專利名稱：紅掌MYB轉(zhuǎn)錄因子AN2-like的克隆及表達載體構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及紅掌中MYB轉(zhuǎn)錄因子基因anthocyanin2_like (AN2_like)的克隆、重組及對花青素合成調(diào)控功能的分析和應用，屬于分子生物學和生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
MYB是植物轉(zhuǎn)錄因子中最大的家族之一，大多數(shù)植物的MYB以在其N端含有一段約51-52個氨基組成的MYB結(jié)構(gòu)域為共同特征。MYB蛋白的分類主要是根據(jù)這個高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域這個結(jié)構(gòu)域通常是由至多4個氨基酸殘基序列的重復(R)組成每一個都形成3個a-螺旋每一個重復的第二個和第三個螺旋形成一個帶有3個有規(guī)律的間隔色氨酸殘基(或疏水)的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(HTH)結(jié)構(gòu)，形成一個3D HTH疏水核心結(jié)構(gòu)，對維持HTH的構(gòu)型有極為重要的意義。MYB在擬南芥中已經(jīng)有很多報道，主要集中于次生代謝調(diào)節(jié)、抗逆性的研究等，具有廣泛的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，大多數(shù)MYB轉(zhuǎn)錄因子是基因表達的正調(diào)控因子，但是也有一部分是負調(diào)控因子?；ㄇ嗨叵嚓P(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子通常包含R2和R3兩個基序(R2R3-MYB)或包含I個R3基序(R3-MYB)，含有特異的DNA序列識別區(qū)和啟動子結(jié)合區(qū)。許多現(xiàn)象表明一些MYB轉(zhuǎn)錄因子有雙重功能，S卩:作為結(jié)構(gòu)基因的直接活化子和作為活化bHLH基因的活化子。迄今為止，研究發(fā)現(xiàn)花青素結(jié)構(gòu)基因調(diào)控的一般都是由MYB轉(zhuǎn)錄因子、bHLH轉(zhuǎn)錄因子和WD40蛋白形成一個蛋白復合體，直接調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，而不合成中間調(diào)控物。紅掌中AN2_like轉(zhuǎn)錄因子與其它作物MYB轉(zhuǎn)錄因子高度同源，氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)其具有兩個典型的SANT結(jié)構(gòu)域，其為“SWI3、ADA2、N-CoR和TFIIIB”的DNA結(jié)合域，一般為兩個串聯(lián)存在并通常結(jié)合于DNA端粒的序列重復部位，形成加帽結(jié)構(gòu)。其結(jié)合依賴于DNA序列上重復的G/C富集識 別序列[C2-3A(CA)l-6]。這種結(jié)構(gòu)通常存在于轉(zhuǎn)錄調(diào)控抑制因子復合體的結(jié)合DNA部位。本實驗中的AN2-like轉(zhuǎn)錄因子有可能為具有花青素合成負調(diào)控作用的MYB轉(zhuǎn)錄因子。紅掌花青素缺失的突變體中，植株表現(xiàn)為白色佛焰苞和綠色葉柄和幼葉，正常野生型應為紅色佛焰苞和淡紅色葉柄和幼葉。生物信息學分析和分子生物學實驗顯示其表達分析在突變體中顯著高于野生型。轉(zhuǎn)基因擬南芥植株表現(xiàn)為植株純綠色(尤其在幼苗期)，而正常野生型擬南芥莖桿和部分葉片通常帶有紅色。在本實驗中，相較于野生型，紅掌突變體中AN2_like特異性表達升高，造成轉(zhuǎn)基因擬南芥植株花青素缺失現(xiàn)象。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首次從紅掌中分離出AN2_like基因的全長cDNA。一、紅掌AN2基因的克隆以紅掌“阿拉巴馬”為材料，利用CTAB法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，設計全長cDNA擴增引物:
5 ’ 端引物:5 ’ TCACAAATTAGCACAGAGGTG3 ’3，端引物:5，GAGAGGAGTGTCTACGATGGT3 ’PCR體系及條件為:
權(quán)利要求
