專利名稱：香蕉MYB轉(zhuǎn)錄因子MaMYB的克隆及表達(dá)載體構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及香蕉中MYB轉(zhuǎn)錄因子基因MaMYB的克隆、重組及對(duì)逆境脅迫反應(yīng)功能的分析和應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
表皮毛(trichome)是由表皮細(xì)胞發(fā)育而來的植物表面特有的一種結(jié)構(gòu),根據(jù)形態(tài)不同，可分為單細(xì)胞或多細(xì)胞、有分支或無分支、有腺體或無腺體，同種植物可能有多種不同類型的表皮毛。作為植物的天然屏障，表皮毛可以增加表皮厚度，減少熱量和水分的散失，減弱紫外線、干旱、輻射、有毒物質(zhì)等非生物脅迫對(duì)植物的傷害，并可以保護(hù)植物器官免受昆蟲、病原體的侵害及部分機(jī)械損傷。MYB類轉(zhuǎn)錄因子是指存在MYB結(jié)構(gòu)域的一類基因，這類基因廣泛參與植物次生代謝、激素應(yīng)答、抗逆反應(yīng)、組織分化及毛狀體發(fā)育等過程。根據(jù)基因序列中MYB結(jié)構(gòu)域重復(fù)數(shù)目的不同，可分為MYB1R，R2R3MYB, MYB3R三種類型，高等植物絕大多數(shù)MYB屬于第二類，研究表明決定表皮毛發(fā)育起始的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一即為MYB基因。擬南芥中，GLl是最早被鑒定調(diào)控表皮毛起始的R2R3-MYB基因，該基因在表皮毛早期發(fā)育中表達(dá)。其突變體表現(xiàn)為葉片表皮毛減少或缺失，同時(shí)，該基因過量表達(dá)也會(huì)抑制表皮毛的發(fā)育，使表皮毛數(shù)量減少，表明它對(duì)表皮毛的啟動(dòng)還存在一定的負(fù)調(diào)控作用。目前，還沒有關(guān)于香蕉MYB類基因的報(bào)道。通過抑制差減雜交(SSH)從香蕉中克隆得到一個(gè)597bp的片段，BLAST對(duì)比顯示其與其他植物的MYB基因具有較高的同源性，帶有兩個(gè)典型的SANT結(jié)構(gòu)域，可以推斷獲得的序列為一個(gè)新的香蕉MYB基因。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，果實(shí)發(fā)育初期，果皮無毛時(shí)MaMYB基因在野生型與突變體中的表達(dá)水平幾乎一致，隨著果實(shí)的發(fā)育，果皮逐漸出現(xiàn)表皮毛，MaMYB的表達(dá)量開始升高，但是野生型的表達(dá)水平明顯高于突變體中的表達(dá)水平，說明MaMYB可能影響了表皮毛的發(fā)育。為了進(jìn)一步了解MaMYB基因功能，將該基因轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片表皮毛有所減少，花器官缺少表皮毛，進(jìn)一步說明MaMYB的高表達(dá)影響了香蕉果皮表皮毛的發(fā)育。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首次從香蕉中分離出MaMYB基因的全長cDNA。一、香焦MaMYB基因的克隆以巴西蕉(Musa spp.)為材料,利用CTAB法提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,設(shè)計(jì)全長cDNA擴(kuò)增引物:5 ’ 端引物:5 ’ AGAAGAAGCGAGGGGGAGG3，3 ’ 端引物:5 ’ CAAATAGGACTAGGAAATGGGAG3，PCR體系及條件為:
權(quán)利要求
1.香蕉MYB轉(zhuǎn)錄因子MaMYB，其特征在于其核苷酸序列為:CGGGGACTGC ACTGCAACAA GGAGAGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAGAAGAAGCGAGGG GGAGGAACAT GGGGAGATCG CCATGCTGCG AGAAAGCTCACACCAACAAG GGTGCATGGA CCAAGGAGGA GGACGAGCGC CTCATCGCTCACATCCGAGC CCACGGAGAG GGCTGCTGGC GTTCCCTCCC CAAGGCCGCCGGTCTGCTCC GGTGCGGCAA GAGCTGCCGC CTTCGGTGGA TCAACTACCTCCGCCCCGAC CTCAAGCGCG GCAACTTCAC CGAGGAAGAG GACGAGCTCATCATCAAGCT CCACAGTCTC TTAGGCAACA AATGGTCGCT GATCGCTGCAAGACTCCCCG GGAGAACGGA CAACGAGATT AAGAACCACT GGAACACACACATCAGGCGG AAGCTACTGA GTCGAGGAGT GGATCCTGCG ACCCACCGGCCGGTCAACGA CCGCCCGCCA TCTAACATTA CAATCTCCTT CGAGAGGAGAGAGGGGAAGG CGGTCGGCGG CAGCGAGGAG TCATCGGTAT GGCAGCAGCAGACCCAGCGT CCGGACCTCA ACCTGGAGCT GTGCATAAGC CTTCCCTTCCAACAAGACCC CCATGAGCTC ACCAAGAGGG AGAAGAGCCT CTGTTTCAGCTGCAGCTTGG GGTCGCAGAA CAGCAAGGAG TGCAAGTGCC GAGACTTCTCCGGCCTCAGC AATGGAATGT TGAGCTACAG AGGCCTGAAG ATGAAGTAAATGCAGACAAA AGACAATCTG GGATAAGAGA T GAGGGAGAG GAATAAGAGGATCTCTTAGC TTCTAATTCA ACAGCCTCTC CCATTTCCTA GTCCTATTTGGAATTTGGTG TTTTGTTTCT TTTGTACAAT TATGAGCAGA TATAATACCAGATGATCAGC TACCATGAAC TTTAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA。
2.包含權(quán)利要求1所述的香蕉MYB轉(zhuǎn)錄因子MaMYB的表達(dá)載體。
3.如權(quán)利要求2所述的香蕉MYB轉(zhuǎn)錄因子MaMYB的表達(dá)載體，其特征在于:用權(quán)利要求I所述的香蕉MaMYB基因插入到植物表達(dá)載體Cam35S-gfp上，構(gòu)建成在CaMV35S啟動(dòng)子下游含有香蕉MaMYB基因的高效表達(dá)載 體。
全文摘要
本發(fā)明公開香蕉MYB轉(zhuǎn)錄因子MaMYB的克隆及表達(dá)載體構(gòu)建，提取香蕉“Musa spp.”總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模板，設(shè)計(jì)特異引物，利用PCR方法獲得MaMYB基因的全長cDNA，與pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆得到香蕉MaMYB基因，該基因的cDNA全長946bp,包括起始密碼子前的上游序列和多聚A尾巴。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定了果實(shí)發(fā)育不同階段MaMYB基因的表達(dá)水平，證實(shí)果皮光滑的野生型的表達(dá)水平明顯高于果皮有絨毛的突變體中的表達(dá)水平，連接到植物表達(dá)載體Cam35S-gfp上，構(gòu)建一個(gè)新的植物表達(dá)載體。該基因會(huì)影響香蕉果皮表皮毛發(fā)育。
文檔編號(hào)C12N15/29GK103214564SQ20131014118
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月23日
發(fā)明者徐立, 李志英, 黃碧蘭, 叢漢卿, 張俊芳, 李克烈 申請(qǐng)人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所