快速篩選硅酸鹽細(xì)菌的方法

快速篩選硅酸鹽細(xì)菌的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種快速篩選硅酸鹽細(xì)菌的方法，其包括以下步驟：（1）土壤菌懸液獲得；（2）富集培養(yǎng)，采用逐步提高鋁土礦添加量的方法對(duì)硅酸鹽細(xì)菌富集培養(yǎng)；（3）分篩培養(yǎng)，根據(jù)菌落長(zhǎng)出的時(shí)間以及菌落的形態(tài)，從培養(yǎng)基平板上挑出黏液狀凸起的透明菌落，進(jìn)行再培養(yǎng)，直到獲得純培養(yǎng)；（4）復(fù)篩。本發(fā)明采用逐步提高鋁土礦添加量的方法，使細(xì)菌更容易適應(yīng)硅酸鹽環(huán)境，從而富集到更多的硅酸鹽細(xì)菌。采用涂抹CaCO3粉末于平板表面的方法讓CaCO3不至沉淀平板底部，使篩選產(chǎn)酸菌可視化。培養(yǎng)基中微量添加的固體FeCl3改為用FeCl3溶液，使其更易被細(xì)菌利用。本發(fā)明為在實(shí)驗(yàn)室中快速篩選馴化硅酸鹽細(xì)菌提供了一種快速便捷的方法。
【專利說(shuō)明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種硅酸鹽細(xì)菌的篩選方法，特別是涉及一種在實(shí)驗(yàn)室中快速篩選硅 酸鹽細(xì)菌的方法。 快速篩選硅酸鹽細(xì)菌的方法

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著人們對(duì)礦產(chǎn)資源的大量開采，高品位、易選礦產(chǎn)資源日漸減少，同時(shí)環(huán)境保護(hù) 法規(guī)日趨嚴(yán)厲，一些傳統(tǒng)的礦產(chǎn)資源的開發(fā)方式已不適用于低品位的礦產(chǎn)資源。生物選礦 以對(duì)礦石品位要求不高、成本低、能耗少、生產(chǎn)流程簡(jiǎn)單、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)在礦產(chǎn)加工中 顯示出良好的應(yīng)用前景。生物選礦是通過(guò)微生物或其代謝產(chǎn)物與礦物的相互作用，從而脫 除礦石中的雜質(zhì)或回收其中的有價(jià)金屬的技術(shù)，利用微生物去除礦物中的雜質(zhì)硅的過(guò)程被 稱為生物脫硅。
[0003] 硅酸鹽細(xì)菌不是分類學(xué)上的命名，而是指的具有能分解硅酸鹽類礦物并釋放出 磷、鉀等元素的一類細(xì)菌。根據(jù)它的命名來(lái)由及分離方法，世界各地學(xué)者從不同的土壤中 分離出硅酸鹽細(xì)菌，并對(duì)它們的形態(tài)、生理生化鑒定及命名作了研究，對(duì)于硅酸鹽細(xì)菌在分 類中的命名一直存在很多的爭(zhēng)議。目前報(bào)道的種類主要有膠凍樣芽孢桿菌（或膠質(zhì)芽孢 桿菌）（Bacillus mucilaginosus)、環(huán)狀芽抱桿菌（Bacillus circulans)和土壤芽抱桿菌 (B. edaphicus)〇
[0004] 目前技術(shù)篩選硅酸鹽細(xì)菌方法為傳統(tǒng)的稀釋涂布方法：大致分為1. 土壤稀釋液 制備；2.涂布接種：按梯度稀釋的培養(yǎng)液接種到培養(yǎng)機(jī)上進(jìn)行恒溫培養(yǎng)；3.初次篩選：在 平板上挑取具有一定特征的菌落進(jìn)行純化；4復(fù)篩：進(jìn)行多次純化得到純培養(yǎng)。傳統(tǒng)方法中 初篩條件苛刻所得菌種種類少，復(fù)篩中對(duì)于產(chǎn)酸類優(yōu)勢(shì)硅酸鹽細(xì)菌沒有直觀可視性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種在實(shí)驗(yàn)室中快速篩選硅酸鹽細(xì)菌的方法。
[0006] 為達(dá)上述目的，本發(fā)明一種快速篩選硅酸鹽細(xì)菌的方法，包括以下步驟：
