產(chǎn)率也低。發(fā)酵法采用在培 養(yǎng)基中添加L 一甲硫氨酸，用酵母發(fā)酵生產(chǎn)(一)型腺苷甲硫氨酸，是60年代至80年代生產(chǎn)腺普甲硫氨酸的主要方法，但發(fā)酵法的缺點是終產(chǎn)物積累量低、原料轉(zhuǎn)化率低、產(chǎn)品生產(chǎn)周期長以及SAM的純化工藝復(fù)雜等，從而導致了腺苷甲硫氨酸的價格居高不下，限制了 SAM的廣泛生產(chǎn)機應(yīng)用。酶促轉(zhuǎn)化法主要利用腺苷甲硫氨酸合成酶催化底物L 一甲硫氨酸和ATP生成(一)型腺昔甲硫氨酸。酶作為生物催化劑具有快速、專一的特點，因此酶促轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)腺苷甲硫氨酸具有高效、工藝簡單、產(chǎn)品生物活性高且無污染的優(yōu)勢。但是，SAMe合成酶在動物、植物和微生物中含量少、酶活低，且分離純化困難，因此通過酶促轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)SAMe受到SAMe合成酶活力的限制，基因工程的發(fā)展使獲得大量高活性的SAMe合成酶成為可能，利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建高效表達SAMe合成酶的基因工程菌，重組菌表達SAMe合成酶活性為野生菌的幾十倍到上百倍，經(jīng)初步分離純化后的游離酶可用于體外SAMe的合成，但游離酶不穩(wěn)定，容易失活。固定化酶技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項技術(shù)，它是模擬體內(nèi)酶的作用方式，通過化學或無力的手段，用載體將酶束縛或限制在一定的區(qū)域內(nèi)，使酶分子在此區(qū)域進行特有和活躍的催化作用，并可回收及重復(fù)使用。盡管固定化技術(shù)可多次重復(fù)利用SAMe合成酶，但經(jīng)使用一定次數(shù)后，其酶活會大大降低，導致合成SAMe能力下降。下降的SAMe合成酶，大都被丟棄處理，導致資源浪費，生產(chǎn)SAMe的成本升高。
發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有技術(shù)中利用SAMe合成酶合成SAMe時，多次使用后酶活降低而產(chǎn)能下降、成本升高的問題，本發(fā)明，本發(fā)明的目的在于提供一種恢復(fù)經(jīng)多次使用后的SAMe合成酶活性的方法，多次使用后酶活降低的SAMe合成酶，經(jīng)本發(fā)明方法處理后，其酶活可恢復(fù)到相當于初始酶活的水平。本發(fā)明所述方法，通過配置復(fù)蘇液，將活性下降的SAMe合成酶室溫下在復(fù)蘇液中浸泡處理而得。本發(fā)明中，所述的復(fù)蘇液，由摩爾濃度為0.5-5mM的底物ATP、0.5_5mM的底物L-甲硫氨酸、0.001%-0.1% (重量)載體，所述載體選自海藻糖、殼聚糖、葡聚糖、蔗糖、明膠或PEG40、0.01%-0.5% (V/V)的表面活性劑，及以及摩爾濃度為0.01-0.5mM其它金屬離子鹽如含Mg2+、K+的鹽組成。更為優(yōu)選地，所述載體為海藻糖，所述表面活性劑為吐溫20，所述金屬離子的鹽為
鹽酸鹽。
具體地，本發(fā)明恢復(fù)活力下降的腺苷甲硫氨酸合成酶活力的方法包括:(I)配置復(fù)蘇液；(2)將經(jīng)過多次反應(yīng)而導致活力下降的SAMe合成酶用水沖洗干凈，并于室溫下置于復(fù)蘇液中，攪拌3-6小時；；(3)濾去液體，得到復(fù)蘇后的SAMe合成酶；本發(fā)明中，在酶促反應(yīng)步驟中，反應(yīng)底物中進一步還包括金屬離子鹽，比如含Mg2+、K+的金屬鹽，可以是氯化鎂、硫酸鎂、硼酸鉀、硼酸鈉等。經(jīng)復(fù)活后的SAMe合成酶，催化生產(chǎn)腺苷甲硫氨酸，ATP的轉(zhuǎn)化率幾乎與之前的第一批酶活相當，效果明顯。具體是實施例本發(fā)明通過下述實施例進一步闡明，但任何實施例或其組合不應(yīng)當理解為對本發(fā)明的范圍或?qū)嵤┓绞降南拗?。本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定，結(jié)合本說明書和本領(lǐng)域一般常識，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以清楚地明白權(quán)利要求書所限定的范圍。在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行任何修改或改變，這種修改和改變也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。