1.紅掌MYB轉(zhuǎn)錄因子AN2-like，其特征在于其核苷酸序列為:ACATGGGGGC GGTAATGGGC GAGAGGAGTG TCTACGATGG TAGGCGCGTGTGCGCCGCTA GTGAGAGAGA AGGGAGTCGTAGGAATAAGA AAGGGGGCATGGACTCCGGA GGAGGATCTA CTTCTCAGAG ACTGCGTCGA GAAGTACGGTGAAGGGAAGT GGCATCTCGC TCCAGCCAGG GCAGGTCTAA GACGTTGCCGAAAGAGTTGT CGGTTGCGGT GGCTGAACTA TCTCAAGCCC ACAATCAAGCGTGGGGAGTT TCAAGAGGAC GAAGTAGATC TCATAATCAG GCTCCATCGTCTTTTGGGGA ACAAGTGGTC ACTGATAGCA GGGAGAATTC CCGGTAGGACGGCAAATGAC ATCAAAAACT ATTGGAATGC CAGTTTAACC AAGAAGATAGCCCGTCATAA CCAGGAGGAA GAAAAGCTGC CAACTTGTGG TTCGTCTTCTCAGAAATCAT ATATGTGCGA GCAATATTGTTGCACACGCA ACATTGCAACATGTCCTCCA TCTGGTGCAA GATCCACTCTTTCGTCCTCT ATAGTCAAGCCTCAACCTCG AAGGATTTCG AAGAGACCCC TTAACTTGTG TAAGTTCAACTCAGGCAATG AAAGCAACGT GAGGGAGATG GCCAACATCG CATATAAGAAACGTGAGGAA GATTACAATT CATGGTGGAA GCATATGTTA GAAGACGATGGCACTATCCG ACAGCAAGAC CACAACCAAC AAGAAGAAGA AAAACAGCAGTTAGAAGAAT ATATCAACTT AGCTTGTGCC AATATAGAGG AGGAAGAAGAGTGGTTTACA AGCTTTTGGG GAGAGGGGATAGAAGTACAA AACAAACTTGTGGATGATAC TGCTGTGGAT TGGGAAGATC TACTTTCAAT GCAGAACCTCTTGGAGCTGT TATAGACTGT TCAAGTGAAA TGACCTTTGA GCAAAGTTCGGATCACCTCT GTGCTAATTT GTGAAATTTTCTGATCTTTG TTTGTCTATGCATATGCTTG AAATCTTTGG ATCTTTGATG TTTGATCTTA TGAATGTATGGACTATTTTT GTTTGTCTTT GATTAAAAGA TTGAAAATCT TTTTATATTTGTTTTGTTTG TGAAATTCTT TGAATTTCTTGGTTGATTAA CCCTTTTGTTAAGGGGGAGT GTATTTTTAT GTAAATACCA AGATATTTAT AAATGTGATTGTCATTCAGA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA0
2.包含權(quán)利要求1所述的紅掌MYB轉(zhuǎn)錄因子AN2-like的表達載體。
3.如權(quán)利要求2所述的紅掌MYB轉(zhuǎn)錄因子AN2-like的表達載體，其特征在于:用權(quán)利要求I所述的紅掌AN2基因插入到植物表達載體Cam35S-gfp上，構(gòu)建成在CaMV35S啟動子下游含有紅掌AN2基因的高效表達載體。
全文摘要
本發(fā)明公開紅掌MYB轉(zhuǎn)錄因子AN2-like基因及其植物表達載體構(gòu)建，提取紅掌“阿拉巴馬”總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模板，設計特異引物，利用PCR方法獲得AN2基因的全長cDNA，與pMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆得到紅掌AN2基因，該基因的cDNA全長1237bp,包括起始密碼子前的上游序列和多聚A尾巴。連接到植物表達載體Cam35S-gfp上，構(gòu)建一個新的植物表達載體，命名為Cam35S-an2。該基因與花青素合成調(diào)控有關(guān)。因此，AN2基因的獲得，為紅掌不同佛焰苞顏色品種的轉(zhuǎn)基因培育奠定了基礎(chǔ)，具有重要的理論及實踐意義。
文檔編號C12N15/29GK103215278SQ20131014089
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月23日
發(fā)明者徐立, 李志英, 叢漢卿, 李雪 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所