[0007] (1) 土壤菌懸液獲得：將鋁土礦樣加入到無(wú)菌水中，振蕩后靜置，取上清液加入到 液體無(wú)氮培養(yǎng)基中；
[0008] (2)富集培養(yǎng)：將步驟（1)中由液體無(wú)氮培養(yǎng)基培養(yǎng)所得菌種于液體無(wú)氮培養(yǎng)基 中進(jìn)行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，共轉(zhuǎn)接4次，轉(zhuǎn)接量按體積百分比計(jì)，每次培養(yǎng)液的10%接種于鋁土礦含 量逐漸增加的液體培養(yǎng)基中；
[0009] (3)分篩培養(yǎng)：將步驟（2)中的最后一次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)的培養(yǎng)液稀釋106_10 8倍后，涂 布于固體無(wú)氮培養(yǎng)基中，置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待平板表面不再有水滴時(shí)，倒置 平板，培養(yǎng)3-5天，隨時(shí)觀察細(xì)菌菌落生長(zhǎng)情況；根據(jù)菌落長(zhǎng)出的時(shí)間以及菌落的形態(tài)，從 培養(yǎng)基平板上挑出黏液狀凸起的透明菌落，進(jìn)行再培養(yǎng)，直到獲得純培養(yǎng)；
[0010] (4)復(fù)篩：將步驟（3)中得到的純菌種接種于液體含氮培養(yǎng)基中，能夠分解硅酸鹽 和鋁硅酸鹽組成的巖石礦物的細(xì)菌即為硅酸鹽細(xì)菌。鑒定方法為：用硅鑰藍(lán)法測(cè)定溶液中 娃含量。
[0011] 本發(fā)明的方法，其中優(yōu)選所述步驟（1)中的鋁土礦樣為伊利石粉末，過(guò)200目篩。
[0012] 本發(fā)明的方法，其中優(yōu)選所述步驟（2)中的液體無(wú)氮培養(yǎng)基含有：蔗糖3-5g， Na2HP04 2-4g 或 Na2HP04 · H20 5-10g，MgS04 · 7H20 0· 5-lg，CaC03 0· 1-0. 3g，鋁土礦 lg，水 1L，用硫酸調(diào)制溶解的重量百分?jǐn)?shù)為1%的FeCl3溶液2ml，培養(yǎng)基的pH值為6-7。
[0013] 本發(fā)明的方法，其中優(yōu)選所述步驟（2)中每次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)條件為置于30°C恒溫?fù)u床 上180rpm培養(yǎng)3天。
[0014] 本發(fā)明的方法，其中優(yōu)選所述步驟（2)中液體無(wú)氮培養(yǎng)基鋁土礦首次加入量為 200mg/L，之后以每次增加200mg/L的速度逐漸增加液體無(wú)氮培養(yǎng)基中錯(cuò)土礦的濃度。
[0015] 本發(fā)明的方法，其中優(yōu)選所述步驟（3)中固體無(wú)氮培養(yǎng)基含有：蔗糖3-5g，Na2HP0 4 2-4g 或 Na2HP04 · H20 5-10g，MgS04 · 7H20 0· 5-1. 0g，CaC03 0· 1-0. 3g，鋁土礦 lg，水 1L，用 硫酸調(diào)制溶解的重量百分?jǐn)?shù)為1%的FeCl3溶液2ml，CaC03粉末，lOg瓊脂，培養(yǎng)基的pH值 為 6-7。
[0016] 本發(fā)明的方法，其中優(yōu)選所述步驟（4)中液體含氮培養(yǎng)基含有：蔗糖3-5g，Na2HP0 4 2-4g 或 Na2HP04 · H20 5g，MgS04 · 7H20 0· 5-lg，（NH4) 2S03 1. 5-3. 8g，CaC03 0· 1-0. 3g，鋁土 礦lg，水1L，用硫酸調(diào)制溶解的重量百分?jǐn)?shù)為1%的FeCl3溶液2ml，培養(yǎng)基的pH值為6-7。
[0017] 本發(fā)明的方法，其中優(yōu)選所述固體無(wú)氮培養(yǎng)基中CaC03粉末為：先在研缽中研磨至 粉末，再過(guò)200目篩；之后將CaC0 3粉末在高壓滅菌鍋121°C，滅菌20min后，待用；等固體 培養(yǎng)基倒平板冷凝后，用玻璃棒粘取少許CaC0 3粉末，涂抹于平板表面。