主要材料所用工程菌:重組大腸埃希氏菌(攜帶腺苷甲硫氨酸合成酶的metK基因)，公司自主構(gòu)建，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCN0.2299，并已在中國專利申請CN101392230A中公開記載。實施例1利用含腺苷甲硫氨酸合成酶的基因菌種發(fā)酵制備腺苷甲硫氨酸合成酶一、發(fā)酵液的配制:按以下配方分別配制種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基和補料培養(yǎng)基:⑴種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)(％):蛋白胨:酵母粉:氯化鈉=2:1:2
⑵發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/lOOml培養(yǎng)基):
葡萄糖:1.47蛋白胨:0.4
酵母粉:0.55磷酸二氫鉀:0.4
磷酸氫二鉀:0.3磷酸氫二納:0.35
硫酸銨:0.047硫酸鎂:0.05
氣化銨:0.01硫酸亞鐵:0.002
氣化鈣:0.002硫酸錳:0.0007 200mg/ml 氧化四環(huán)素:0.0125 ( V/V)⑶補料培養(yǎng)基(g/100ml培養(yǎng)基):葡萄糖:1.12酵母粉:0.55硫酸鎂:0.035二、發(fā)酵過程:⑴將含有重組菌的甘油種以1:100的比例接入一級種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)中，37°C、180rpm搖床培養(yǎng)約8個小時。
⑵將一級種子液以1:20的比例接入二級種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)中，37°C、180rpm搖床培養(yǎng)約8個小時。⑶將二級種子液以1:6接入種子罐，37°C、溶氧40 60、ΡΗ7.0。⑷當種子罐中菌液的0D600=1.5 2.0時，按1:10的比例接入發(fā)酵罐中發(fā)酵，發(fā)酵條件為溫度37°C、溶氧60 90、PH7.0。(5)在大罐開始發(fā)酵I個小時后開始以流加的方式補料。(6)發(fā)酵的過程中監(jiān)控發(fā)酵液的PH值、0D600、溶氧、濁度等各項參數(shù)。發(fā)酵過程如下表所示:
權(quán)利要求
1.一種恢復(fù)SAMe合成酶活力的方法，所述方法通過將已使用后活性降低的SAMe合成酶浸泡在配置好的復(fù)蘇液中，并于室溫浸泡并攪拌后濾去液體，所述復(fù)蘇液是由摩爾濃度為0.5-5mM的底物ATP、0.5_5mM的L-甲硫氨酸，質(zhì)量濃度為0.001%_0.1%的載體，所述載體選自海藻糖、殼聚糖、葡聚糖、蔗糖、明膠或PEG40，摩爾濃度為0.01-0.5mM的金屬離子鹽、濃度為0.01%-0.5% (V/V)的表面活性劑組成。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述載體為質(zhì)量濃度為0.01%-0.1%海藻糖。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述金屬離子鹽為Mg2+或/和K+的鹽酸鹽，所述Mg2+的摩爾濃度為0.05-0.2mM，所述K+的摩爾濃度為0.01-0.1mM。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述表面活性劑是濃度為0.01%-0.5% (V/V)的吐溫-20。
5.權(quán)利要求1-5中任意一權(quán)利要求所述的方法，具體包括如下步驟: (1)配置復(fù)蘇液，所述復(fù)蘇液由所述的復(fù)蘇液，由0.5-5mM的ATP、0.5_5mM的L-甲硫氨酸、0.001%-0.1% (重量)的海藻糖、0.01%-0.5% (V/V)的吐溫20及以及0.05-0.2mM的MgCl2、0.01-0.1mM 的 KCl 組成； (2)將經(jīng)過多次反應(yīng)而導致活力下降的SAMe合成酶用水沖洗干凈，并于室溫下置于復(fù)蘇液中，攪拌3-6小時； (3)濾去液體，得到復(fù)蘇 后的SAMe合成酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種恢復(fù)活力下降的SAMe合成酶活力的方法，將經(jīng)多批次反應(yīng)后并且活力下降的固定化酶置事先配置好的復(fù)蘇液中處理，并于室溫下攪拌，濾去液體，即可將活力下降的酶的活力再一次提高。
文檔編號C12N9/10GK103224917SQ201310155528
公開日2013年7月31日 申請日期2013年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月28日
發(fā)明者付大雁 申請人:北京凱因科技股份有限公司