[0018] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)不同之處在于，采用逐步提高液體無(wú)氮培養(yǎng)基中鋁土礦濃度的 方法，使細(xì)菌更容易適應(yīng)硅酸鹽環(huán)境，富集到更多的硅酸鹽細(xì)菌。采用涂抹CaC0 3粉末于平 板表面的方法讓CaC03不至沉淀平板底部，使篩選產(chǎn)酸菌可視化。培養(yǎng)基中微量添加的固體 FeCl3改為用FeCl3溶液，使其更易被細(xì)菌利用。本發(fā)明為在實(shí)驗(yàn)室中快速篩選馴化硅酸鹽 細(xì)菌提供了一種快速便捷的手段。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為Si02溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 以下結(jié)合實(shí)施例和試驗(yàn)數(shù)據(jù)，對(duì)本發(fā)明上述的和另外的技術(shù)特征和優(yōu)點(diǎn)作更詳細(xì) 的說(shuō)明。
[0021] 實(shí)施例1
[0022] ( 1)采集鋁土礦區(qū)(鋁土礦可采自于貴州省黔南布依族苗族自治州長(zhǎng)順縣長(zhǎng)寨鎮(zhèn)、 廣西壯族自治區(qū)南寧市橫縣云表鎮(zhèn)或廣西貴港市蒙公鄉(xiāng)）表層0-20cm 土壤作為樣品，4°C 冰箱保存。稱取供試土壤樣品l〇g，加入到l〇〇ml的無(wú)菌水中，用快速混勻器振蕩5min， 靜置lh，取上清液3ml加入到200mg/L伊利石的液體無(wú)氮培養(yǎng)基中，置于30°C恒溫?fù)u床 上180rpm富集培養(yǎng)3天。富集培養(yǎng)后移取第一次培養(yǎng)液10%的體積比例接入200mg/L伊 利石的液體培養(yǎng)基中，采用逐步提高鋁土礦濃度的方法對(duì)硅酸鹽細(xì)菌富集培養(yǎng)；每次增加 200mg/L的伊利石濃度，使最后伊利石濃度為lg/L，共轉(zhuǎn)接培養(yǎng)4次。
[0023] 其中，上述液體無(wú)氮培養(yǎng)基含有：蔗糖5g，Na2HP04 4g，MgS04 · 7H20 lg，CaC03 0. 3g，鋁土礦lg，水1L，用硫酸調(diào)制溶解的重量百分?jǐn)?shù)為1%的FeCl3溶液2ml，培養(yǎng)基的pH 值為6-7。
[0024] (2)將上述富集培養(yǎng)液(即經(jīng)4次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后得到的培養(yǎng)液)在無(wú)菌條件下用無(wú)菌 水稀釋10 6-108倍后，分別涂布于固體無(wú)氮培養(yǎng)基中，置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待平 板表面不再有水滴時(shí)，倒置平板，培養(yǎng)3-5天，隨時(shí)觀察細(xì)菌菌落生長(zhǎng)情況；根據(jù)菌落長(zhǎng)出 的時(shí)間以及菌落的形態(tài)，從培養(yǎng)基平板上挑出黏液狀凸起的透明菌落，進(jìn)行再培養(yǎng)，直到獲 得純培養(yǎng)。
[0025] 其中固體無(wú)氮培養(yǎng)基含有：蔗糖 5g，Na2HP04 · H20 5g，MgS04 · 7H20 1. 0g，CaC03 0. lg，鋁土礦lg，水1L，用硫酸調(diào)制溶解的重量百分?jǐn)?shù)為1%的FeCl3溶液2ml，CaC03粉末， l〇g瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為6-7。CaC03粉末先在研缽中研磨至粉末，再過(guò)200目篩；之后將 CaC03粉末在高壓滅菌鍋121°C，滅菌20min后，待用；等固體培養(yǎng)基倒平板冷凝后，用玻璃 棒粘取少許CaC0 3粉末，涂抹于平板表面。
[0026] (3)將得到純菌種分別按1%的體積比接種于100ml含氮液體培養(yǎng)基中，每隔24h 用硅鑰藍(lán)法(本領(lǐng)域常規(guī)方法）測(cè)一次溶液中硅濃度。
[0027] 其中液體含氮培養(yǎng)基含有：蔗糖 3g，Na2HP04 2g，MgS04 · 7H20 lg，（NH4) 2S03 3. 8g， CaC03 0. 2g，鋁土礦lg，水1L，用硫酸調(diào)制溶解的重量百分?jǐn)?shù)為1%的FeCl3溶液2ml，培養(yǎng) 基的pH值為6-7。
[0028] (4)以《中華人民共和國(guó)城鎮(zhèn)建設(shè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)：城市供水二氧化硅的測(cè)定硅鑰藍(lán)分 光光度法》為參考測(cè)定溶液中Si0 2含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。
[0029] 取脫硅后溶液1ml，稀釋50倍，測(cè)量其吸光值最高達(dá)到1. 241。由測(cè)得數(shù)據(jù)計(jì)算可 知，溶液中Si02的含量最高達(dá)到68. 82mg/L。
[0030] (5)通過(guò)對(duì)此細(xì)菌的形態(tài)特征觀察：其在固體無(wú)氮培養(yǎng)基的平板上長(zhǎng)出菌落為無(wú) 色透明凸起度大，像半顆玻璃珠，菌落表面濕潤(rùn)而光滑，質(zhì)地粘稠并有彈性。進(jìn)一步用掃描 定鏡觀察細(xì)菌形態(tài)，觀察到細(xì)菌菌體長(zhǎng)桿形，兩端鈍圓，一般大小為4?7微米XI?1.2 微米，無(wú)鞭毛。
[0031] (6)對(duì)篩選所得菌株對(duì)不同的含鉀礦物表現(xiàn)出不同的分解能力，在同樣培養(yǎng)條件 下，分別以鉀長(zhǎng)石和白云母為唯一鉀源，接菌處理比接滅活菌對(duì)照溶液中的鉀含量分別增 加67. 4%和54. 5%。用原子吸收光譜分析和高效液相色譜，對(duì)硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)液中的產(chǎn)物 進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，這種硅酸鹽細(xì)菌具有分解玻璃中鉀的能力。在搖瓶培養(yǎng)72小時(shí)后， 水溶性鉀的含量比對(duì)照物提高了 55%。這就證明了此株硅酸鹽細(xì)菌的確具有解鉀的性能。
[0032] 以上所述的實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范 圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方 案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種快速篩選硅酸鹽細(xì)菌的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 土壤菌懸液獲得：將鋁土礦粉末加入到無(wú)菌水中，振蕩后靜置，取上清液加入到液 體無(wú)氮培養(yǎng)基中； (2) 富集培養(yǎng)：將步驟（1)中由液體無(wú)氮培養(yǎng)基培養(yǎng)所得菌種于液體無(wú)氮培養(yǎng)基中進(jìn) 行轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，共轉(zhuǎn)接4次，轉(zhuǎn)接量按體積百分比計(jì)，每次培養(yǎng)液的10%接種于鋁土礦添加量 逐漸增加的液體無(wú)氮培養(yǎng)基中； (3) 分篩培養(yǎng)：將步驟（2)中的最后一次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)的培養(yǎng)液稀釋106-108倍后，涂布于 固體無(wú)氮培養(yǎng)基中，置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待固體無(wú)氮培養(yǎng)基平板表面不再有 水滴時(shí)，倒置平板，培養(yǎng)3-5天，隨時(shí)觀察細(xì)菌菌落生長(zhǎng)情況；根據(jù)菌落長(zhǎng)出的時(shí)間以及菌 落的形態(tài)，從培養(yǎng)基平板上挑出黏液狀凸起的透明菌落，進(jìn)行再培養(yǎng)，直到獲得純培養(yǎng)； (4) 復(fù)篩：將步驟（3)中得到的純菌種接種于液體含氮培養(yǎng)基中，能夠分解硅酸鹽和鋁 硅酸鹽組成的巖石礦物的細(xì)菌即為硅酸鹽細(xì)菌。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（1)中的鋁土礦粉末為伊利石粉 末，過(guò)200目篩。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（2)中的液體無(wú)氮培養(yǎng)基含有： 蔗糖 3-5g，Na2HP04 2-4g 或 Na2HP04 · H20 5-10g，MgS04 · 7H20 0· 5-1. 0g，CaC03 0· 1-0. 3g， 鋁土礦lg，水1L，用硫酸調(diào)制溶解的重量百分?jǐn)?shù)為1%的FeCl3溶液2ml，培養(yǎng)基的pH值為 6-7。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（2)中每次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)條件為置于 30°C恒溫?fù)u床上180rpm培養(yǎng)3天。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（2)中液體無(wú)氮培養(yǎng)基中鋁土礦 首次加入量為200mg/L,之后每次增加量為200mg/L。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（3)中固體無(wú)氮培養(yǎng)基含有：蔗 糖 3-5g，Na2HP04 2-4g 或 Na2HP04.H20 5-10g，MgS04.7H20 0.5-1.0g，CaC03 0.1-0.3g，鋁土 礦lg，水1L，用硫酸調(diào)制溶解的重量百分?jǐn)?shù)為1%的FeCl3溶液2ml，CaC0 3粉末，lOg瓊脂， 培養(yǎng)基的pH值為6-7。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：所述固體無(wú)氮培養(yǎng)基中CaC03粉末為：先 在研缽中研磨至粉末，再過(guò)200目篩；之后將CaC0 3粉末在高壓滅菌鍋121°C，滅菌20min 后，待用；等固體培養(yǎng)基倒平板冷凝后，用玻璃棒粘取少許CaC03粉末，涂抹于平板表面。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟（4)中液體含氮培養(yǎng)基含有：蔗 糖 3-5g，Na2HP04 2-4g 或 Na2HP04 · H20 5g，MgS04 · 7H20 0· 5-lg，（NH4) 2S03 1. 5-3. 8g，CaC03 0. 1-0. 3g，鋁土礦lg，水1L，用硫酸調(diào)制溶解的重量百分?jǐn)?shù)為1%的FeCl3溶液2ml，培養(yǎng)基 的pH值為6-7。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104109641SQ201310138722
【公開日】2014年10月22日 申請(qǐng)日期:2013年4月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月19日
【發(fā)明者】趙恒勤, 賀治國(guó), 張耀, 胡四春, 王龍 申請(qǐng)人:中國(guó)地質(zhì)科學(xué)院鄭州礦產(chǎn)綜合利用研究所, 中南大學(xué)